Les nanotechniques inactivent les cellules souches cancéreuses

Contexte

Le problème de la croissance maligne reste l'un des plus urgents en médecine. Au cours des dernières décennies, des progrès ont été réalisés dans le développement de nouveaux traitements contre le cancer. Cela est dû à la révision du concept classique de cancer et à la découverte des cellules souches cancéreuses (CSC), qui sont capables d'un auto-renouvellement illimité et peuvent être identifiées par un certain nombre de marqueurs phénotypiques. La plupart de ces cellules sont résistantes aux radiothérapies et aux chimiothérapies, provoquant une rechute de la croissance maligne et des métastases. Il existe de nouvelles méthodes maîtrisées de thérapie anticancéreuse, à savoir, permettant d'inactiver sélectivement les cellules tumorales avec un minimum de dommages aux tissus normaux [1].

Les CSC ont été identifiées et décrites pour la première fois en 1997 par l'équipe de M. Dick [2]. Les auteurs ont étudié une leucémie myéloïde aiguë dans laquelle la sous-population représentant 0,01 à 1 % de la population totale de cellules pourrait provoquer une leucémie lorsqu'elle est transplantée chez des souris immunodéficientes NOD/SCID (immunodéficience combinée diabétique-sévère non obèse). Ces cellules inductrices de tumeurs ont été caractérisées phénotypiquement comme CD34 ⁺ CD38 ^– . En 2003, M. Al-Hajj et M.S. Wicha a réussi à identifier les CSC dans une forme solide de cancer du sein humain (BC) [3]. Il a été constaté que la population non séparée de cancer du sein primitif présentait un potentiel tumorigène dans 100 % des cas (10/10) lorsqu'elle était administrée à des souris NOD/SCID à une concentration de 5 × 10 ⁴ cellules/souris. Réduction de la concentration de cellules administrées jusqu'à 1 × 10 ⁴ cellules/souris ont diminué leur activité tumorigène 4 fois (3/12) [3]. CD24 ⁺ CD44 ⁺ fraction lorsqu'il est administré à différentes doses (2 × 10 ⁴ jusqu'à 100 cellules/souris) n'a pas permis la croissance tumorale. Ci-joint, CD44 ⁺ CD24 ^– /la sous-population faible possédait une activité tumorigène significativement plus élevée, démontrant la formation de tumeurs dans 100 % des cas lorsqu'elle est administrée 10 ³ cellules / souris. La capacité la plus prononcée à former des tumeurs était inhérente à la sous-population de CD44 ⁺ CD24 ^– / ^lo ESA ⁺ phénotype. L'administration à des souris de seulement 200 de ces cellules a entraîné la formation de tumeurs solides à 100 % (4/4) 5 mois après leur injection [3]. Ces études ont été poursuivies par Ponti D. et al., qui ont montré la capacité de certaines populations d'échantillons de biopsie de cancer du sein à former des mammosphères in vitro en culture sans sérum [4]. La plupart des cellules des mammosphères obtenues étaient de CD44 ⁺ /CD24 ^–/bas phénotype ainsi qu'un potentiel tumorigène accru in vivo lorsqu'il est administré à des souris SCID (immunodéficience combinée sévère). La capacité à former une tumeur dans cette sous-population était 1000 fois plus élevée que celle de la lignée traditionnellement transplantée de carcinome du sein MCF7 [4]. Cependant, les auteurs ont montré que seulement 20 % des CD44 ⁺ CD24 ^–/bas les cellules avaient la capacité d'auto-renouvellement. Cela peut être dû à l'hétérogénéité de cette sous-population, à savoir la présence de marqueurs supplémentaires (ESA, ALDH), déterminant la fonction des cellules et peut également être lié au taux d'expression de CD44. Les articles publiés au cours des dernières années montrent que les CSC avec une expression élevée du marqueur (CD44 ^élevé ) ont l'activité tumorigène la plus élevée [5, 6]. En implantation orthotopique de 5 × 10 ⁵ CD44 ^élevé -RAS-transformé et CD44 ^faible à des souris NOD/SCID, il a été découvert qu'une sous-population CD44 ^faible possédait une faible tumorigénicité (la tumeur s'est formée dans 30% des cas), tandis que le CD44 ^élevé les cellules étaient capables de former des tumeurs dans 100% des cas [6].

En résumant les données publiées, la ligne de différenciation des sous-populations de cellules cancéreuses du sein peut être représentée comme suit :

Un certain nombre de cellules portant d'autres marqueurs, en particulier Sca-1 ⁺ revendique le stade CSC. Les données sur une réduction de la croissance tumorale chez les souris knock-out pour Sca-1 militent en faveur de l'hypothèse d'un rôle initiateur de tumeur de Sca-1 ⁺ cellules à un stade précoce de la tumorigenèse [7]. Récemment, beaucoup plus d'attention des chercheurs a été attirée non seulement par les CSC mais aussi par les cellules constituant leur microenvironnement accessoire-régulateur. Le CD117 ⁺ les cellules, qui sont traditionnellement détectées dans un pool de cellules souches sanguines, méritent une attention particulière parmi elles [8]. La population totale de cellules de carcinome du sein humain comprend les fibroblastes dits associés au carcinome du stroma avec CD117 ⁺ phénotype. Ils soutiennent la croissance tumorale, favorisant son angiogenèse [9, 10]. Une hypothèse de la présence dans la population de carcinome d'Ehrlich (EC) de cellules souches, étude du potentiel tumorigène de CD44 ⁺ fraction et rôle du CD117 ⁺ cellules dans le maintien du développement tumoral nécessite une preuve supplémentaire.

