Les nanoparticules d'hydroxyapatite améliorent l'ostéogenèse des MSC via l'interaction avec les cellules endothéliales

Résumé

L'hydroxyapatite nano (nano-HA) a attiré une attention substantielle dans le domaine de la médecine régénérative. Les interactions entre cellules endothéliales (CE) et cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont nécessaires pour la reconstruction osseuse, mais la manière dont le nano-HA interagit dans ce processus reste inconnue. Dans cette étude, nous avons étudié la cytotoxicité et les effets ostéoinducteurs des nanoparticules d'HA (HANPs) sur les CSM en utilisant un modèle de co-culture indirecte médiatisé par les CE et mis en évidence les mécanismes sous-jacents. Il a été trouvé qu'à une dose sous-cytotoxique, les HANPs augmentaient la viabilité et l'expression des gènes ostéoblastiques, ainsi que les nodules minéralisés et la production de phosphatase alcaline des CSM. Ces phénomènes reposaient sur l'HIF-1α sécrété par les CE, qui déclenchait la cascade de signalisation ERK1/2. De plus, un modèle mathématique de lignée cellulaire à deux stades a été établi pour analyser quantitativement l'impact de l'HIF-1α sur la différenciation ostéogénique des CSM. Il a démontré que l'HIF-1α exerçait un effet stimulateur dose-dépendant sur le taux de différenciation ostéogénique des CSM jusqu'à 1500 pg/mL, ce qui était en accord avec les résultats ci-dessus. Nos données impliquaient que les interactions coopératives entre HANPs, CE et CSM servent probablement à stimuler la régénération osseuse. De plus, le modèle de lignée cellulaire à deux stades est un système in vitro utile pour évaluer l'influence potentielle des molécules effectrices dans l'ingénierie des tissus osseux.

Introduction

La reconstruction des défauts osseux causés par des traumatismes, des malformations congénitales ou des résections chirurgicales pose un grand défi à la chirurgie orthopédique. L'hydroxyapatite (HA), une céramique bioactif représentative, avait été employée comme substitut osseux. Cependant, des propriétés mécaniques et ostéoinductives indésirables restreignent son application clinique. Ces dernières années, le nano-HA a démontré une bioactivité plus optimale et de meilleures performances mécaniques en raison de ses caractéristiques biomimétiques uniques et a suscité un intérêt significatif dans les domaines biomédicaux liés à la médecine régénérative. Lorsque le nano-HA est implanté dans des défauts osseux, de multiples cellules impliquées dans la réparation osseuse seront exposées à celui-ci. En tant que tel, il est nécessaire d'évaluer le comportement biologique du nano-HA. Plusieurs lignes de preuves ont directement démontré que les nanoparticules d'HA (HANPs) peuvent être internalisées par les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la gelée de Wharton du cordon ombilical humain (hWJ-MSCs) et les cellules ostéoblastiques, résultant en une différenciation ostéogénique améliorée. Dua et al. ont précédemment rapporté la capacité des HANPs à promouvoir l'intégration du cartilage conçu en cartilage de novo ; inversement, les HANPs inhibent la capacité angiogénique des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs). En termes de santé humaine, une compréhension plus complète de l'impact des HANPs sur la régénération osseuse est justifiée, et les applications en cours de os artificiel nano-conçu ajoutent à l'urgence de telles études.

La régénération osseuse est inévitablement accompagnée de l'invasion de néovaisseaux. Les CE sont la doublure cellulaire interne du système vasculaire qui servent à fournir passivement le sang et jouent également un rôle dans l'induction, la spécification et le guidage de la régénération d'organes ainsi que le maintien de l'homéostasie et du métabolisme. Les CSM font partie de la niche périendothéliale et possèdent des capacités d'auto-renouvellement et de multi-différenciation sous l'induction de microenvironnements physiologiques et biochimiques particuliers au sein de leurs niches résidentes. Tsai et al. ont trouvé que les CE peuvent sécréter l'endothéline-1 pour diriger les CSM vers la différenciation ostéo- et chondro-lignagère. De plus, Saleh et al. ont utilisé l'analyse de données de microarray pour identifier les protéines sécrétées par les HUVECs et les voies de signalisation de crosstalk associées qui interagissent avec les récepteurs membranaires des CSM pour améliorer la prolifération et la différenciation ostéogénique. Dans l'ingénierie des tissus osseux, les HANPs peuvent entrer en contact avec les néovaisseaux et être endocytosées par les CE, ce qui a été montré pour altérer la fonction physiologique de ces cellules. Cela peut également influencer les cellules ostéoprogénitrices environnantes et affecter la réparation osseuse en modifiant la signalisation paracrine. Cependant, bien que l'impact direct des HANPs sur les CSM ait été exploré, il manque encore une compréhension claire de savoir si les HANPs peuvent indirectement induire la différenciation ostéogénique des CSM à travers les CE, ce qui est essentiel pour notre compréhension de l'effet des HANPs sur la réparation osseuse.

