Nanofibres Gelatine/Polycaprolactone enrichies en Sulfate de Chondroïtine : Échafaudage antithrombogène avec une affinité endothéliale supérieure pour l'ingénierie tissulaire des vaisseaux sanguins

Résumé

Les nanofibres polymères électrofilées ont suscité beaucoup d'attention dans l'ingénierie tissulaire des vaisseaux sanguins. Cependant, les matériaux nanofiber conventionnels avec les déficiences de l'endothélialisation lente et de la thrombose ne sont pas efficaces pour promouvoir la réparation et la régénération des tissus vasculaires. Ici, des nanofibres composites biomimétiques de gélatine (Gt)/polycaprolactone (PCL) incorporant différentes quantités de sulfate de chondroïtine (CS) ont été développées via la technologie d'électrofilage pour étudier leurs effets sur l'antithrombogénicité et l'affinité des cellules endothéliales. La variation des concentrations de CS dans les nanofibres PG affecte la morphologie et le diamètre des fibres. Les nanofibres CS/Gt/PCL ont une porosité appropriée (~ 80%) et une absorption de solution PBS (jusqu'à 650%). L'introduction de CS dans les nanofibres Gt/PCL améliore considérablement leurs propriétés anticoagulantes, prolonge leur temps de coagulation et facilite les réponses cellulaires. Particulièrement, les nanofibres 10%CS/Gt/PCL affichent une adhérence, une élongation et une prolifération cellulaires favorables. Ainsi, les nanofibres Gt/PCL contenant une certaine quantité de CS pourraient être d'excellents candidats comme échafaudage d'ingénierie tissulaire prometteur dans la réparation et la régénération des vaisseaux sanguins.

Introduction

Le développement de matériaux nanofiber a suscité beaucoup d'attention en tant qu'échafaudages biomimétiques dans la réparation et la régénération tissulaire en raison de leurs caractéristiques (bio)physicochimiques uniques, y compris leur structure de fibres ultrafines semblable à la matrice extracellulaire (MEC), d'excellentes propriétés mécaniques, une grande surface spécifique et une porosité élevée avec interconnectivité [1, 2]. Il a été démontré que les structures nanofiber jouent un rôle clé dans la médiation des réponses cellulaires, telles que l'adhésion cellulaire, la morphologie (par exemple, étalement, alignement, élongation, etc.), l'arrangement, la migration, la prolifération, le phénotype et la différenciation via la guidance de contact [3,4,5]. Alors que de nombreuses stratégies de nano-fabrication (par exemple, nanoskiving, synthèse par template, séparation de phase, etc.) ont fourni une technologie disponible pour fabriquer des matériaux nanofiber, l'électrofilage est l'une des méthodes les plus efficaces pour fabriquer des nanofibres à partir de différents matériaux (métaux, céramiques, polymères, matériaux composites, etc.) à l'échelle industrielle [6,7,8].

En plus des signaux (bio)physiques, la sélection de biomatériaux appropriés peut affecter significativement les activités cellulaires ainsi que la réparation et la régénération tissulaire [9]. Certaines caractéristiques clés, telles que la biocompatibilité, la biodégradabilité, les propriétés mécaniques et la bio-fonction, doivent être considérées [9, 10]. Comparé aux composites naturel/natuel et synthétique/synthétique, les matériaux nanofiber composites consistant en polymères naturels et synthétiques ont reçu plus d'attention en raison de la combinaison des excellentes caractéristiques biologiques des polymères naturels et de la résistance mécanique des polymères synthétiques [9]. Parmi eux, la combinaison gélatine (Gt)/polycaprolactone (PCL) est l'un des systèmes hybrides naturel-synthétique les plus représentatifs étudiés et est largement utilisé dans l'ingénierie tissulaire vasculaire sanguine [11,12,13,14]. Cependant, les nanofibres composites Gt/PCL ont encore certaines limitations, telles que l'endothélialisation lente et la thrombose. Récemment, le sulfate de chondroïtine (CS) est un polysaccharide sulfaté contenant du glycosaminoglycane et de la galactosamine, qui a été démontré pour posséder une haute adhésion aux cellules endothéliales (CE), une faible interaction avec les protéines et les plaquettes, ainsi qu'une répulsion électrostatique des composants sanguins chargés négativement [15,16,17]. De plus, le CS pourrait inhiber l'apoptose cellulaire et faciliter la guérison des plaies vasculaires [18, 19]. Par conséquent, les nanofibres électrofilées Gt/PCL (PG) incorporant du CS seraient d'excellents candidats comme échafaudage d'ingénierie tissulaire bio-instructif pour la réparation et la régénération vasculaire sanguine.