La plupart des expériences de passage des CSC in vivo ont été réalisées chez des souris SCID ou NOD/SCID. Ces souris ne répondent pas par une réaction immunitaire à la xénotransplantation de cellules humaines. La recherche de modèles expérimentaux adéquats et pertinents pour étudier et évaluer l'activité antitumorale de divers agents thérapeutiques est en cours. L'un d'eux est la lignée cellulaire tumorale d'EC transplantée in vivo, qui a été obtenue à partir d'un cancer du sein spontané de souris [11]. Cependant, il n'y a pratiquement pas de publications quant à la composition des sous-populations de cellules EC et leurs caractéristiques phénotypiques, la présence de CSC et leur importance dans le maintien de la croissance de ce type de tumeur. Compte tenu de la similitude histogénétique de l'EC et de la BC, on peut supposer que dans l'initiation et le développement de la tumeur simulée, les mêmes gènes contrôlant la prolifération des cellules cancéreuses peuvent être impliqués ainsi que des voies biochimiques similaires conduisant à l'expression de protéines marqueurs tumoraux. Cependant, la supposition sur la présence de CSC dans la population de CE et l'étude de leur potentiel tumorigène nécessite des preuves supplémentaires, ce qui était l'un des objectifs de la présente étude.

Un problème non moins urgent de l'oncologie actuelle est de trouver les médicaments, non seulement reconnaissant spécifiquement mais également inactivant les CSC. La notion même de compréhension du problème a été la base formée dans le sens du moment « théranostique » (thérapie + diagnostic) [12]. Dans le cadre de la théranostique, des approches technologiques développées pour l'utilisation des médicaments et des outils de diagnostic et de traitement simultanés du cancer sont développées. L'une des directions de la théranostique est le ciblage des nanoparticules d'or sur le site tumoral et après la thérapie photothermique [13]. Une autre approche pour l'identification des cellules tumorales est l'utilisation de points quantiques, de puissants agents de contraste optique permettant le suivi de la tumeur in vivo [14]. La capacité des points quantiques à visualiser de manière non invasive les cellules souches embryonnaires humaines in vivo témoigne en faveur de leur possible application biomédicale [15].

Récemment, une plus grande attention est accordée aux nanoluminophores à base de matériaux diélectriques et de semi-conducteurs à large zone, activés avec des éléments de terres rares, à savoir les nanoparticules (NP) de métaux de terres rares (en particulier, le vanadium et ses composés) [16]. Ces matériaux possèdent une photostabilité élevée, un grand décalage de Stokes de la luminescence, l'absence d'effet de scintillation et la stabilité des bandes de luminescence étroites caractéristiques. Ainsi, les effets antitumoraux des composés du vanadium sont connus. Ainsi, il a été démontré qu'un dichlorure de vanadium peut inhiber de manière significative la prolifération cellulaire à la suite d'une accumulation dans l'hétérochromatine nucléaire avec induction ultérieure d'une suppression transitoire d'aberration mitotique des mitoses, conduisant à une accumulation de cellules à la fin du S et G ₂ phases [17]. L'utilisation de nanocomplexes hybrides à base de nanoparticules de terres rares d'orthovanadates GdYVO₄ peut être prometteuse pour le traitement des tumeurs malignes. :Eu ³⁺ et le cholestérol, développé à l'Institut des matériaux de scintillation de l'Académie nationale des sciences d'Ukraine [18].

Le but de leur création était de renforcer un effet thérapeutique des agents anticancéreux en raison de la présence dans la composition de nanocomplexes ayant une affinité pour les membranes cellulaires cibles. L'un est le cholestérol qui est activement « retiré » de la circulation sanguine en faisant proliférer les cellules cancéreuses pour construire les biomembranes. Ceci est facilité par la présence à la surface d'un grand nombre de cellules tumorales SR-B1 (récepteur scavenger, classe B type I) et des récepteurs de la cavéoline-1 (Cav-1), qui peuvent se lier au cholestérol sanguin libre [19] .

Ainsi, le but de ce travail était d'identifier la composition de la sous-population de cellules EC, y compris celles présentant des signes de CSC, ainsi que leur activité tumorigène après prétraitement avec des nanocomplexes hybrides.

Méthodes

Les expériences ont été réalisées sur des souris Balb/C femelles âgées de 8 mois. Les souris ont été maintenues dans des conditions standard du vivarium (température ambiante de 20 ± 2 °C, humidité relative 50-70%, cycle lumière-obscurité 12:12 h). Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité d'éthique animale de l'Institut des problèmes de cryobiologie et de cryomédecine de l'Académie nationale des sciences d'Ukraine, Kharkiv, Ukraine, (rec. n° 1 du 23.01.2017) et étaient conformes à la Convention européenne sur l'utilisation des animaux d'expérimentation (Strasbourg, 1986), approuvée par le premier congrès national d'Ukraine en bioéthique (Kiev 2004).