Dans cette étude, dans le but d'obtenir plus d'informations sur les effets biologiques des HANPs sur l'interaction entre les CE et les CSM, un modèle de co-culture indirecte a été établi en utilisant des HUVECs et des hWJ-MSCs. En utilisant ce système, la cytotoxicité et les effets ostéoinducteurs des HANPs sur les hWJ-MSCs via la signalisation paracrine médiatisée par les HUVECs ont été évalués. Pour identifier les facteurs clés influençant les interactions HANPs-CE-CSM, les facteurs solubles dans le surnageant des HUVECs qui avaient été stimulés avec des HANPs ont été évalués avec un accent sur les mécanismes connexes aux niveaux génique et protéique. Les résultats ont démontré que le facteur induit par l'hypoxie (HIF)-1α joue un rôle critique dans ces interactions.

Pour observer et prédire quantitativement l'impact de l'HIF-1α sur le processus d'ostéogenèse, un modèle mathématique combinant une lignée cellulaire à deux stades avec l'HIF-1α a été établi. Ici, en analysant les données empiriques, le modèle de lignée cellulaire à deux stades a été utilisé pour prédire le nombre de CSM et le degré de différenciation à tout moment, sur la base de la densité d'ensemencement cellulaire initial définie et de la concentration d'HIF-1α, et cela peut à son tour fournir des suggestions appropriées pour les conditions de culture initiales et les temps d'incubation. Les résultats de cette étude aideront à éclairer les interactions entre les substituts osseux à base de nano et les systèmes biologiques, ce qui peut servir à promouvoir le développement de biomatériaux innovants pour une utilisation en médecine régénérative.

Matériaux et méthodes

Préparation et caractérisation des particules

Des HANPs à 20 nm (np20), 20×80 nm (np80) et des particules d'HA de taille micro (m-HAP) avec une pureté ≥ 99,0 % ont été achetées auprès de Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Nanjing, Chine). La taille et la forme des particules ont été visualisées en utilisant la microscopie électronique en transmission (TEM ; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, Hillsboro, OR, USA) et la microscopie électronique à balayage (SEM ; LEO1530VP, Allemagne). La taille hydrodynamique et le potentiel zêta des particules d'HA (HAPs) ont été déterminés via Zetasizer Nano ZS90 et Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, UK).

Préparation et culture cellulaire

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité d'éthique de l'Université médicale de Nanjing. Les HUVECs et hWJ-MSCs ont été récoltés à partir de cordons ombilicaux humains frais, comme décrit précédemment, après obtention du consentement éclairé écrit des donneurs. Brièvement, le cordon ombilical et la veine ombilicale ont été rincés avec du tampon phosphate salin (PBS) contenant 1 % de pénicilline et streptomycin (PS ; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Pasching, Autriche). Ensuite, la veine ombilicale a été remplie avec 0,1 % de collagenase I (Sigma, St. Louis, MO, USA) et incubée pendant 15 min à 37 °C. Après collecte, les HUVECs ont été cultivées dans le milieu EC (ECM) (Sciencell, San Diego, CA, USA).

Par la suite, les vaisseaux sanguins ont été retirés, et la gelée de Wharton a été coupée en morceaux de 1 mm² et placée dans des flacons de culture de tissu de 25 cm² (Corning Incorporated, Corning, NY, USA). Ces cellules ont été incubées dans du L-DMEM (GIBCO Life Technology, Grand Island, NY, USA) supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin (GIBCO) et 1 % de PS.

Les hWJ-MSCs ont été évaluées pour confirmer le phénotype en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés vers CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51 et CD105 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Les HUVECs ont été évaluées en utilisant le facteur von Willebrand (vWF ; Shanghai ChangDao Biotech Co, Ltd., Shanghai Chine). Les HUVECs entre passages 3–7 et les hWJ-MSCs entre passages 3–5 ont été utilisées dans ces expériences.

Les suspensions de particules à 1 mg/mL dans le PBS ont ensuite été diluées dans le L-DMEM à la concentration finale. Comme montré dans la figure 1, les HUVECs ont été incubées dans la concentration indiquée de HAPs pendant 18 h. Le milieu de culture a été centrifugé à 15 000 tr/min à 4 °C pendant 15 min, et les surnageants supplémentés avec 10 % de FBS ont été utilisés comme milieu conditionné (CM) pour les hWJ-MSCs pour accomplir les expériences suivantes. Le CM consistait en un milieu ostéogénique supplémenté avec du fluide d'induction ostéogénique, qui contenait 10 mM β-glycérophosphate, 50 μg/mL d'acide L-ascorbique-2-phosphate, et 0,1 μM de dexaméthasone (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). De plus, le 2-méthoxyestradiol (2-MeOE2) (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) a été utilisé comme inhibiteur spécifique de l'HIF-1α. Dans le groupe 2-MeOE2(+), les hWJ-MSCs ont été cultivées avec le CM des HUVECs, qui ont été prétraitées avec 5 μM de 2-MeOE2 pendant 40 min avant la supplémentation en HAP. Le PD98059 a été utilisé comme inhibiteur spécifique de MEK. Dans le groupe PD98059, les hWJ-MSCs ont été cultivées avec le CM contenant 5 μM de PD98059.

Détermination de la viabilité et du nombre cellulaire

La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant le kit de test MTS (MTS ; Bestbio, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine). Les hWJ-MSCs ont été laissées adhérentes pendant 24 h puis cultivées avec le CM pendant 24 et 72 h. L'absorbance du formazan a été évaluée à 490 nm en utilisant un lecteur de microplaques (SpectraMax M2 ; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, USA). L'absorbance a également été convertie en nombres cellulaires en utilisant des courbes d'étalonnage standard sous les mêmes conditions.

Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (RT-PCR)

Le réactif TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a été utilisé pour isoler l'ARN total des cellules hWJ-MSCs incubées dans le CM pendant le temps indiqué. L'ADN complémentaire a été transcrit à partir de 1,0 µg d'ARN en utilisant un kit de synthèse de brin d'ADNc PrimeScript First Strand (TaKaRa, Tokyo, Japon) dans un thermocycleur T3 (Mastercycler 5333 ; Eppendorf, Hamburg, Allemagne). Les niveaux d'expression des gènes indiqués ont été analysés en utilisant le kit FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche, Bâle, Suisse) sur un système d'amplification quantitative en temps réel (7900HT Fast ; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). L'expression relative de l'ARNm du gène cible a été normalisée par rapport à GAPDH et ensuite déterminée en utilisant la méthode 2^(-ΔΔCt). Les séquences d'amorces pour les gènes cibles sont listées dans le Tableau 1.

Coloration au Rouge Alizarine S (ARS) et analyse quantitative

Les hWJ-MSCs ont été cultivées dans des plaques à 12 puits avec un milieu ostéogénique jusqu'à 14 j, puis la minéralisation de la matrice extracellulaire a été observée en utilisant la coloration ARS (Leagene, Leagene Biotechnology, Beijing, Chine) après. Brièvement, les échantillons ont été fixés avec de l'alcool éthylique absolu pendant 15 min puis colorés dans 1 % (p/v) ARS (pH 4,2) à température ambiante pendant 5 min. Les cellules colorées ont été lavées deux fois avec de l'eau bidistillée puis photographiées. Pour l'analyse quantitative du processus de minéralisation, 300 μL de chlorure de cétylpyridinium monohydraté à 10 % (p/v) (BOMEI, BOMEI Biotechnology, Hefei, Chine) ont été ajoutés à chaque puits, et les plaques ont été incubées pendant 30 min. Un total de 90 μL de chaque échantillon a été transféré dans une plaque à 96 puits, et l'absorbance a ensuite été mesurée à 405 nm en triplicat.

Coloration de la phosphatase alcaline (ALP) et analyse quantitative

Après que les hWJ-MSCs ont été cultivées dans des plaques à 12 puits avec un milieu ostéogénique jusqu'à 14 jours, la coloration ALP a été réalisée en utilisant un kit de développement de couleur phosphatase alcaline BCIP/NBT (Beyotime). Brièvement, les hWJ-MSCs ont été fixées dans 4 % de paraformaldéhyde. Ensuite, les échantillons ont été colorés dans un mélange de tétrazolium nitro-bleu et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate pendant 4 h et photographiés. Pour quantifier la synthèse d'ALP, les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse RIPA glacé (Beyotime) pendant 30 min. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 12 000 tr/min à 4 °C pendant 10 min, et les surnageants ont subi une analyse quantitative d'ALP en utilisant un kit de dosage ALP (Beyotime). L'absorbance a été mesurée en triplicat à 405 nm et convertie en activité ALP en utilisant une courbe standard.

Dosage immunoenzymatique (ELISA)

Les HUVECs ont été ensemencées à 2 × 10⁵ cellules/puits. Le CM a été collecté des HUVECs cultivées avec des HAPs pendant 18 h (Fichier additionnel 1), et le surnageant a été soumis à une analyse ELISA. Un kit ELISA humain HIF-1α (Anhui Joyee Biotechnics, Anhui, Chine) a été utilisé selon les instructions du fabricant.

Immunofluorescence

Les HUVECs ont été ensemencées sur des lames dans des plaques à 12 puits (7,6 × 10⁴ cellules/puits). Après exposition au CM pendant 18 h, les cellules ont été fixées dans 4 % de paraformaldéhyde (Biosharp, Beijing, Chine) et perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 (Beyotime) dans le PBS avant incubation avec 1 % d'anticorps anti-HIF-1α [EPR16897] (ab179483, Abcam, UK) pendant la nuit à 4 °C. Par la suite, les cellules ont été incubées avec 1 % de CoraLite594-conjugué anticorps anti-lapin IgG(H+L) (Proteintech, USA) dans l'obscurité pendant 1 h. Ensuite, les noyaux ont été teints avec DAPI (Beyotime, Shanghai, Chine), qui a été ajouté aux cellules et réagi pendant 30 s. Les échantillons ont été examinés en utilisant un microscope confocal laser (Olympus, Japon). L'intensité de fluorescence a été quantifiée en utilisant le logiciel d'analyse ImageJ v.1.4 (Bethesda, MD, USA).

