Cellules souches mésenchymateuses marquées par des nanoparticules au bleu de Prusse :évaluation de la viabilité cellulaire, de la prolifération, de la migration, de la différenciation, du cytosquelette et de l'expression des protéines in vitro

Contexte

Les cellules souches mésenchymateuses, un type de cellule souche adulte, ont un potentiel anti-inflammatoire et régénératif et peuvent migrer dans les tissus lésés pour aider à la récupération des fonctions endommagées [1]. Ils peuvent se différencier en plusieurs types de cellules dans un microenvironnement spécifique et sont facilement collectés à partir de tissus adultes et fœtaux [2]. Ainsi, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été utilisées pour la médecine régénérative et la thérapie oncologique comme un outil prometteur en raison de ces excellentes propriétés [3, 4]. Cependant, le sort des CSM après transplantation dans le corps reste incertain, et un suivi non invasif des CSM est nécessaire in vivo pour évaluer l'efficacité de la transplantation et leur devenir, leurs propriétés et leur localisation [5]. Récemment, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) en tant que technologie efficace a été largement utilisée pour rechercher des informations structurelles et fonctionnelles sur les cellules souches mésenchymateuses in vitro et in vivo [6].

Au cours des dernières années, plusieurs nanoparticules ont été utilisées pour marquer les CSM en tant qu'outil prometteur pour l'imagerie non invasive des cellules afin d'enregistrer leurs distributions et leur devenir in vivo et in vitro, et même utilisées pour le traitement des tumeurs [7]. Par exemple, les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétique (SPIO) et les points quantiques (QD) sont utilisés pour marquer les cellules depuis de nombreuses années [8, 9]. Et des nanoparticules magnétiques fluorescentes (FMNP) ont été utilisées pour marquer les CSM afin de réaliser l'imagerie ciblée et la thérapie synergique des cellules cancéreuses gastriques in vivo [10]. Pour ces nouveaux marqueurs, une analyse minutieuse et complète de la toxicité cellulaire est nécessaire car tout a une dose toxique et peut perturber la fonction cellulaire en aval [11]. Par exemple, les nanoparticules d'oxyde de fer de contraste IRM ont été attribuées à la génération de ROS et peuvent provoquer la mort cellulaire [12].

Récemment, il a été démontré que les nanoparticules de bleu de Prusse (PBNP) ont le potentiel d'être un agent de contraste pour l'IRM [13,14,15]. Le bleu de Prusse, considéré comme un médicament pratique, économique, sûr et respectueux de l'environnement, a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis en clinique pour traiter l'exposition radioactive. Il est important de noter que les PBNP étaient hautement dispersibles et stables dans l'eau et dans des environnements d'imitation biologique tels que le sérum sanguin sans apparition d'agrégation en 1 semaine [16], et ont une bonne stabilité photothermique qui pourrait réutiliser les PBNP lors d'applications pratiques [17]. Par exemple, Liang et al. [13] ont d'abord démontré que les PBNP à forte absorption dans la région NIR peuvent être utilisés comme un excellent agent de contraste pour améliorer l'imagerie photoacoustique. Les PBNP avec une taille uniforme et une bonne stabilité colloïdale peuvent être fabriqués à partir d'agents chimiques à faible coût de manière simple.

Les PBNP ont été utilisés pour marquer certaines cellules tumorales en tant qu'agent d'IRM dans la recherche [18], mais peu d'études ont été rapportées sur l'application des PBNP dans les CSM. Nous rapportons ici que les cellules souches mésenchymateuses marquées au PBNP présentaient une viabilité cellulaire normale, une prolifération, une migration, un cytosquelette, une différenciation et une expression protéique in vitro. Des travaux supplémentaires sont nécessaires s'il s'agit d'une réalité in vivo et pour s'assurer que l'administration intralésionnelle dirigée de CSM marquées au PBNP est aussi critique que le pense le suivi cellulaire.

Méthodes

Culture cellulaire

Les souris MSC C3H10T1/2 ont été obtenues auprès de Nanjing KeyGen Biotech. Inc. Les cellules ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ; Hyclone, USA) additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (FBS ; Israël) et de 1 % de pénicilline-streptomycine (Hyclone, USA) à 37 °C avec 5 % de CO₂ saturation, et le milieu a été changé tous les 3 jours. Après quatre passages, les cellules ont été utilisées pour des expériences.