Culture de cellules EC In Vivo

Des cellules de carcinome d'Ehrlich (EC) ont été passées dans la cavité péritonéale (PC) de souris Balb/C. Les cellules cryoconservées dans le liquide d'ascite EC ont été utilisées comme culture primaire [20]. Après décongélation, les cellules EC ont été trois fois retransplantées in vivo, pour atténuer une influence des facteurs de congélation-décongélation et gagner par elles des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des cellules natives [21]. Les cellules EC "stabilisées" ont ainsi été injectées par voie intrapéritonéale à une dose de 3 × 10 ⁶ cellules/souris dans 0,3 ml de solution saline et cultivées pendant 7 jours in vivo. Après 7 jours, les animaux de laboratoire ont été retirés de l'expérience sous anesthésie légère à l'éther. Le liquide d'ascite du PC a été prélevé à l'aide d'une seringue à travers une aiguille de 2,69 mm de diamètre intérieur et placé dans un tube de mesure de 10 ml. Le nombre absolu de cellules a été déterminé en grossissant le volume du liquide ascitique accumulé dans la cavité péritonéale (ml) avec le nombre de cellules EC comptées dans la chambre de Goryaev. Une augmentation du nombre total jusqu'à 35.00 × 10 ⁷ Les cellules EC dans les PC de souris jusqu'au jour 7 étaient un critère de développement du carcinome [21]. À l'avenir, les cellules mêmes servaient d'objet d'étude.

Évaluation phénotypique des sous-populations EC

Elle a été réalisée avec un cytomètre en flux « FACS Calibur » (« Becton Dickinson, USA) en utilisant des anticorps monoclonaux (US « BD Biosciences ») contre CD44 (FITC) (n° 553133, clone IM7), CD117 (FITC) (n°. 553354, clone 2B8) et Sca-1 (FITC) no. 553333, clone E13-161.7), et CD24 (PE) no. 553262, clone M1/69) selon les instructions du fabricant. A titre de contrôle, les échantillons avec ajout d'anticorps monoclonaux non immuns marqués FITC et PE des mêmes isotypes (« BD Biosciences »), no. 553988, clone A95-1 et no. 553989, clone A95-1), car des anticorps contre le marqueur testé ont été utilisés. Une double coloration immunophénotypique a été réalisée en utilisant des anticorps monoclonaux CD44 (FITC) et CD24 (PE). Les cellules avec une fluorescence moyenne de marqueur CD44 supérieure à 10 ³ (selon une échelle logarithmique) ont été référés à CD44 ^élevé sous-populations. L'enregistrement et l'analyse des résultats ont été réalisés avec le logiciel « WinMDi 2.9 » (Joseph Trotter, La Jolla, USA).

Séparation du CD44 ⁺ Fraction des cellules EC utilisant le tri immunomagnétique

En gardant à l'esprit que les CSC avec un niveau d'expression élevé du marqueur CD44 (CD44 ^élevé ), composée d'une population hétérogène de CD44 ⁺ cellules, possèdent l'activité tumorigène la plus élevée, elles ont été isolées d'une population totale d'EC avec un trieur magnétique (BDTM Imagnet). Pour isoler CD44 ⁺ faction, il a été utilisé des anticorps monoclonaux primaires non marqués pour le marqueur CD44 (BD, 558739) et secondaires Mouse IgG1 Magnetic Particles-DM (BD, 557983) selon le protocole du fabricant. Pureté de séparation pour CD44 ⁺ cellules de la population totale d'EC était de 90 %.

Détermination de l'activité tumorogénique des cellules de la population totale et celles de CD44 isolé ⁺ et CD44 ^– - Fractions EC

Capacité tumorigène de la population totale et des CD44 ⁺ isolés et CD44 ^– Les fractions EC ont été analysées comparativement par la méthode de culture in vivo décrite ci-dessus. La configuration expérimentale est illustrée à la figure 1.

Conception expérimentale lors de l'analyse comparative de la capacité tumorigène de la population totale et des CD44 ⁺ isolés et CD44 ^– Fractions CE

Dans la première série d'expériences, nous avons évalué la capacité tumorigène de la population totale et des CD44 ⁺ isolés et CD44 ^– Fractions EC lors de leur administration aux animaux à une dose standard utilisée pour l'initiation EC (3 × 10 ⁶ cellules dans 0,3 ml de solution saline).

Les animaux ont été divisés dans les groupes suivants (n = 10) :

• Groupe 1.1–administration de la population totale de cellules EC (3 × 10 ⁶ cellules/animal)

• Groupe 2.1–administration de CD44 ⁺ fraction de cellules EC (3 × 10 ⁶ cellules/animal)

• Groupe 3.1–administration de CD44 ^– fraction EC cellules (3 × 10 ⁶ cellules/animal)

Au cours des 7 jours suivant l'inoculation dans chacun des groupes expérimentaux, un nombre total de cellules dans le PC des animaux a été compté, les caractéristiques phénotypiques des cellules ont été évaluées (comme décrit ci-dessus) et le CD44 ^élevé /CD117 ⁺ ratio de cellules EC déterminé comme le ratio de CD44 ^élevé pourcentage au CD117 ⁺ cellules [22]. Potentiel de prolifération des cellules de la population totale d'EC et de CD44 ⁺ isolés et CD44 ^– fractions a été estimée sur la base des données suivantes :facteur de multiplicité (MF) de l'excédent de la population cellulaire pendant le temps de culture, M = N/N₀; et le doublement du temps (TD), TD = (log₂ 2)* t /[log₂ (N /N ₀ )], où t est le temps de culture cellulaire (h), N est le nombre de cellules à t temps; N ₀ est le numéro de cellule initial [23].