Analyse par Western Blot

Les hWJ-MSCs ont été incubées dans le CM pendant 24 h (kinase régulée par signal extracellulaire (ERK)1/2, p-ERK1/2) ou dans un milieu ostéogénique pendant 7 j (facteur de transcription lié à runt (RUNX)-2, collagène de type 1/collagène 1 (COL I)). Ensuite, les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse RIPA pendant 30 min. Les lysats cellulaires ont été centrifugés, et les surnageants ont été stockés à −20 °C pour analyse. Après SDS-PAGE à 12 %, les protéines ont été transférées sur une membrane de polyvinylidène difluorure (PVDF). Les anticorps primaires utilisés étaient anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-RUNX-2, anti-COL I et GAPDH (1:1000, anticorps polyclonaux de lapin ; Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA). Après élimination des anticorps non liés, la membrane a été incubée avec des anticorps secondaires pendant 1 h. Le signal sur les membranes a été détecté en utilisant un système d'imagerie de gel chimiluminescent (LAS4000M ; GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suède). Le rapport de p-ERK à ERK et RUNX-2/COL I à GAPDH a été quantifié en utilisant le logiciel d'analyse ImageJ v.1.4 (Bethesda).

Évaluation de l'apoptose cellulaire

Les hWJ-MSCs ont été ensemencées à une densité de 10⁵ cellules par puits dans des plaques à 6 puits. Les cellules adhérentes ont été traitées avec les concentrations indiquées d'HIF-1α pendant le temps indiqué. Les cellules ont ensuite été collectées et marquées avec FITC-Annexin V et PI (Fcmacs, Nanjing, Chine) pendant 15 min dans l'obscurité. Tous les échantillons ont été testés en utilisant un cytomètre de flux FACScan (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Les données ont été analysées en utilisant FlowJo v10 (BD Biosciences).

Modèle de lignée cellulaire à deux stades

En considérant le potentiel énorme des HAPs et la difficulté d'analyser le système de co-culture, un modèle mathématique était requis qui pourrait fournir une analyse quantitative et une prédiction fiable pour comprendre le rôle de l'HIF-1α dans la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs.

Les hWJ-MSCs ont été cultivées avec 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000 et 4000 pg/mL d'HIF-1α ainsi que du fluide d'induction ostéogénique. Après ajustement des données à ces concentrations, nous utilisons les concentrations d'HIF-1α (produites par les HUVECs) dans les groupes contrôle, m-HAP, np80 et np20 (240, 300, 325 et 375 pg/mL respectivement) pour tester les équations d'ajustement en utilisant MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA). Afin de simplifier le modèle, nous avons considéré leurs motifs de croissance similaires aux différentes concentrations d'HIF-1α comme identiques. Le degré de différenciation moyen a été employé pour ajuster l'équation degré de différenciation-temps. Le taux de prolifération, le taux d'apoptose et les degrés de différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs dans les différents groupes ont été détectés à des temps définis.

Un modèle simplifié de lignée cellulaire à deux stades, qui était similaire à un modèle de lignée cellulaire multi-stades, a été établi selon les données expérimentales. C₀ et C₁ représentent le nombre de cellules des hWJ-MSCs et des cellules terminales respectivement. C₀ et C₁ sont gouvernés par :

dC₀/dt = [(K - C₀ - C₁)/K * p - (p - 1)] * v₀ * C₀

dC₁/dt = (2 - (K - C₀ - C₁)/K * p - p) * v₀ * C₀ - A * C₁

Ici, p, affecté par l'HIF-1α et le temps, représente la probabilité de réplication des hWJ-MSCs. Correspondamment, d = 1 - p est le taux de différenciation qui peut être obtenu en ajustant les données estimées et expérimentales du nombre de cellules. Le paramètre v₀ quantifie la rapidité avec laquelle les cellules se divisent à chaque stade de lignée (en particulier, v = ln2/c, où c est la durée d'un cycle cellulaire). Le taux d'apoptose des cellules terminales est symbolisé par A. Pour simplifier, nous avons négligé que le taux d'apoptose variera légèrement avec le temps, et donc A = 4,5 % est une constante. K désigne la capacité environnementale car les cellules ne pourraient pas subir une prolifération illimitée. L'HIF-1α augmente le taux de différenciation des hWJ-MSCs, conduisant à un taux de différenciation modélisé par :

d = d₀ / (1 + (r*H)^m)

p = 1 - d

Ici, H représente la concentration d'HIF-1α ; d₀ désigne le taux de différenciation à 0 pg/mL d'HIF-1α ; r représente l'intensité de régulation (ici, représentant l'intensité de régulation de l'HIF-1α sur les CSM) ; et m correspond au coefficient de Hill, c'est-à-dire la relation entre le taux de différenciation des CSM et la concentration d'HIF-1α.

Analyse statistique

Toutes les données qui répondent aux exigences de normalité et d'homoscédasticité sont exprimées comme la moyenne ± écart-type (ET) à partir de trois ou plus expériences indépendantes. Le logiciel SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) a été utilisé pour effectuer les analyses statistiques via ANOVA à un facteur ou ANONA à deux facteurs. Une valeur P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. L'analyse statistique est présentée en utilisant GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Résultats

Caractérisation des HAPs

Comme montré dans la figure 2, les HAPs ont été préparés avec une taille et une forme particulières. Les diamètres des np20 avec une forme quasi-sphérique étaient de 20 nm en moyenne, et les np80 étaient en forme de bâtonnet avec une longueur moyenne de 80 nm et une largeur de 20 nm. Les m-HAPs étaient également quasi-sphériques en forme et d'environ 12 μm de diamètre. Toutes les particules avaient une charge de surface négative dans le L-DMEM. Il a été suggéré que les valeurs négatives du potentiel zêta ont un effet favorable significatif sur l'attachement et la prolifération des cellules osseuses, ainsi que sur la liaison osseuse directe et la formation de nouvel os. Les particules, qui ont été observées dans le L-DMEM, ont une tendance à s'agréger dans les systèmes aqueux. Leur taille hydrodynamique a également été testée, ce qui pourrait aussi être un facteur important affectant leurs comportements biologiques.