Dans le présent travail, des nanofibres composites biomimétiques PG contenant différents rapports de CS ont été développées via l'électrofilage en une étape. La morphologie, la caractéristique chimique, la porosité et la dégradation des nanofibres composites CS/PG ont été détectées par différentes techniques de caractérisation. L'anticoagulation des nanofibres composites PG/CS a été évaluée. De plus, ces nanofibres composites avec différents rapports de CS ont été ensemencées avec des cellules endothéliales aortiques humaines (CEAH) pour étudier leurs effets sur les réponses cellulaires.

Matériaux et Méthodes

Matériaux

CS (trachée bovine, type A, pureté : 95%) a été fourni par Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (Chine). PCL a été obtenu de Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (Chine). Gt (peau bovine, type B) a été obtenu de Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd., (Chine). Le kit de temps de thromboplastine partielle activée (TTPa) a été acheté auprès de Leigen Biotechnology Co., Ltd (Chine). L'acide acétique (pureté : 99,5%) a été acheté auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Chine). Les cellules endothéliales aortiques humaines (CEAH) ont été obtenues de l'hôpital affilié de l'Université de Qingdao (Chine). Le milieu de culture Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12), le sérum fœtal bovin (SFB), 0,25% trypsine-EDTA ont été achetés auprès de Biological Industries (Israël). Tous les réactifs ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (Chine) sauf indication contraire. L'eau utilisée dans toutes les expériences était déionisée.

Électrofilage des nanofibres

PCL (10% p/v) a été dissous dans l'acide acétique sous agitation mécanique à température ambiante pendant 4 h. Gt (10% p/v) a été dissous dans l'acide acétique à 90% avec agitation constante pendant 2 h. CS à différentes concentrations a été ajouté dans la solution de Gt et agité doucement à température ambiante pendant 1 h pour obtenir les solutions homogènes contenant 5, 10 et 15% en poids de CS par rapport à la concentration totale de polymère. Ensuite, la solution PG a été préparée en mélangeant les deux solutions ci-dessus dans un rapport de poids de 50/50 (p/p) sous agitation pendant 2 h, nommées 5%CS@PG, 10%CS@PG et 15%CS@PG.

Les solutions homogènes préparées ont été soumises au processus d'électrofilage, équipé d'une seringue de 1 mL avec une aiguille 21 G et un collecteur recouvert de papier d'aluminium. Dans cette étude, la distance entre la plaque de collecte et la pointe de l'aiguille a été fixée à environ 18 cm, la tension a été réglée à 23 kV, et les solutions polymères ont été pompées à un débit de 1 mL/h. Toutes les solutions ont été électrofilées dans un instrument d'électrofilage (Technology, Tk602TH, Chine) à température ambiante et humidité soigneusement contrôlée (< 40%). Avant toute expérience supplémentaire, les échantillons ont été mis dans un four de séchage sous vide pendant au moins 72 h pour éliminer tout solvant résiduel.

Microscopie Électronique à Balayage (MEB) et Microscope Électronique à Transmission (MET)

La morphologie des échafaudages nanofiber CS@PG a été étudiée par un MEB (VEGAS, TESCAN, République tchèque) à une tension d'accélération de 20 kV à température ambiante. Le diamètre des nanofibres (n = 100) a été mesuré plus loin à partir des images MEB en utilisant un logiciel d'analyse d'image (Image J).

Les observations MET et les analyses de spectroscopie à dispersion d'énergie par rayons X (EDX) ont été réalisées en utilisant un JEOL JEM-2100 plus (Japon).

Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier (FTIR)

Le FTIR a été réalisé par un spectromètre FTIR Nicolet iN10 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pour évaluer les groupes fonctionnels caractéristiques de CS, nanofibre PG et nanofibres CS@PG. Les spectres des échantillons ont été enregistrés en mode transmission sur une gamme de longueurs d'onde de 4000-500 cm⁻¹ avec une résolution de 2 cm⁻¹.

Porosité et Absorption de Solution Phosphate-Tamponnée (PBS)

La porosité des nanofibres a été réalisée en utilisant la méthode de déplacement de liquide. Premièrement, le poids sec des nanofibres a été pesé comme W₁. Ensuite, quatre groupes de nanofibres ont été immergés dans l'éthanol pendant 2 h à 25 °C et pesés comme W₂. L'éthanol sur la surface de l'échantillon a été enlevé par papier filtre, et les poids des échantillons ont été notés comme W₃. La porosité des nanofibres a été calculée par la formule suivante :

$${\text{Porosité}}\left( \% \right) = \left( {W_{3} - W_{1} } \right)/\left( {W_{3} - W_{2} } \right) \times 100$$

Pour le test d'absorption de solution PBS, les nanofibres obtenues ont été pesées à l'état sec et enregistrées comme Wd. Ensuite, les nanofibres ont été trempées dans PBS pendant 24 h à 25 °C et le poids à l'état humide a été enregistré comme Ww après avoir enlevé l'excès de liquide sur la surface de l'échantillon. Le rapport de gonflement peut être mesuré par l'équation suivante :

$${\text{Absorption}}\;{\text{PBS}}\left( \% \right) = \left( {W_{{\text{W}}} - W_{{\text{d}}} } \right)/W_{{\text{d}}} \times 100$$

Toutes les valeurs dans les expériences ci-dessus sont exprimées en moyenne ± ET (n = 3).

Comportement de Dégradabilité In Vitro

Pour déterminer la résistance des nanofibres obtenues à la lysozyme, la dégradabilité des échantillons a été mesurée à un moment programmé (1, 4, 7, 10 et 14 jours). Le poids initial des nanofibres a été enregistré comme W_i. Ensuite, les échantillons ont été immergés dans une solution PBS (pH 7,4) contenant de la lysozyme (500 μg/mL) et incubés in vitro à 37 °C. Aux intervalles de dégradation prédéterminés, chaque groupe d'échantillons a été retiré et lavé à l'eau déionisée, et lyophilisé pour obtenir le poids final (W_f). La solution de lysozyme a été changée trois fois par semaine. La masse restante (%) des échafaudages nanofiber a été estimée comme définie dans la formule suivante :

$${\text{Masse}}\;{\text{restante}}\left( \% \right) = \left( {1 - \frac{{w_{i} - w_{f} }}{{w_{i} }}} \right) \times 100\%$$

Pour évaluer le comportement de dégradation de l'échantillon après 7 jours, la morphologie des nanofibres a été observée par MEB.

Analyse de la Compatibilité Hémocompatible

Temps de Coagulation

Le temps de thromboplastine partielle activée (TTPa) a été utilisé pour évaluer l'activité des voies intrinsèques et communes de la coagulation en testant les temps de coagulation du plasma pauvre en plaquettes (PPP) après incubation avec les nanofibres électrofilées sur lamelles. Pour cela, du sang anticoagulé (environ 10 mL) a été collecté et centrifugé à 3000 tr/min pendant 20 min pour obtenir du plasma pauvre en plaquettes (PPP). Chaque échantillon a été incubé avec 200 μL de PPP pendant 10 min à 37 °C et analysé en utilisant le kit TTPa suivant les instructions du fabricant (n = 3).