Dans la deuxième série d'expériences, il y avait une dose minimale estimée des cellules administrées de la population totale et des CD44 ⁺ isolés et CD44 ^– Fractions EC, induisant la croissance tumorale. Suspension cellulaire totale et CD44 ⁺ isolé et CD44 ^– Les fractions EC ont été administrées par voie intrapéritonéale à des souris aux doses de 3 × 10 ⁶ , 3 × 10 ⁵ , 3 × 10 ⁴ , et 3 × 10 ³ cellules par souris dans 0,3 ml de solution saline et cultivées pendant 7 jours dans le PC.

Les animaux utilisés dans cet ensemble d'expériences ont été divisés dans les groupes suivants (n = 10) :

• Groupe 1.1–administration de la population totale de cellules EC (3 × 10 ⁶ cellulesanimal)

• Groupe 1.2–administration de la population totale de cellules EC (3 × 10 ⁵ cellules/animal)

• Groupe 1.3–administration de la population totale de cellules EC (3 × 10 ⁴ cellules/animal)

• Groupe 1.4–administration de la population totale de cellules EC (3 × 10 ³ cellules/animal)

• Groupe 2.1–administration de CD44 ⁺ fraction de cellules EC (3 × 10 ⁶ cellules/animal)

• Groupe 2.2–administration de CD44 ⁺ fraction de cellules EC (3 × 10 ⁵ cellules/animal)

• Groupe 2.3–administration de CD44 ⁺ fraction de cellules EC (3 × 10 ⁴ cellules/animal)

• Groupe 2.4–administration de CD44 ⁺ fraction de cellules EC (3 × 10 ³ cellules/animal)

• Groupe 3.1–administration de CD44 ^– fraction EC cellules (3 × 10 ⁶ cellules/animal)

• Groupe 3.2–administration de CD44 ^– fraction EC cellules (3 × 10 ⁵ cellules/animal)

• Groupe 3.3–administration de CD44 ^– fraction cellules EC (3 × 10 ⁴ cellules/animal)

• Groupe 3.4–administration de CD44 ^– fraction cellules EC (3 × 10 ³ cellules/animal)

Dans chaque groupe expérimental, un nombre total de cellules dans le PC et celui des animaux présentant un développement d'ascite ont été déterminés 7 jours plus tard après l'inoculation EC.

Synthèse de nanocomplexes

Des nanocomplexes hybrides contenant des nanoparticules sphériques (NPs) (de 2 à 3 nm de diamètre) à une concentration de 1,30 g/l et du cholestérol de mouton à une concentration de 0,55 g/l (« Acros organiques », Belgique) ont été synthétisés à l'Institut des matériaux de scintillation. de l'Académie nationale des sciences d'Ukraine (Kharkiv) comme indiqué [18]. NPs basés sur des orthovanadates d'éléments de terres rares GdYVO₄ :Eu ³⁺ de forme sphérique à une concentration de 1,30 g/l ont été préparés comme décrit [24]. Des solutions colloïdales aqueuses à base d'orthovanadates ont été purifiées des impuretés par dialyse à l'aide des membranes « Cellu Sep H1 » 3,5 KDa.

Dans le nanocomplexe hybride, les NP chargées négativement sont localisées le long de la périphérie des particules de cholestérol en raison de van der Waals et d'interactions hydrophobes. Les NP stabilisent les nanocomplexes via des interactions électrostatiques. Les tailles des nanocomplexes synthétisés ne dépassent pas 100 nm. De plus, les NP présentent des propriétés antioxydantes et ne sont pas soumises à l'oxydation. Ce fait contribue à l'augmentation de la résistance de la dispersion aqueuse de cholestérol vis-à-vis des espèces réactives de l'oxygène. La structure schématique du nanocomplexe hybride est illustrée à la figure 2.

Nanocomplexe hybride :a représentation schématique et b Microscopie électronique à transmission photomicrographie de nanocomplexes hybrides, obtenus à partir d'une solution aqueuse de cholestérol placée sur un réseau de carbone

Pour enregistrer une accumulation de nanocomplexes hybrides dans les cellules au cours des études in vitro, le colorant fluorescent hydrophobe 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI) a pu être introduit en plus dans la dispersion aqueuse de cholestérol, permettant en spectroscopie luminescente locale d'évaluer la dynamique d'intégration du complexe dans une membrane cellulaire par le rapport des bandes de luminescence monomère––« J-agrégat » [25]. Nos études antérieures ont montré que le nanocomplexe hybride ne peut être intégré que dans 10 % des cellules de la population totale d'EC et pratiquement dans toutes les cellules de CD44 ⁺ isolés. fraction ayant le potentiel cancérigène le plus élevé. Cela permet l'utilisation de nanocomplexes hybrides dans cette modification (NPs + cholestérol + DiI) comme méthode d'identification de l'accumulation locale de nanocomplexes dans les cellules cancéreuses [26, 27].

Pré-traitement des cellules EC avec des nanomatériaux

Une suspension totale de cellules EC avec des nanocomplexes hybrides ou des NP a été incubée dans une solution de glucose à 5 % (« Infusion » CJSC, Kiev) à température ambiante pendant 3 h. Un tel temps d'incubation a été précédemment trouvé comme optimal pour lier les nanocomplexes aux cellules [26].

Les variantes suivantes de prétraitement des cellules EC avec des nanomatériaux ont été testées :

• Option 1 à 900 μl de cellules EC (1 × 10 ⁷ ) 100 μl de NP sphériques (1,3 g/l) ont été ajoutés.

• Option 2 à 900 μl de cellules EC (1 × 10 ⁷ ) 100 μl de complexe hybride (NPs sphériques (1,3 g/l) + cholestérol (0,55 g/l)) ont été ajoutés.