Préparation des PBNP

Dans une synthèse typique, 2,5 mmol d'acide citrique (490 mg) ont d'abord été ajoutés à une solution aqueuse de FeCl₃ de 20 mL à 1,0 mM. solution sous agitation à 60 °C. À cette solution a été ajouté goutte à goutte une solution aqueuse de 20 mL 1,0 mM de K₄ [Fe(CN)₆ ] solution contenant 0,5 mmol d'acide citrique (98 mg) à 60 °C. Une dispersion bleu clair clair s'est formée immédiatement. Après 30 min, la solution a été laissée à refroidir à température ambiante avec l'agitation poursuivie pendant encore 5 min à température ambiante. Ensuite, un volume égal d'alcool éthylique a été ajouté à la dispersion et centrifugé à 10 000 tr/min pendant 20 min pour entraîner la formation d'un culot de nanoparticules. Ce dernier a été séparé à nouveau par l'ajout d'un volume égal d'alcool éthylique et centrifugation.

Caractérisation des PBNP

La spectroscopie infrarouge des PBNP synthétisés a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre infrarouge (IR; Thermo Fisher Nicolet IS10). La morphologie des PBNP synthétisés a été examinée par microscopie électronique à transmission (MET; JEM 2100F). La magnétisation dépendante du champ des PBNP a été étudiée à l'aide d'un magnétomètre à échantillon vibrant (VSM; Lakeshore 7307). L'analyse par diffraction des rayons X (XRD) a été réalisée à l'aide de Bruker D8 ADVANCE A25X (XRD). L'indice de polydispéristie des PBNP a été déterminé par Zetasizer Nano ZS.

Distributions intracellulaires de PBNP et ultrastructure des cellules C3H10T1/2 marquées

La microscopie électronique à transmission (MET) a été réalisée pour évaluer les distributions intracellulaires des PBNP. Après élimination du milieu, les cellules ont été rincées avec du PBS puis digérées avec 0,25% de trypsine. Ensuite, les cellules ont été transférées dans un tube EP de 1,5 ml pour être centrifugées (2000 tr/min, 5 min). Ensuite, le surnageant a été éliminé et les cellules ont été fixées par 0,25% de glutaraldéhyde et 1% d'acide osmium. Une fois les cellules rincées à nouveau, les cellules ont été déshydratées dans 50 % d'éthanol, 70 % d'éthanol, 90 % d'éthanol, 90 % d'acétone et 100 % d'acétone pendant 20 min chacune. Ensuite, les cellules ont été incrustées à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, une double coloration à 3% d'acétate d'uranium-citrate en coupes a été réalisée. Enfin, les images ont été collectées par TEM.

La microscopie électronique à balayage (MEB) a été effectuée pour évaluer l'ultrastructure des cellules C3H10T1/2 marquées. Une fois le milieu retiré, les cellules ont été rincées avec du PBS et fixées avec du glutaraldéhyde à 3 % en prérefroidissant à 4 °C pendant une nuit. Ensuite, les cellules ont été rincées deux fois avec du PBS et fixées avec de l'acide osmique à 1 % à 4 °C pendant 1 h. Après que les cellules C3H10T1/2 aient été rincées à nouveau, les cellules ont été déshydratées dans des alcools de grade ascendant (30 % d'éthanol, 50 % d'éthanol, 70 % d'éthanol, 80 % d'éthanol, 90 % d'éthanol, 95 % d'éthanol et 100 % d'éthanol) pendant 2 × 10 minutes chacun. Ensuite, les cellules ont été immergées dans une solution d'acétonitrile à 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 % pendant 15 min chacune. Ensuite, un séchage sous vide et un revêtement d'or par pulvérisation ont été effectués. Enfin, les images ont été collectées par SEM.