Test d'Hémolyse

Le taux d'hémolyse a été évalué en mesurant la concentration d'hémoglobine libérée dans la phase de solution à partir des érythrocytes dans le sang total dilué exposé aux nanofibres électrofilées. Les échantillons sur lamelles ont été placés individuellement dans des plaques à 24 puits et immergés dans 2 mL PBS à 37 °C pendant 30 min. Les groupes contrôle négatif contenaient seulement 2 mL de PBS, tandis que les groupes contrôle positif étaient composés de 2 mL d'eau déionisée dans le but d'induire une lyse maximale des érythrocytes (n = 3 pour chaque groupe de test). Ensuite, 40 μL de sang total frais anticoagulé susmentionné a été ajouté dans chaque puits et incubé pendant 60 min à 37 °C, après quoi les suspensions ont été retirées dans des tubes de centrifugeuse et centrifugées à 100× g pendant 5 min. Les surnageants ont été soumis à la mesure de l'absorbance à 570 nm en utilisant un lecteur de microplaques (SynergyH1/H1M, BioTek, Chine).

Thrombogénicité

Le potentiel thrombogénique a été évalué in vitro après incubation des échantillons électrofilés avec le plasma riche en plaquettes (PRP). Le PRP a été préparé par centrifugation (1500 tr/min, 20 min) et la moitié supérieure du plasma a été jetée. Ensuite, les nanofibres sur lamelles ont été incubées dans 100 μL de PRP à 37 °C pendant 2 h et rincées délicatement avec PBS trois fois pour les expériences subséquentes. Pour évaluer l'activité plaquettaire après incubation avec PRP, les nanofibres électrofilées ont été maintenues dans le DMEM supplémenté avec 10% SFB pendant 2 h et 24 h, et ensuite un kit d'essai CCK-8 a été utilisé pour mesurer la viabilité des thrombocytes sur les nanofibres. CCK-8 (20 μL) a été ajouté à 200 μL de milieu DMEM sans sérum dans des plaques à 24 puits et incubé pendant 1 h. Finalement, les suspensions ont été mesurées par un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de 450 nm.

Culture Cellulaire et Viabilité Cellulaire

Les cellules endothéliales aortiques humaines (CEAH) ont été cultivées dans du DMEM supplémenté avec SFB (10%, v/v), et streptomycine/pénicilline (1%, v/v) dans une atmosphère de 37 °C et 5% CO₂. Le milieu de culture a été remplacé trois fois par semaine. Les cellules ont été généralement isolées par 0,05% trypsine/EDTA pendant 3 min, centrifugées à 1000 tr/min, et suspendues dans le milieu frais pour effectuer le passage cellulaire ou l'ensemencement cellulaire.

Avant l'ensemencement cellulaire, tous les matériaux nanofiber dans une plaque à 24 puits ont été stérilisés sous irradiation UV pendant 1 h et immergés dans 75% d'éthanol (v/v, %) pendant 1 h. Ensuite, les nanofibres ont été rincées quatre fois avec une solution PBS et trempées dans du DMEM pendant 12 h dans un incubateur CO₂. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 1 × 10⁴ cellules par puits sur les nanofibres et le milieu a été remplacé tous les jours. Après co-culture de 24 h, les cellules ont été lavées par solution PBS trois fois et puis colorées avec un kit de double coloration Calcein-AM/IP (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine). IP a été utilisé pour colorer les cellules mortes et Calcein-AM pour colorer les cellules vivantes.

Morphologie Cellulaire sur les Nanofibres

Pour observer l'adhésion cellulaire sur les nanofibres, la morphologie des cellules a été observée après co-culture de 24 h par Microscope à Fluorescence (Nikon A1 MP, Japon). Premièrement, les cellules ont été fixées avec 4% de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 30 min. Ensuite, une solution de Triton X-100 à 0,5% a été utilisée pendant 5 min pour perméabiliser la membrane cellulaire. Finalement, le 4'6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été utilisé pour colorer les noyaux cellulaires et la rhodamine-phalloïdine a été utilisée pour colorer le F-actine. Une analyse quantitative (densité cellulaire, aire monocellulaire, élongation cellulaire) a été effectuée plus loin avec Image J.

Prolifération Cellulaire

L'activité de prolifération cellulaire sur les nanofibres composites a été réalisée avec un kit d'essai CCK-8. Les CEAH ont été ensemencées sur les nanofibres à une densité de 8 × 10³ cellules/puits. Le milieu de culture a été changé tous les deux jours. Après 1, 4, 7 jours de co-culture, les cellules ont été lavées par solution PBS pour enlever les cellules non adhérentes. Ensuite, 20 μL CCK-8 et le milieu complet à un rapport de volume de 1:10 ont été ajoutés dans la plaque à 24 puits pendant 1 h à l'incubateur. L'absorbance a été testée par Lecteur Elisa à 450 nm.