Le contrôle était constitué des cellules de la population totale d'EC, qui ont été incubées dans une solution de glucose à 5% sans traitement avec des nanocomposites. Le nombre d'animaux dans chaque groupe expérimental n'était pas inférieur à 20.

Après incubation, les cellules EC de tous les groupes testés ont été lavées trois fois avec une solution saline (1:1) par centrifugation (10 min à 300 g).

L'intensité du développement de CE après prétraitement avec des nanomatériaux a été évaluée par injection intrapéritonéale à une dose de 3 × 10 ⁶ cellules dans 0,3 ml de solution saline. En 7 jours après l'inoculation des cellules EC dans tous les groupes étudiés, il a été déterminé :

• Un nombre total (TN) de cellules EC dans la cavité péritonéale.

• Taux d'inhibition (Ri) de la croissance des CE selon la formule Ri = (TN (c) – TN(e)) :TN (c) × 100 %, où TN (c)––nombre total de cellules EAC dans le PC du groupe témoin, TN (e) :nombre total de cellules EAC dans le PC du groupe expérimental.

• Le taux de croissance (Rg) de l'EC a été calculé en utilisant la formule Rg (e) = Rg (c) – Ri, où Rg (e) - taux de croissance des tumeurs du groupe expérimental d'animaux ; Rg (c) - taux de croissance de la tumeur du groupe témoin, Ri - taux d'inhibition de la croissance des CE dans le groupe expérimental d'animaux; le taux d'inhibition de la croissance des CE dans le contrôle a été pris comme 100 %, à ce moment-là, il n'y avait pas d'inhibition de la croissance des CE.

• CD44 ^élevé /CD117 ⁺ ratio (ratio de CD44 ^élevé pourcentage au CD117 ⁺ cellules).

• La survie des animaux a été évaluée jusqu'au jour 20 après l'injection intrapéritonéale de cellules EC non traitées et traitées avec tous les types de nanocomposites.

Le traitement statistique a été effectué à l'aide de Mann-Whitney U non paramétrique test dans le logiciel Statistica 6.0. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à P < 0,05.

Résultats

Les résultats obtenus indiquent la présence d'une population hétérogène de cellules EC portant à leur surface les marqueurs CD44, CD24, Sca-1 et ceux qui pourraient être attribués à des éléments accessoires-régulateurs du microenvironnement (CD117). Les concentrations de cellules présentant ces caractéristiques dans le pool EC total (groupe 1.1) sont présentées dans le tableau 1 et sont tout à fait cohérentes avec les résultats précédents sur la composition de la sous-population EC [28]. L'identification de la structure de Sca-1 pratiquement dans toutes les cellules EC permet de la considérer comme un marqueur polyvalent de ce type de tumeur.

Le plus informatif en termes d'identification phénotypique des CSC est l'expression de la molécule CD44, qui soit elle-même soit en combinaison avec d'autres marqueurs de surface, est utilisée pour isoler cette population cellulaire de diverses tumeurs, y compris EC. Selon les notions classiques, la différenciation des cellules tumorales au cours du développement du cancer du sein s'accompagne d'une expression réduite du récepteur CD-44 avec sa disparition progressive et l'apparition des cellules exprimant le marqueur CD24 [3].

Les candidats au rôle de CSC pendant la CE pourraient être les cellules avec CD44 ^élevé phénotype faisant partie de CD44 ⁺ CD24 ^– - population. Cette supposition sur la dépendance de la CE à l'activité fonctionnelle d'une sous-population de CD44 ⁺ cellules a été testé lors de l'évaluation de l'intensité de la croissance tumorale induite par CD44 ⁺ et CD44 ^– factions et la population totale de la CE. Le tableau 1 démontre que l'activité tumorale la plus élevée était inhérente aux cellules de CD44 ⁺ fraction. En fait, après avoir administré 3x10 ⁶ CD44 ⁺ cellules (groupe 2.1), un nombre absolu de cellules dans PC était 23 fois plus élevé qu'après celui de la population totale de cellules EC (groupe 1.1), et 105 fois plus que lorsque CD44 ^– fraction a été administrée (Groupe 3.1).

Avec cela, on a trouvé des changements non seulement des compositions quantitatives mais aussi qualitatives d'une tumeur en développement. La fraction de CD44 ⁺ formé l'ascite avec une teneur prédominante de CD44 ⁺ cellules, c'est-à-dire CD44 ^élevé , CD44 ⁺ CD24 ^– , et CD44 ⁺ CD24 ⁺ cellules. De plus, la concentration de CD44 ^élevée cellules était 2 fois plus élevé par rapport au groupe 1.1 et 16 fois plus élevé dans le groupe 3.1. La fraction de CD44 ^– , en revanche, a formé une tumeur qui contenait des cellules plus matures, à savoir celles avec CD44 ^– CD24 ⁺ phénotype. La redistribution même de la composition de la sous-population des cellules du groupe 3.1 a apparemment déterminé le contenu absolu minimum des cellules dans le PC.

Important est le fait établi de la présence parmi les cellules EC d'une sous-population avec un CD117 ⁺ marqueur. La molécule de CD117 est un récepteur transmembranaire de la tyrosine kinase. Dans des conditions normales, il est activé par le ligand correspondant, à savoir le facteur de croissance des cellules souches (SCGF) [29]. En pathologie oncologique, il se produit une activation ligandone-dépendante du récepteur c-KIT, qui le plus souvent (jusqu'à 92 % des cas) est une conséquence de la mutation de l'oncogène c-kit ou est provoquée par un mécanisme de régulation désordonné de cette fonction du récepteur [30].