Toxicité indirecte des HAPs envers les hWJ-MSCs

Pour évaluer la toxicité indirecte des HAPs sur les hWJ-MSCs, la viabilité cellulaire a été mesurée via des tests MTS. Le CM avec 50 µg/mL de HANPs pouvait stimuler significativement la viabilité des hWJ-MSCs après 24 h et 72 h et surtout à 24 h. Cependant, le CM avec 100 µg/mL de HANPs diminuait la viabilité cellulaire de 15 à 20 % par rapport au contrôle après 72 h. De plus, le CM avec 25 µg/mL de np20, mais pas np80, stimulait la viabilité cellulaire après 24 h. Ces phénomènes ont confirmé que 50 µg/mL de HANPs étaient une concentration sous-cytotoxique qui a été utilisée dans toutes les expériences subséquentes.

Effet ostéoinducteur indirect des HAPs sur les hWJ-MSCs

Pour identifier les effets ostéoinducteurs indirects des HANPs sur les hWJ-MSCs, l'expression des gènes ostéogéniques a été évaluée par analyse RT-PCR quantitative. Le niveau de transcrit pour le facteur de transcription lié à runt 2 (RUNX-2) dans les groupes HANP, surtout np20, a présenté une augmentation notable du jour 7 au jour 21. L'expression du gène du collagène de type I (Col I) dans le groupe np20 a démontré une amélioration du jour 7 au jour 21, tandis que le groupe np80 a démontré une augmentation soutenue du jour 7 au jour 14. L'ARNm d'ostéocalcine (OCN) a été clairement surexprimé dans les groupes HANP au jour 14, indiquant un taux d'ostéogenèse accéléré. Les niveaux d'ARNm de la phosphatase alcaline (ALP) ont évidemment augmenté dans les groupes HANP, indiquant la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs. Cependant, le groupe m-HAP a présenté des changements limités en ce qui concerne les niveaux de ces trois gènes ostéogéniques par rapport au groupe contrôle. De plus, l'expression des marqueurs de pluripotence, NANOG, OCT3/4 et SOX2, a diminué dans les groupes HANPs par rapport au contrôle, impliquant que les hWJ-MSCs dans les groupes HANPs s'étaient différenciées, surtout dans le groupe np20. Des résultats similaires ont été obtenus par analyse Western blot, indiquant que le groupe np20 pouvait indirectement améliorer l'expression de RUNX-2 et COL I dans les hWJ-MSCs.

Pour observer visuellement l'effet ostéoinducteur indirect des HANPs sur les hWJ-MSCs, les cellules ont été incubées avec le milieu ostéogénique indiqué pendant 14 j, suivies de colorations ARS et ALP. Comme montré, un nombre accru de nodules minéralisés et une activité ALP plus élevée des hWJ-MSCs ont été observés dans les groupes HANP par rapport aux groupes m-HAP et contrôle. De plus, m-HAP, similaire au contrôle, a démontré des effets limités sur la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs.

Les HAPs activent la signalisation ERK1/2 dans les hWJ-MSCs co-cultivées indirectement avec les HUVECs

Pour investiguer les effets sur la fonction paracrine des HUVECs par les HAPs, des essais d'immunofluorescence et ELISA ont été utilisés pour identifier la protéine possible favorisant la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs. Comme montré, la production intracellulaire et extracellulaire d'HIF-1α a été significativement facilitée par les HANPs (surtout np20), tandis qu'il y avait un effet limité de m-HAP sur sa production.

Pour comprendre plus précisément la voie de signalisation de différenciation des hWJ-MSCs activée par l'HIF-1α, nous avons examiné les régulateurs clés de la voie ERK1/2 via analyse Western blot. Comme montré, alors que les niveaux de protéine de l'ERK1/2 total restaient inchangés, les niveaux de p-ERK1/2 étaient distinctement augmentés dans les hWJ-MSCs cultivées avec des HANPs, et cela était particulièrement vrai dans le groupe np20. Cependant, m-HAP avait peu d'effet sur les niveaux de p-ERK1/2 dans les hWJ-MSCs, similaire à son effet sur la production d'HIF-1α dans les HUVECs. Important, les niveaux augmentés de p-ERK1/2 dans les hWJ-MSCs activés par l'HIF-1α pouvaient être bloqués par 2-MeOE2, un inhibiteur spécifique de l'HIF-1α, indiquant que l'HIF-1α fonctionnait en amont de la voie de signalisation ERK1/2 dans les hWJ-MSCs.