Analyses de viabilité cellulaire des PBNP

La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide du MTT (Sigma, USA). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à 1 × 10 ³ cellules par puits à 37 °C avec 5 % de CO₂ atmosphère. Après incubation pendant la nuit, le milieu de culture a été remplacé par 100 μL de milieu frais contenant différentes concentrations de PBNP (0, 5, 10, 20, 40 et 80 μg/mL), puis les cellules ont été cultivées pendant 1 à 3 jours supplémentaires. Le milieu de culture a été retiré et les cellules ont été incubées avec 20 μL de MTT (5 mg/mL) à 37 °C pendant 4 h. Les cristaux de colorant violet précipités ont été dissous dans 150 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO ; Sigma-Aldrich, États-Unis) pendant 10 min en secouant doucement. La valeur de la densité optique (DO) a été mesurée à une longueur d'onde de 490 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. Les résultats des cellules ont été exprimés en pourcentage de cellules viables.

Test de prolifération

Comparativement au MTT, MTS, WST-1 et XTT, le RTCA permet l'analyse de toute la période de l'expérience et ne nécessite pas le marquage qui affecte négativement les expériences de culture cellulaire [19]. Ainsi, le système xCELLigence (Roche/ACEA Biosciences) a été utilisé pour mesurer la prolifération cellulaire en temps réel. En bref, les cellules ont été ensemencées dans E-Plate-16 (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, USA) à 5 × 10 ³ cellules par puits avec 150 μL de milieu complet. Après 24 h de croissance, le milieu a été remplacé par un milieu frais contenant diverses concentrations de PBNP et incubé pendant 96 h supplémentaires. Ce système a mesuré l'impédance électrique, qui a été créée par la fixation des cellules sur les plaques de culture cellulaire intégrées aux microélectrodes [20], pour fournir des informations quantitatives sur le nombre de cellules et la viabilité en temps réel par l'instrument RTCA-DP [21]. La prolifération cellulaire a été mesurée périodiquement toutes les 15 minutes pendant les 4 jours suivants.

Surveillance en temps réel de la migration cellulaire

La migration cellulaire C3H10T1/2 a été mesurée à l'aide d'un système de test d'invasion et de migration cellulaires en temps réel (RT-CIM) (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, USA). Les cellules ont la capacité d'augmenter l'impédance jusqu'aux lectures « Cell Index » lorsqu'elles entrent en contact et adhèrent aux capteurs en raison de la migration des cellules de la chambre supérieure vers la chambre inférieure à travers la membrane. Simplement, les cellules ont été ensemencées dans la chambre supérieure à une densité de 4 ×  10 ⁴ par puits en milieu sans sérum en présence de diverses concentrations de PBNP. Les chambres inférieures des plaques CIM ont été remplies de 165 μL de milieu complet contenant 10 % de FBS. La migration cellulaire a été surveillée par un instrument RTCA DP toutes les 10 minutes pendant une période de 100 heures. L'indice cellulaire (IC) a été utilisé pour refléter les résultats. La valeur de CI a été dérivée du changement d'impédance électrique lorsque les cellules vivantes interagissent avec la surface de la microélectrode biocompatible dans le puits de la microplaque pour mesurer efficacement le nombre, la forme et l'adhérence des cellules. Plus le nombre de cellules migrées est élevé, plus l'indice de cellule est grand.

Enquête sur la migration cellulaire via le test Transwell

Après avoir été cultivées avec différentes concentrations de PBNP pendant 48 h, les cellules avec une densité de 2 × 10 ⁶ cellule/cm ² ont été cultivés dans une chambre Transwell (taille de pores de 8 μm ; BD FalconTM, USA) pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO₂ . Après la culture, la chambre interne a été nettoyée et les cellules migrées au fond de la chambre ont été fixées et colorées avec 0,1% de violet cristal. Chaque étape a été suivie d'un lavage avec du PBS pendant 5 minutes trois fois. Les cellules migrées ont été photographiées dans différents champs de vision à l'aide d'un microscope à contraste de phase inversé (CK2, Olympus, Japon).

Différence de cellule in vitro

Des PBNP marqués ou non marqués par des cellules C3H10T1/2 ont été induits à se différencier en deux lignées cellulaires en aval d'adipocytes ou d'ostéocytes. Une fois que les cellules ont atteint la confluence dans une plaque à six puits, les cellules ont été cultivées dans un milieu d'induction ostéogénique (10 % FBS/DMEM contenant 10 nM de dexaméthasone, 50 μM d'acide ascorbique, 10 mM de β-glycérophosphate, Sigma) ou un milieu d'induction adipogène (10 % FBS/DMEM contenant 1 μM de dexaméthasone, 0,5 mM d'isobutylméthylxanthine, 10 μM d'insuline, Sigma). Après 3 semaines, les cellules ont été lavées avec du PBS, fixées avec du polyoxyméthylène à 4 % et colorées avec du rouge alizarine ou du rouge huile O (Sigma). Les cellules induites ont été photographiées dans différents champs de vision à l'aide d'un microscope à contraste de phase inversé (CK2, Olympus, Japon).