Considérant CD117 ⁺ cellules en tant que cellules du microenvironnement tumoral le fait établi de la dépendance de l'intensité de la croissance tumorale à la présence ou à l'absence de CD117 ⁺ cellules et leurs relations de concentration avec CD44 ^élevé cellules est logique. Comme le montre le tableau 1, lors du lancement de l'EC en introduisant la population cellulaire totale (groupe 1.1.) dans le PC, il s'est formé 34,80 ± 1,27 × 10 ⁷ cellules au CD44 ^élevé /CD117 ⁺ rapport, qui était égal à 0,02 unités relatives.

Potentiel tumorigène de CD44 ^– fraction était 4 fois plus faible (groupe 3.1) qui s'est manifestée par un CD44 réduit ^élevé /CD117 ⁺ rapport dans la même mesure (4 fois) par rapport au groupe 1.1. Ce changement de CD44 ^élevé /CD117 ⁺ l'indice était principalement dû à une diminution du CD44 ^élevé concentration (en 8,5 fois) sur le fond de la teneur réduite en CD117 ⁺ cellules (en 2 fois) également.

Lors de l'évaluation de l'intensité de la croissance de l'ascite, générée par CD44 ⁺ fraction, une augmentation significative du nombre total de cellules dans PC (presque 24 fois par rapport au groupe 1.1) a été notée. De plus, un élément important est l'excès en deux fois de CD44 ^élevé concentration et manque de CD117 ⁺ cellules. Dans le matériel initial du CD44 ⁺ fraction (avant la culture) selon l'analyse cytométrique en flux des données, le contenu de CD44 ^élevé cellules était 15 fois plus élevé que dans la population totale des cellules EC (données non présentées).

Pour résumer ce qui précède, nous pouvons soutenir qu'un rôle crucial dans l'initiation de la CE est joué par les CSC avec un taux d'expression élevé du marqueur CD44 (CD44 ^élevé ), alors que l'une des fonctions les plus importantes de CD117 ⁺ la sous-population est une régulation (« retenue ») de l'activité tumorigène de CD44 ^élevée cellules. L'absence de CD117 ⁺ les cellules (groupe 2.1) semblent multiplier le potentiel de prolifération et de différenciation de l'ensemble du pool de CD44 ⁺ cellules, provoquant une augmentation significative du nombre total de cellules dans le PC.

L'analyse du potentiel prolifératif d'un pool total de cellules EC et CD44 ⁺ faction est favorable à cette interprétation. Il est montré que le facteur de multiplication (MF) dans la population globale cultivée dans le PC dans le groupe 2.1. pendant 7 jours a augmenté de presque 24 fois par rapport au groupe 1.1. Cela s'est accompagné d'une diminution du temps cellulaire doublant de 24,47  ± 2,75 h dans le groupe 1,1 à 14,70 ± 1,35 dans le groupe 2.1, ce qui peut caractériser une population de cellules d'ascite cultivées à partir de CD44 ⁺ fraction, comme une prolifération plus active (tableau 1).

Pour prouver le rôle particulier du CD44 ⁺ cellules dans l'initiation et le maintien de la tumeur lors de l'administration de la CE même à des doses minimales, il était intéressant d'évaluer comparativement la capacité tumorigène de CD44 ⁺ isolé et CD44 ^– fractions lorsqu'il est administré à diverses concentrations. Il a été constaté qu'après l'introduction de 3 × 10 ⁶ cellules de la population totale d'EC, une croissance tumorale a été observée chez 100 % des animaux (10/10) (tableau 2). Diminution de 10 fois la dose de cellules administrée (3 × 10 ⁵ ) resulted in a proportional decrease in absolute number of cells in the PC, tumor developed only in 50% of animals (Table 2). Reducing the administered dose of total EC population of cells down to 3 × 10 ⁴ did not lead to tumor formation in the PC.

Initiations of EC by introducing of CD44 ⁺ cells at concentrations of 3 × 10 ⁶ and 3 × 10 ⁵ cells per animal resulted in almost 100% tumor development for both cases. Herewith, tumorigenic potential of CD44 ⁺ fraction exceeded that of total population of EC cells administered in the same doses (in 23 and 21 times, respectively). Moreover, introduction of 3 × 10 ⁴ cells of CD44 ⁺ fraction caused a tumor formation in 33% of animals, while total population of EC cells used in the same dose, did not cause the formation of ascites. With the introduction of 3 × 10 ³ cells of CD44 ⁺ fraction, no animals with the developed EC have been identified.

Fraction of CD44 ^– cells just in a dose of 3 × 10 ⁶ was capable of forming tumors in 50% of animals, the number of cells in the PC in this case was 4.5 times less than when introducing the total population and in 105.9 times less than when inducing by CD44 ⁺ fraction. Thus, the results of this part of research suggest that CSCs are mainly present in the pool of cells with CD44 ⁺ phenotype. This emphasizes the importance of this subpopulation of cells in initiation and development of EC.

As noted above, identification and inactivation of CSCs is a major theoretical and practical issue of oncology. On this basis, the next task of our study was to investigate the impact of hybrid nanocomplexes designed at the Institute for Scintillation Materials of National Academy of Sciences of Ukraine on the tumorigenic activity of EC cells.