La coloration cellulaire avec DAPI et rhodamine-phalloïdine a été réalisée avec un Microscope à Fluorescence pour observer directement les changements de nombre de cellules après co-culture avec différentes nanofibres pendant deux jours et six jours.

Analyse Statistique

Tous les échantillons dans les expériences ont été traités en triplicat. Toutes les données sont représentées en moyennes ± écarts-types (ET). L'analyse statistique des échantillons a été déterminée par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) pour comparer les différences avec une signification assignée à p < 0,05.

Résultats et Discussion

Préparation et Caractérisation des Nanofibres CS@PG

La Figure 1 affichait le diagramme schématique du processus d'électrofilage pour les échafaudages nanofiber CS@PG et l'évaluation in vitro de l'anticoagulation et de la cytocompatibilité. Pour développer des échafaudages de tissus vasculaires ingénierisés pour promouvoir la prolifération des cellules endothéliales, différents rapports de CS (5, 10 et 15% en poids) ont été incorporés dans des solutions PG (10%, v/v) pour fabriquer des nanofibres composites via le processus d'électrofilage.

La MEB a été réalisée pour observer la structure des nanofibres électrofilées CS@PG. Comme montré dans la Fig. 2, les images MEB des nanofibres PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG présentaient une architecture fibreuse dense, contenant des fibres continues, lisses et à l'échelle nanométrique par la technique d'électrofilage. Les nanofibres PG (Fig. 2a) affichaient de nombreuses perles irrégulières sur les nanofibres à travers le processus d'électrofilage, ayant un diamètre moyen de 406,01 ± 146,28 nm. Cela pourrait s'expliquer par le fait que la solution d'électrofilage à 10% p/v présentait une faible viscosité, résultant dans la formation de nanofibres inhomogènes contenant des perles [20]. Avec l'augmentation de la quantité de CS dans la solution polymère de 5 à 10% en poids, des nanofibres homogènes sans perles pouvaient être obtenues en raison de l'augmentation de la viscosité de la solution (Fig. 2b, c). Correspondamment, 5%CS@PG et 10%CS@PG montraient un diamètre moyen plus petit de 382,35 ± 152,99 nm et 300,29 ± 100,85 nm, respectivement. Ce résultat est principalement dû au fait que l'augmentation de la teneur en CS a correspondamment amélioré la conductivité de la solution d'électrofilage [20]. Cependant, lorsque la concentration de polymère était jusqu'à 15%, la viscosité de la solution polymère est trop élevée pour être étirée dans le champ électrique. Au même débit de 1 mL/h que les groupes précédents, nous avons observé que sous la tension appliquée de 23 kV, le phénomène d'obstruction de la pointe de l'aiguille est apparu et le cône de Taylor n'a pas pu être observé. Donc, le débit de la solution électrofilée et la tension appliquée ont été ajustés à 0,9 mL/h et 20 kV, respectivement. Les nanofibres 15%CS@PG ont été produites avec succès avec un diamètre moyen de 266,92 ± 105,43 nm.

Comme représenté dans la Fig. 3a, il a été trouvé que le CS était uniformément distribué dans les nanofibres 5%CS@PG et 10%CS@PG. Cependant, une agrégation de CS a été détectée dans les fibres 15%CS@PG. Comme indiqué dans la Fig. 3b, une analyse élémentaire EDX a été réalisée pour détecter la teneur en soufre des fibres préparées. Comme prévu, la teneur en soufre a augmenté avec une concentration accrue de CS dans les fibres obtenues.