L'HIF-1α favorise la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs via la voie ERK1/2

Pour déterminer si l'HIF-1α était nécessaire pour la stimulation observée de la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs, un inhibiteur spécifique de l'HIF-1α (2-MeOE2) a été appliqué à ces cultures cellulaires. Comme montré, la déposition de matrice minéralisée et l'activité ALP du groupe hWJ-MSCs traité 2-MeOE2(+) cultivées dans un milieu ostéogénique étaient affaiblies, indiquant que l'HIF-1α était indispensable pour la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs. Basé sur ces résultats, nous avons exploré davantage le rôle de la voie ERK1/2 dans la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs activée par l'HIF-1α. La déposition de matrice minéralisée et l'activité ALP dans les hWJ-MSCs cultivées avec un milieu ostéogénique étaient supprimées suivant l'administration de PD98059, un inhibiteur spécifique de MEK.

Modèles de lignée cellulaire à deux stades

Pour révéler quantitativement la connexion intrinsèque entre la concentration d'HIF et la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs, 0–4000 pg/mL d'HIF-1α a été utilisé pour traiter huit groupes de hWJ-MSCs. Un modèle mathématique de lignée cellulaire à deux stades a été utilisé pour analyser les taux de prolifération, d'apoptose et de différenciation ostéogénique de ces hWJ-MSCs traités avec différentes concentrations d'HIF-1α. Comme montré, les données d'ajustement ont été employées pour obtenir la formule simulée (d/d₀ = 1/(0,14H² - 0,43H + 1)) et la courbe (courbe bleue), montrant que le taux de différenciation augmentait d'abord puis diminuait avec l'augmentation de la concentration d'HIF. Plus spécifiquement, le taux de différenciation atteignait un pic à 1500 pg/mL d'HIF-1α.

Selon notre étude, les concentrations d'HIF-1α produites par les HUVECs dans les groupes contrôle, m-HAP, np80 et np20 étaient de 240, 300, 325 et 375 pg/mL respectivement. Le carré noir représente le taux de différenciation promu par 240, 300, 325 et 375 pg/mL d'HIF-1α, et cela correspond bien à la courbe simulée. De plus, les degrés de différenciation des hWJ-MSCs (activité ALP relative) traités avec différentes concentrations d'HIF-1α augmentaient de manière similaire avec le temps. Par conséquent, afin de simplifier le modèle, nous considérons leurs motifs de croissance comme similaires ou même identiques. Nous avons trouvé que l'augmentation de l'activité ALP du jour 0 au jour 7 était proportionnelle au nombre d'ostéoblastes, et les cellules ostéoblastes atteignaient leur pic à la période de plateau. Par conséquent, après ajustement de l'activité ALP avec la courbe du nombre d'ostéoblastes relatif (nombre de cellules ostéoblastes / nombre maximum de cellules ostéoblastes), le maximum d'activité ALP a été prédit et l'activité ALP relative (activité ALP / maximum d'activité ALP), représentant le degré de différenciation, a été acquise. En combinant ces deux études, la surface tridimensionnelle du degré de différenciation évoluant avec le temps et l'HIF-1α a été obtenue.

Afin d'estimer le temps de culture optimal, il était nécessaire de simuler les nombres de cellules. Après élucidation du taux de différenciation sous différentes concentrations d'HIF-1α, nous avons simulé la taille de chaque population. La simulation a utilisé une densité d'ensemencement initiale de 1500 cellules par puits (dans une plaque à 96 puits) en utilisant différentes concentrations d'HIF-1α. Comme montré, les données expérimentales (carré noir) correspondent bien aux nombres totaux de cellules simulés (courbe bleue), qui est une somme du nombre de hWJ-MSCs et d'ostéoblastes, et cela soutient la capacité de ce modèle à prédire le nombre de hWJ-MSCs et d'ostéoblastes à tout moment. De plus, le nombre de cellules ostéoblastes approchait la période de plateau à 21, 18 et 15 jours avec 0, 375 et 1500 pg/mL d'HIF-1α respectivement. Ce modèle fournit le temps de culture optimal pour guider l'ingénierie tissulaire, et il fournit également une preuve directe que l'HIF-1α accélère la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs.

Discussion

Avec les avancées récentes dans les nanobiomatériaux, les substituts osseux artificiels à base de nano ont été un domaine d'investigation intense. Les preuves accumulées suggèrent qu'il existe des interactions complexes entre les cellules et les nanobiomatériaux en raison de leur capacité à pénétrer les membranes cellulaires et à augmenter les temps de rétention interne. Une étude précédente a révélé que les nanofilms collagène/alginate peuvent s'adsorber sur la membrane des CSM pour activer les cascades de signalisation intracellulaires et promouvoir la différenciation ostéogénique. Des expériences élégantes de Wu et ses collègues ont clairement démontré que les nanotubes de TiO₂ peuvent améliorer la vascularisation et la différenciation ostéogénique en facilitant les effets paracrines et les jonctions cellulaires via les interactions CE-CSM. Dans le but de développer d'excellents candidats pour l'ingénierie des tissus osseux, il est nécessaire de clarifier le crosstalk direct entre les substituts osseux à base de nano et les cellules impliquées dans la réparation osseuse ainsi que leurs interactions indirectes. Cependant, notre compréhension actuelle de cela est encore limitée. Dans l'étude présente, nous avons utilisé un modèle de co-culture indirecte pour élucider davantage les effets biologiques des HANPs sur les CSM en ce qui concerne les interactions indirectes médiatisées par les CE.