As Table 3 demonstrates an incubation of EC cells with only NPs as a component of hybrid nanocomplexes (option 1) decreased the concentration of CD44 ^high virtually twice if compared to the control and 5 times the content CD44 ⁺ CD24 ^– cells in ascites formed in vivo. The number in it of more differentiated CD44 ⁺ CD24 ⁺ , CD44 ^– CD24 ⁺ cells remained practically unchanged if compared to the control. In this group, there was established reduction of CD117 ⁺ cells (35%) at a slightly changed content of Sca-1 ⁺ subpopulation. Based on the data, the inhibition rate of EC growth (59.41 ± 3.45%) in variant 1 was accompanied by a twofold decrease in the concentrations of CD44 ^high cells in comparison with the control that was also reflected in the reduction of CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio (Table. 3).

Pretreatment of EC cells with hybrid nanocomplexes (option 2) reduced almost 10 times the concentration of CD44 ^high and CD44 ⁺ CD24 ^– cells in the developed ascites if compared to the control (Table 3). It should be noted that the concentration of more differentiated CD44 ⁺ CD24 ⁺ and CD44 ^– CD24 ⁺ cells after this treatment increased slightly if compared to the control. The redistribution pattern of EC subpopulation composition in this option was accompanied with a pronounced enhancement of tumor growth inhibition compared to option 1 (74.70 ± 4.38 and 59.41 ± 3.45%, respectively, P  < 0.05) that underlined the importance of cholesterol as a targeted compound of antitumor therapy. Pretreatment with hybrid nanocomplexes (option 2) led to maximal reduction there was found a maximum reduction of CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio (10 times) as compared with option 1, that again confirmed a specific role of ratio of these cell subpopulations in the EC growth.

For all the types of EC pretreatment, the reduction of CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio was accompanied by a decrease in tumor growth rate and increased survival of animals to day 20 of EC development (Fig. 3).

Tumor growth rate of EC, survival of animals and CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio after incubation with nanocomplexes. Note:differences are statistically significant as compared with administration of the control (*), option 1 (**) (P  < 0.05)

Discussion

One of the tasks of current oncology is elucidation of the mechanisms of initiation and development of malignant neoplasms. Mandatory participants in these events are the CSCs and so-called accessory-regulatory cells of tumor microenvironment. The variety of functional and structural characteristics of the CSCs in the development of different types of tumors determines the need for their further study. This is facilitated by the expansion of experimental model systems. One of them is the transplantable line of tumor cells of EC.

The elucidation of the peculiarities of this experimental model development, the subpopulation composition of tumor and tumorigenic potential of individual cell populations within the general pool of the EC cells will facilitate the development of new approaches to cancer therapy.

Using the method of phenotypic evaluation of progenitor cells of various levels of differentiation in the tumor focus makes it possible the identifying the stages, dynamics of development and invasiveness of the process. The established fact of heterogeneity of the EC subpopulation composition is important and there has been emphasized the value of CD44 ⁺ subpopulation in maintaining the growth of this type of tumor.

The most important role in implementing a tumorigenesis is played by an expression rate of the molecule. Indeed, in contrast to leukocytes for adhesion of those normally a low expression rate of CD44 receptor is required, triggering and self-maintenance in CSCs are implemented its much greater density on a cell surface [31].

It is known that CD44-glycoprotein is a hyaluronic acid (HA) receptor, a main component of extracellular matrix. The emerging set of HA-CD44 activates many receptor tyrosine kinases, resulting in activation of PI3K/Akt/ mTOR way [32, 33], which plays the role of a single universal signal transmission mechanism to the translation apparatus and is responsible for the integration of proliferative stimuli.

Among two known CD44-isoforms in normal hematopoietic cells its standard isoform (CD44s) is predominantly expressed [34]. In most malignant tissues there were detected both CD44s and variable isoforms of CD44- molecule (CD44v), resulting from alternative splicing of exons 6-15. Namely alternative splicing leads to a lengthening of CD44-extracellular domain, promoting its greater interaction with HA and tumor metastasis [35]. Due to that the role of CD44 ^high cells in triggering and maintaining the tumorogenesis is clear. It was previously found that a minor subpopulation of CD44 ^high cells had a high proliferative potential and played a critical role in EC developing [20].

In this paper, a special role of CD44 ⁺ -cells of the EC in initiation and maintenance of the tumor process in the EC under administration even in minimal doses has been shown. CD44 ⁺ cells were able to form a tumor even at a cell concentration of 100 times lower (10 ⁴ cells/ mouse) if compared with the introduction of a total EC population (10 ⁶ cells / mouse). The belonging of tumor cells to the CD44 ⁺ fraction was also confirmed by the fact that the EC initiation by the fraction of CD44-cells even at a dose of 10 ⁶ cells / mouse caused the formation of a tumor only in 50% of cases, with an absolute number of cells in the PC 5 times less than in under introduction of a similar amount of the total population of EC and more than 100 times less than after the introduced CD44 ⁺ -fraction.

This is in accordance with the data of Shipitsin M et al. has shown that CD44 ⁺ and CD24 ⁺ cells in breast cancer development there are cell populations with different genetic profiles [36]. The research performed by Shipitsin M CD24 ⁺ cells have been noted to be more differentiated, while more progenitor-like functions are inherent to CD44 ⁺ cellules. The research performed by Shipitsin M CD24 ⁺ cells have been noted to be more differentiated, while more progenitor-like functions are inherent to CD44 ⁺ cellules. The authors suggest that CD24 ⁺ cells can be derived from CD44 ⁺ cells [36]. Fillmore C. and Kuperwasser C. supposed that CD24 ⁺ population was mainly characterized by less differentiated basal type of breast cancer, and CD44 ⁺ cells caused the development of luminal form of breast cancer, being more differentiated type of tumor [37].