Test d'immunofluorescence pour la visualisation de l'actine F

Les CSM ont été cultivées avec diverses concentrations de PBNP dans une plaque à 24 puits pendant 48 h. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min, perméabilisées avec du Triton-100 à 0,2 % pendant 5 min, bloquées avec du BSA à 1 % dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, puis cultivées avec de la phalloidine (1 : 100, Thermo Fisher Scientific , USA) et DAPI (1:800, Thermo Fisher Scientific, USA) pendant 30 min à température ambiante. La microscopie à fluorescence a été réalisée sur un microscope Nikon eclipse Ti-S avec le logiciel NIS elements

Expression des protéines par analyse Western Blot

L'expression protéique des cellules a été évaluée par analyse Western blot. Les CSM ont été cultivées avec le milieu contenant différentes concentrations de PBNP (0, 25, 50 μg/mL) sur des plaques à six puits pendant 24 h, lavées deux fois avec du PBS glacé et grattées dans 100 μl de tampon PIPA (Beyotime) contenant inhibiteurs de protéase et orthovanadate de sodium (Beyotime, Chine). Après 30 min, les échantillons ont été centrifugés à 14 000 rpm pendant 10 min à 4 °C, puis les concentrations en protéines des échantillons ont été déterminées à l'aide du kit BCA (Beyotime, Chine). La même quantité de protéines a été soumise à une électrophorèse dans des gels SDS-PAGE à 10 % (Beyotime, Chine) et transférée sur membrane PVDF (GE Healthcare). Les membranes ont été bloquées avec du lait à 5% dans une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween20 (TBST) à température ambiante pendant 2 h puis incubées avec de l'anti-β-caténine (1 :1000, CST, USA), anti-vimentine (1 :1000 , Abiocode) et anti-β-actine (1:1000, CST, USA) pendant une nuit à 4 °C. Les membranes ont été lavées trois fois pendant 5 minutes chacune, puis incubées avec les anticorps secondaires appropriés pendant 2 heures à température ambiante. Les signaux ont été détectés avec ECL et ECL-plus (Beyotime, Chine) et exposés au système Molecular Image® ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad Inc., États-Unis) avec le logiciel Image Lab™ en utilisant la chimiluminescence améliorée.

Enquête par imagerie cellulaire sur l'efficacité du marquage cellulaire par IRM

Les CSM ont été traitées avec différentes concentrations (25 et 50 μg/mL) de PBNP, et les cellules témoins ont été cultivées avec un milieu complet sans PBNP pendant 48 h, lavées trois fois avec du tampon PBS, trypsinisées, collectées, puis incluses dans 1 mL 1 % (w /v ) solution d'agarose pour les études d'imagerie. De plus, les CSM marquées avec 50 μg/mL de PBNP ont été induites à une différenciation ostéogénique pendant 14 jours, puis ont été examinées l'effet du signal IRM. L'imagerie pondérée en T2 a été réalisée à l'aide d'une séquence d'écho de gradient de récupération d'inversion avec TE = 23 ms, TR = 400 ms, NEX = 2.0, une épaisseur de coupe de 2 cm, un FOV de 20 × 20 cm et une taille de matrice de 384 × 256.

Analyse statistique

Les résultats ont été exprimés sous forme de moyenne  ± SD d'au moins trois expériences indépendantes réalisées en triple. Les groupes de traitement ont été comparés à l'aide d'une analyse de variance à un facteur (ANOVA) et du t de Student test a été utilisé. p < 0,05 a été accepté comme une différence significative.