La cytotoxicité est un problème principal pour évaluer la biocompatibilité de tout nanobiomatériel. Bien que notre étude précédente ait trouvé que les HANPs n'influençaient pas directement la viabilité ou l'apoptose des hWJ-MSCs, elles peuvent encore exercer des impacts différents via la médiation d'autres cellules. Ainsi, il était nécessaire d'évaluer les effets cytotoxiques des HANPs sur les hWJ-MSCs médiatisés par les HUVECs. Intéressant, après incubation dans le CM pendant 24 h et 72 h, la viabilité des hWJ-MSCs était maintenue et même élevée dans les groupes 0–50 µg/mL HANP, surtout dans le groupe np20, indiquant l'existence de molécules effectrices dans le CM. Lorsque la concentration de HANPs atteignait 100 µg/mL, elles devenaient cytotoxiques pour les hWJ-MSCs. Cependant, 0–100 µg/mL m-HAP n'avait aucune influence sur la viabilité des hWJ-MSCs. Jiang et al. ont montré que des nanoparticules conçues d'une taille particulière peuvent avoir des voies endocytiques et des cinétiques distinctes associées à une signalisation en aval altérée impliquée dans la régulation des fonctions des cellules cibles. Dans notre étude précédente, nous avons montré que np20 et np80 étaient endocytosés par les HUVECs, et cela a été suivi de changements morphologiques et de l'apparition de grandes vacuoles, indiquant l'état activé des HUVECs. De plus, np20, avec leur vitesse d'absorption plus rapide et leur accumulation accrue, pourrait résulter en une activation plus forte des HUVECs, résultant possiblement en une viabilité accrue des hWJ-MSCs via la signalisation paracrine. Inversement, peu de m-HAPs peuvent être endocytosés par les HUVECs, et cela pourrait expliquer leur influence limitée sur le métabolisme des hWJ-MSCs.

Pour explorer davantage l'effet ostéoinducteur potentiel des HUVECs activées, une dose sous-cytotoxique de 50 µg/mL de HAPs a été utilisée dans les études subséquentes. Le CM collecté des HUVECs activées a promu la déposition de calcium extracellulaire, l'activité ALP et l'expression des protéines ostéogéniques dans les hWJ-MSCs, ainsi que l'expression d'ARNm des gènes ostéogéniques. Runx2, un facteur de transcription essentiel impliqué dans la spécification de la lignée ostéoblastique, a montré une amélioration substantielle dans le groupe np20, indiquant un fort effet ostéoinducteur sur les hWJ-MSCs. Le groupe np20 a démontré une amélioration de 1,5 fois de l'expression de COLI au jour 7 et une double augmentation au jour 14, ce qui impliquait la présence d'ostéoblastes différenciés supplémentaires dans les groupes traités par HANP. L'OCN est un marqueur osseux de stade mature, et ce gène a montré une augmentation significative dans les groupes HANP au jour 14, indiquant que np20 et np80 peuvent accélérer la maturation osseuse par rapport à m-HAP. L'ALP est un marqueur précoce de la différenciation ostéoblastique, et elle a évidemment augmenté avec le temps de culture dans chaque groupe, surtout le groupe np20, révélant qu'une transformation supplémentaire s'est produite des CSM vers les ostéoblastes. Les marqueurs de pluripotence, NANOG, OCT3/4 et SOX2 impliquent la capacité de différenciation. Comme montré, l'expression diminuée dans les gènes des groupes HANP impliquait que la plupart des hWJ-MSCs dans les groupes HAP s'étaient transformées en ostéoblastes.

Nos données ont démontré que l'endocytose des HANPs par les HUVECs était associée à une différenciation ostéogénique améliorée des hWJ-MSCs. Cependant, la cause de ce résultat est actuellement floue. En termes de fonction paracrine des HUVECs, nous nous sommes concentrés sur les protéines inductrices de différenciation solubles dans le surnageant des HUVECs activées. La signalisation HIF-1α est essentielle dans le couplage de l'ossification et de l'angiogenèse pendant la régénération osseuse. Heikal et al. ont rapporté que les CE blessées sécrètent plus d'HIF-1α même sous conditions de normoxie. Il a également été montré que l'exposition aux HANPs inhibe la capacité angiogénique des HUVECs. Ainsi, nous avons mesuré les concentrations d'HIF-1α dans le CM, et les résultats ont montré que le contenu en HIF-1α augmentait dans les groupes de traitement HANP par rapport aux groupes m-HAP et contrôle. Pour identifier le rôle de l'HIF-1α dans la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs, nous avons utilisé 2-MeOE2, qui est un inhibiteur spécifique de l'HIF-1α. La concentration diminuée d'HIF-1α parallélisait la déposition de matrice minéralisée altérée et l'activité ALP dans ces hWJ-MSCs, indiquant que les HANPs peuvent promouvoir la production d'HIF-1α des HUVECs pour faciliter l'ostéogenèse des hWJ-MSCs.