Analyzing the patterns of tumor development, the classic hypothesis of «seed and soil» looks very actual [38], which postulated that an appropriate microenvironment (soil) is required for optimal growth of tumor cells (CSCs).

Most often the carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) act as a tumor stroma in breast cancer and pancreatic cancer [39]. It has been shown that the CAFs, derived from invasive forms of human breast carcinomas, activated much stronger the growth of human breast cancer cell line MCF-7-Ras when administered to immunodeficient mice if compared with normal fibroblasts [9]. This function is implemented by the microenvironment cells due to the secretion by them of cytokines, chemokines and growth factors [10, 40].

Although so far the phenotypic identification of the microenvironment cells for various types of tumor has remained a subject of debate, most often used for this purpose the surface markers of primitive hematopoietic and endothelial cells, including c-kit (CD 117), CD133, VE-cadherin, VEGFR-2 and endoglin are used [41]. In this experimental model the most probable candidate to the role of tumor microenvironment cells is CD 117 ⁺ .

It is known that the c-KIT receptor (CD117 ⁺ ) is highly expressed in normal epithelium of the breast and progressively decreases with the development of breast carcinoma in situ and is almost completely lost in invasive breast cancer [42, 43]. Some authors proposed this kind of change in the expression rate of this marker as a possible test to assess the effectiveness of antitumor therapy [44].

Previously, after analysis of the significance of the content ratios for different subpopulations of EC cells when maintaining tumor growth, we proposed to use the CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio as a prognostic criterion of tumor development [22].

Adequacy of using this index is confirmed in this study using the applied nanocomposites as therapeutic agents when treating the EC. The inhibition rate of EC growth (59.41 ± 3.45%) when treated with spherical NPs (option 1) was accompanied by a 2-fold decrease if compared to the control in the CD44 ^high -cell concentration, which was reflected in the reduced CD44 ^high / CD117 ⁺ index. The maximum decrease in the CD44 ^high /CD117 ⁺ index (10 times if compared to option 1) was established using the hybrid nanocomplexes for a pre-treatment of EC cells. Thus, many cells of a total pool of EC, but primarily those with the phenotype CD44 ^high and CD117 ⁺ , can be the target of the effect of the studied nanocomplexes (both direct and indirect). A significant decrease in their concentrations in the growing pool of EC after pretreatment with hybrid nanocomplexes clearly coincides with a reduced intensity of tumor growth.

Judging by the decrease in the amount of CD44 ^high as the most potent CSCs forming the entire subsequent series of advanced tumor cells, the main component in manifestation of antitumor effect of the synthesized hybrid nanocomplexes is spherical NPs. Introduction of cholesterol having affinity to tumor cell membranes into composition of hybrid nanocomplexes enhanced an inhibitory activity of NPs. Similar data were obtained by Betker J.L. et al. after analysis of the structure and functioning principles of the membranes of tumor cells. The authors concluded that the incorporation of cholesterol into membranes of tumor cells could be a prerequisite for a targeted delivery of liposomes with therapeutic agents directly into a cell.

Thus, the importance of cooperative interactions of cells with different phenotypic signs in maintaining the EC growth has been proven. The cells with the CD44 ^high phenotype being the part of the population of CD44 ⁺ CD24 ^– can be considered as CSCs in this model system. The use of new forms of nanocomposites that are capable to bind to CSCs and induce tumor destruction as the EC is a promising direction the treatment of oncopathology.

Conclusions

1. 1.

   On the base of the findings of phenotypic assessment and functional potential studies, the Ehrlich carcinoma is a heterogeneous population of tumor cells of varying differentiation extent referred to high and less potent tumor-inducing precursors, as well as the cells composing their microenvironment.

2. 2.

   A high (tenfold) tumorigenic activity of the EC CD44 ⁺ cells if compared to CD44 ^– cells was proven. In this pair of comparison, the CD44 ⁺ cells had a higher potential of generating in PC of CD44 ^high , CD44 ⁺ CD24 ^– , CD44 ⁺ CD24 ⁺ cell subpopulations, highlighting the presence of CSCs in a pool of CD44 ⁺ cells.

3. 3.

   There was found an ability of the synthesized nanocomplexes based on rare earth orthovanadates and cholesterol to inhibit the growth of CD44 ⁺ cell pool (CD44 ^high , CD44 ⁺ CD24 ^– , CD44 ⁺ CD24 ⁺ ) that was accompanied by a reduced intensity of EC growth (by 75%) and increased survival of the animal with tumors (in 3.5 times) in comparison with the control.

4. 4.

   It has been shown that the reduction in tumor growth rate after pretreatment with hybrid nanocomplexes was accompanied with a change in the composition of EC subpopulation that was reflected in a decrease in the CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio. This ratio can be offered as one of diagnostic and prognostic tests of the severity and extent of oncology inactivation.

Abréviations

BC:

Breast cancer

CAFs:

Carcinoma-associated fibroblasts

CSCs:

Cancer stem cells

DiI:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

EC:

Ehrlich carcinoma

HA:

Hyaluronic acid

MF:

Multiplicity factor

NOD/SCID mice:

Nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency mice

NPs:

Nanoparticles

PC:

Peritoneal cavity

Rg:

Growth rate of EC

Ri:

Inhibition rate of EC growth

SCID mice:

Severe combined immunodeficiency mice

TD:

Time doubling