Résultats et discussion

Caractérisation PBNP

La microscopie électronique à transmission (MET) a été réalisée pour caractériser les PBNP (Fig. 1a), qui ont un diamètre de 20 à 25 nm. Pour la morphologie, les PBNPs ont montré une structure cuboïde. La figure 1b montre la spectroscopie infrarouge des PBNP synthétisés. Les PBNP présentaient un pic d'absorption typique de Fe ³⁺ -CN vers 2085,23 nm, ce qui était en accord avec celui des PBNP. La mesure de la magnétisation dépendante du champ a également été utilisée pour étudier les propriétés magnétiques des PBNP. La figure 1c montre les courbes de magnétisation des PBNP à température ambiante, qui ont démontré le superparamagnétisme des PBNP. La figure 1d montre les pics de diffraction à 200, 220, 400 et 420, qui corroborent le schéma XRD des PBNP. De plus, l'indice de polydispéristie des PBNP était de 0,16, ce qui indiquait une distribution uniforme de la taille des particules.

Caractérisation du PBNP. un Morphologie des PBNPs. b Spectres d'absorbance UV-vis des PBNP. c Aimantation dépendante du champ des PBNP. d Modèle XRD des PBNP

Captation cellulaire et cytotoxicité des PBNP

Pour confirmer davantage l'absorption cellulaire des PBNP aux MSC, la micromorphologie cellulaire des cellules C3H10T1/2 ci-dessus traitées avec et sans les PBNP a été étudiée. La figure 2 montre des images SEM et TEM de cellules C3H10T1/2 après l'incubation pendant 48 h avec et sans les PBNP. D'après les images SEM, l'ultrastructure des cellules C3H10T1/2 marquées n'a pas eu de changements évidents par rapport aux cellules C3H10T1/2 de contrôle. D'après les images TEM, les cellules C3H10T1/2 témoins sans incubation avec les PBNP présentaient une micromorphologie cellulaire typique avec des microstructures cellulaires évidentes. Pourtant, après incubation avec les PBNPs, une distribution aléatoire des PBNPs a été clairement observée dans le cytoplasme des cellules C3H10T1/2. Et certains PBNP semblaient être localisés dans des vésicules à l'intérieur du cytoplasme des cellules. Bien que la distribution aléatoire des PBNP ait été observée dans le cytoplasme des cellules C3H10T1/2, le mécanisme exact de l'absorption intracellulaire n'était pas clair. Nous proposons que l'internalisation des PBNP dans les cellules C3H10T1/2 puisse se produire via un mécanisme similaire à celui démontré par l'étude précédente, qui avait rapporté que différentes nanoparticules inorganiques, y compris le bleu de Prusse-Poly (l-lysine), l'or, l'argent et les oxydes métalliques peuvent être facilement absorbé par les cellules par endocytose [15, 22, 23].

Images SEM et MET des cellules C3H10T1/2 après incubation avec différentes concentrations de PBNP pendant 48 h. un Images SEM. b images TEM. ↑, PBNP distribués intracellulairement

Pour évaluer la cytotoxicité et le test de viabilité cellulaire dans les CSM, la méthode MTT a été réalisée. Les cellules ont été incubées pendant 1 à 3 jours à 37 °C sous 5% de CO₂ avec diverses concentrations de PBNP en suspension dans du DMEM. Trois essais indépendants ont été menés, et les moyennes et les écarts types ont été rapportés. La figure 3 montre que la viabilité des CSM traitées avec des PBNP (5, 10, 20, 40, 80 μg/mL) était relative aux cellules témoins à 24 à 72 h, respectivement. Les résultats ont indiqué que les PBNP n'étaient pas toxiques pour les cellules traitées avec la même quantité de PBNP que le MTT. En outre, un essai de prolifération en temps réel utilisant l'instrument xCELLigence a été utilisé pour étudier les courbes de croissance des CSM. Les résultats ont montré que les courbes de croissance des CSM n'étaient pas significativement influencées par ces concentrations de PBNP (Fig. 4a), et les viabilités cellulaires ont été comptées et montrées sur la Fig. 4b après traitement en 24, 48, 72 et 96 h. Ces résultats suggèrent que les PBNP n'ont aucun effet sur la prolifération des MSC.