Pour appliquer correctement les HANPs pour une utilisation dans l'ingénierie des tissus osseux, il est nécessaire d'obtenir plus d'informations sur les mécanismes par lesquels les HANPs favorisent la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs médiatisées par les HUVECs. La voie ERK1/2 est en aval de l'HIF-1α et est fondamentale pour la différenciation des CSM. Dans ce travail, les concentrations d'HIF-1α dans le CM coïncident bien avec les niveaux de p-ERK1/2 dans les hWJ-MSCs. Lorsque 2-MeOE2 a été appliqué, l'expression de p-ERK1/2 dans les hWJ-MSCs n'a pas pu être activée, indiquant que l'HIF-1α fonctionnait en amont de la signalisation ERK1/2. Pour aborder directement le rôle de la signalisation ERK1/2 dans la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs, PD98059, un inhibiteur spécifique de MEK, a été utilisé. La suppression de la signalisation ERK1/2 a entraîné la plus faible différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs. Une raison possible de cette occurrence est que la voie ERK1/2 joue un rôle clé à la fois dans la signalisation HIF-1α et dans les voies de signalisation d'apoptose et de prolifération, qui pourraient être responsables des changements observés dans la différenciation ostéogénique dans ces cellules. De plus, cela pourrait également être lié à la présence du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Le VEGF est l'un des effecteurs en aval de la signalisation HIF-1α, et il peut également promouvoir la différenciation ostéogénique des CSM via l'activation de la voie ERK1/2. Notre étude précédente a trouvé que np20 induisait la production de VEGF dans les HUVECs ; par conséquent, il est possible que la suppression de la voie ERK1/2 puisse entraîner l'inhibition du VEGF, ce qui mènerait à la diminution de la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs. Selon les résultats expérimentaux disponibles, nous pouvons résumer comme suit. Les HANPs sont capables de traiter de manière plus optimale de meilleurs effets ostéoinducteurs directs et indirects que les m-HAPs. Comparées aux greffes osseuses autogènes et allogéniques, il existe une source extensive d'HANP et sans dommage secondaire et immunogénicité potentielle. Cependant, comparées aux m-HAPs, les HANPs peuvent supprimer la capacité angiogénique des HUVECs et présenter une cytotoxicité légère à la fois de manière temps- et dose-dépendante.

Récemment, des preuves croissantes ont démontré l'importance de l'HIF-1α dans la régénération osseuse. Cependant, peu d'études ont été en mesure de prédire quantitativement le taux de différenciation des CSM sous des conditions initiales spécifiques, telles que la concentration d'HIF-1α. En tenant compte de la prolifération cellulaire, de l'apoptose et de la différenciation ostéogénique, nous présentons un modèle mathématique qui combine une lignée cellulaire à deux stades avec l'HIF-1α qui est hautement corrélé avec nos données expérimentales. En ajustant le taux de différenciation des hWJ-MSCs dans 0–4000 pg/mL d'HIF-1α, nous avons acquis les équations pour décrire le taux de différenciation, la concentration d'HIF-1α et le temps. Comme montré, ce modèle peut dépeindre la carte du nombre de cellules sous différentes concentrations d'HIF-1α, de sorte qu'il est possible d'explorer la dynamique intrinsèque du système à deux stades. De plus, ce modèle valide mathématiquement l'effet de l'HIF-1α sur la différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs. De plus, basé sur un modèle de lignée cellulaire multi-stades et un modèle logistique, notre modèle est suffisamment stable pour permettre des prédictions à long terme sans tomber dans le piège de l'explosion illimitée de la population.

En utilisant les données expérimentales existantes, à la fois le nombre de cellules et le taux de différenciation peuvent être prédits avec une densité d'ensemencement cellulaire initial définie et une concentration d'HIF-1α. En tant que tel, le temps d'incubation optimal est également obtenu. Par conséquent, nous pouvons prédire la concentration optimale d'HIF-1α et déterminer le moment le plus optimal pour l'ostéogenèse, ce qui est important pour une ingénierie tissulaire efficace. Un modèle de lignée cellulaire à deux stades est applicable pour prédire la prolifération et la différenciation des cellules souches, qui ont deux lignées cellulaires. Sur cette base, le modèle fondé sur les conditions initiales et les données expérimentales existantes peut être établi pour identifier les conditions de culture optimales in vitro, ce qui aidera à optimiser la réparation osseuse in vivo.

Conclusion

Dans cette étude, nous avons exploré les effets biologiques spécifiques des HANPs sur les hWJ-MSCs médiatisés par les HUVECs. Comparées aux m-HAPs, tanto np20 que np80 ont montré une cytotoxicité légère à la fois de manière temps- et dose-dépendante. Important, la taille des HANPs ne semblait pas avoir d'impact significatif sur cette cytotoxicité. Nos données ont également montré que les HANPs, surtout np20, étaient capables de faciliter les HUVECs à sécréter des niveaux accrus d'HIF-1α, qui corrélait directement avec la différenciation ostéogénique améliorée des hWJ-MSCs via l'activation de la voie ERK1/2. Plus remarquablement, les résultats du modèle de lignée cellulaire à deux stades suggéraient que l'HIF-1α exerçait un effet stimulateur dose-dépendant sur le taux de différenciation ostéogénique des hWJ-MSCs. De plus, la concentration optimale d'HIF-1α et le temps d'incubation ont été estimés sur la base des conditions initiales en utilisant un modèle in vitro, ce qui pourrait être inestimable à l'avenir pour les applications d'ingénierie tissulaire. Collectivement, ces observations fournissent la preuve que les HANPs peuvent améliorer la régénération osseuse en modulant les interactions cellule-cellule.