La viabilité des cellules C3H10T1/2 en présence de diverses quantités de PBNP, telle que déterminée par la méthode MTT

La prolifération des cellules C3H10T1/2 en présence de diverses quantités de PBNP comme déterminé par dosage RT-CIM. un Les courbes de croissance des cellules C3H10T1/2. b Les viabilités cellulaires des cellules C3H10T1/2 après traitement en 24, 48, 72 et 96 h

Capacité de migration cellulaire

La migration des CSM traitées avec diverses concentrations de PBNP a été testée à l'aide du test Transwell et d'une nouvelle technique, le système de test RT-CIM. D'après le test Transwell, les cellules marquées n'ont montré aucun changement évident dans la migration. En utilisant le système de dosage RT-CIM, la migration cellulaire était surveillée en temps réel, ce qui reflétait des données plus précises et pouvait prédire la capacité de migration cellulaire avec plus de précision. A partir du système de dosage RT-CIM, bien qu'au début du marquage, les cellules marquées ont migré lentement que les cellules non marquées. Mais à 72 et 96 h, il n'y avait pas de différence significative dans la migration cellulaire entre les cellules marquées et les cellules non marquées, ce qui indique que des concentrations élevées de PBNP n'affectent pas la motilité des MSC (Fig. 5).

La migration des cellules C3H10T1/2 en présence de diverses quantités de PBNPs. un La migration des cellules C3H10T1/2 déterminée par dosage RT-CIM. b L'indice cellulaire des cellules C3H10T1/2 après traitement en 12, 24, 48, 72 et 96 h. c La migration des cellules C3H10T1/2 déterminée par test Transwell (grossissement × 200)

Différence de cellule in vitro

La pluripotence des CSM marquées et non marquées a été étudiée par coloration au rouge alizarine et au rouge huile O. La figure 6 montre que les MSC marquées peuvent être différenciées avec succès en adipocytes et en ostéocytes, comme l'ont fait les MSC non marquées. Ces résultats suggèrent que les PBNP n'ont pas interféré avec la capacité de différenciation des cellules, ce qui a maintenu la pluripotence des MSC marquées.

Différenciation cellulaire in vitro de cellules avec ou sans PBNP. Coloration Oil Red O pour les adipocytes et Coloration Alizarine Red pour les ostéocytes. Les images ont été obtenues 3 semaines après l'étiquetage (grossissement × 200)

Influence de l'étiquetage des PBNPs sur le cytosquelette

Pour étudier l'effet des PBNP sur le cytosquelette des CSM, un test d'immunofluorescence de l'actine F a été utilisé. La coloration à la phalloïdine ne montre aucune altération des filaments d'actine rouge du cytosquelette après marquage pendant 48 h par rapport aux CSM non marquées. Une comparaison de l'intégrité et de la distribution des filaments d'actine dans les cellules marquées et non marquées pendant 48 h n'a révélé aucune altération (Fig. 7).

Immunofluorescence de cellules C3H10T1/2 en présence de différentes quantités de PBNP pendant 48 h (grossissement × 400). , cytosquelette

Analyse Western Blot

Les voies de signalisation Wnt jouent un rôle important dans la régulation de la prolifération, de la différenciation, de l'apoptose, de la formation des tissus et du destin des cellules souches [24]. Ainsi, la -caténine est la protéine fonctionnelle des CSM. De plus, la vimentine est le biomarqueur mésenchymateux et est également la protéine fonctionnelle des CSM [25]. Ces deux protéines sont liées à la fonction biologique des MSC. Les expressions de la -caténine et de la vimentine ont été évaluées par analyse Western blot. La figure 8 montre que l'expression de la -caténine et de la vimentine des CSM traitées avec diverses concentrations de PBNP pendant 48 h n'a eu aucun changement significatif par rapport à l'expression des CSM traitées sans PBNP. Ces résultats ont indiqué que les PBNP ne peuvent pas modifier l'expression de la -caténine et de la vimentine des MSC, ce qui a montré la stabilité de la fonction biologique des MSC après traitement avec les PBNP.

Le Western blot montre l'expression de la -caténine et de la vimentine des CSM traitées avec et sans PBNP pendant 48 h. Le niveau de -caténine et de vimentine a été quantifié par le logiciel ImageJ

IRM in vitro

Les CSM, comme les autres cellules souches, ont le potentiel de différencier les cellules osseuses, cartilagineuses, graisseuses, musculaires et cardiaques, qui sont devenues une source importante pour la médecine régénérative. Et le suivi de la migration et du résultat des MSC est si important pour évaluer le rôle et le résultat des MSC exogènes dans la réparation des défauts. L'imagerie par résonance magnétique (IRM) a permis d'observer les CSM après administration clinique, et un agent de contraste IRM est nécessaire. Le potentiel des PBNP utilisés comme agent de contraste IRM cellulaire pondéré en T2 efficace a été démontré [14], et certaines autres études ont également démontré que la modification de surface des PBNP améliore ses performances en IRM [17, 26]. Actuellement, le marquage PBNP a été utilisé dans une variété de cellules. Dumont et al. ont décrit les PBNP comme agents pour l'IRM et l'imagerie par fluorescence des tumeurs cérébrales pédiatriques [27]; Perera et al. ont développé les PBNP incorporés au gadolinium pour la détection précoce des tumeurs du tractus gastro-intestinal [28]; et Cano-Mejia et al. combiné thérapie photothermique (PTT) à base de nanoparticules de bleu de Prusse (PBNP) avec inhibition du point de contrôle anti-CTLA-4 pour traiter le neuroblastome [29]. Cependant, il existe rarement des rapports connexes sur les CSM marquées au PBNP. De plus, l'existence d'une influence négative sur la fonction cellulaire et la viabilité des CSM après le marquage des PBNP reste incertaine

Pour déterminer si les PBNP ont la capacité d'améliorer le contraste IRM pondéré en T2 des cellules, nous avons incubé les MSC avec ou sans PBNP et examiné l'effet du signal IRM. Pour surveiller la stabilité temporelle du marquage et déterminer si les PBNP perdraient leur capacité d'imagerie lorsque les MSC se différenciaient, nous avons incubé les MSC avec des PBNP et induit les MSC à une différenciation ostéogénique pendant 14 jours, puis examiné l'effet du signal IRM. Comme le montre la figure 9, les pastilles des MSC incubées avec des PBNP ont montré un effet d'obscurcissement du signal IRM clair et la valeur SI des MSC marquées présentait une différence évidente avec les MSC non marquées. Notamment, les MSC marquées ont également montré un effet d'assombrissement clair du signal IRM lorsque la différenciation est induite. Ces résultats ont démontré que les PBNP avaient le potentiel d'être utilisés comme agent de contraste T2 efficace pour l'imagerie cellulaire des CSM et peuvent offrir une rétention à long terme de l'agent de contraste même après la différenciation cellulaire.

Fantômes IRM pondérés en T de CSM. un Section transversale. b Analyse quantitative de la valeur SI. **P < 0.001 vs contrôle

Il existe de nombreuses données publiées sur les MSC marquées avec des nanoparticules magnétiques (MNP), mais l'application des MNP était limitée par leur cytotoxicité. Lors de l'administration de MNP au tissu cible, la majorité des MNP se distribuent souvent dans le foie et la rate, de sorte que la toxicité des MNP ne peut pas être négligée [30]. Par exemple, Costa C a découvert que les SPION pouvaient produire une cytotoxicité pour les cellules neuronales et les cellules gliales [31]. Comme nous l'avons mentionné ci-dessus, les PBNP n'ont montré aucune cytotoxicité détectable et n'ont eu aucun effet sur les caractéristiques cellulaires des MSC, y compris le cytosquelette, la morphologie cellulaire et la protéine fonctionnelle. Ainsi, la force de l'utilisation des PBNP en tant qu'agent de contraste IRM cellulaire pondéré en T2 efficace serait démontrée en termes de cytotoxicité.

Conclusions

En résumé, nous avons introduit les PBNP dans le suivi des cellules souches mésenchymateuses et étudié la survie, le potentiel de migration et les caractéristiques cellulaires des MSC après avoir été marqués avec les PBNP. En outre, nous avons également démontré le potentiel des PBNP en tant qu'agent de contraste IRM efficace pondéré en T2 pour l'IRM cellulaire des CSM. Les PBNP peuvent être utilisés efficacement pour le marquage des MSC et n'influenceront pas les caractéristiques biologiques des MSC. Cette conclusion a ouvert une nouvelle voie pour le label des MSC.

Abréviations

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

FBS :

Sérum fœtal bovin

IRM :

Imagerie par résonance magnétique

MSC :

Cellule souche mésenchymateuse

NIR :

Proche infrarouge

OD :

Densité optique

PBNP :

Nanoparticule bleu de Prusse

TEM :

Microscopie électronique à transmission

VSM :

Magnétomètre à échantillon vibrant