Analyse des Spectres FTIR

L'analyse des spectres FTIR a été réalisée pour déterminer les pics d'absorption caractéristiques des groupes chimiques des échafaudages nanofiber préparés. Le spectre FTIR de PG et CS étaient considérés comme le groupe contrôle pour comparer avec les groupes nanofibre CS@PG. Dans le spectre PG, des bandes d'absorption fortes apparaissant à 3300 cm⁻¹ et 2935 cm⁻¹ peuvent être attribuées aux vibrations d'étirement –NH₂ et –OH, et à l'étirement asymétrique CH₂, respectivement. Plusieurs pics d'absorption caractéristiques sont apparus à 1652 cm⁻¹ (amide I) pour la vibration d'étirement C=O, 1542 cm⁻¹ (amide II) pour la vibration de flexion N-H, 1441 cm⁻¹ pour l'étirement CH₂, et 1267 cm⁻¹ (amide III) pour la vibration d'étirement C-N [21, 22]. Le spectre CS a montré une bande d'absorption caractéristique à 1245 cm⁻¹, représentant la vibration d'étirement S=O dans le SO₄²⁻ chargé négativement [23, 24].

Comme montré dans la Fig. 4, les spectres FTIR des nanofibres 5%CS@PG, 10%CS@PG et 15%CS@PG montraient des pics caractéristiques de PCL, Gt et CS ensemble. Comparé aux spectres du groupe PG, les groupes CS@PG montraient la bande caractéristique de CS à 1245 cm⁻¹, et l'intensité de la bande CS augmentait par la présence de CS dans les nanofibres. Cette découverte a confirmé la présence de teneurs variables de CS dans les nanofibres électrofilées CS@PG.

Porosité, Rapport de Gonflement et Dégradabilité des Nanofibres

La haute porosité de la fibre indique que le matériau a une excellente interconnectivité, ce qui est propice à la diffusion de l'oxygène et des nutriments dans les pores et favorise l'infiltration cellulaire [25, 26]. La Figure 5a affichait la porosité des films nanofiber. La porosité des nanofibres obtenues contenant différents rapports de CS était d'environ 80%. L'architecture poreuse élevée obtenue par les nanofibres électrofilées peut imiter la MEC naturelle, fournissant ainsi un microenvironnement 3D favorable pour les cellules [27]. Il a été rapporté que les échafaudages en ingénierie tissulaire avec une porosité jusqu'à 80% étaient bénéfiques pour le transport des nutriments et métabolites.

Le rapport d'absorption PBS des échafaudages nanofiber CS@PG a été comparé pour évaluer l'effet du CS sur l'absorption PBS des films. Comme indiqué dans la Fig. 5b, le rapport d'absorption PBS de l'échafaudage PG était de 586,34 ± 49,44%, et les nanofibres 5%CS@PG et 10%CS@PG étaient de 492,86 ± 21,99% et 510,04 ± 69,55%, respectivement. Le rapport d'absorption PBS des groupes 15%CS@PG (665,07 ± 59,81%) était significativement plus élevé que celui de 5% CS@PG et 10%CS@PG. Ce résultat indiquait que l'augmentation de la teneur en CS dans les nanofibres composites pouvait améliorer la propriété d'absorption PBS des films, ce qui pourrait être dû à l'hydrophilie élevée dans les molécules de CS contenant des groupes hydrophiles (carboxyle et hydroxyle) [28].

Les données de l'expérience de dégradabilité in vitro étaient représentées dans la Fig. 5c, et il a été trouvé qu'avec l'augmentation du rapport CS, le taux de dégradation des échafaudages nanofiber CS@PG augmentait également. Cela pourrait être attribué à la présence de groupes SO₄²⁻ [29]. Comme démontré dans la Fig. 5c, le taux de dégradation de la plupart des échafaudages a commencé à augmenter après 7 jours, et les résultats de dégradation au jour 14 étaient de 8,45%, 11,39%, 13,97% et 15,10% pour les échafaudages nanofiber PG, 5% CS@PG, 10%CS@PG et 15%CS@PG, respectivement. Les images MEB des échafaudages nanofiber (Fig. 5d) montraient un léger gonflement après immersion dans la solution PBS pendant 7 jours. Les images MEB indiquent que les nanofibres développées étaient suffisamment stables pour éviter une dégradation et une expansion sérieuses jusqu'à 7 jours, affectant ainsi la réponse cellulaire in vivo ou in vitro.

Évaluation de l'Hémocompatibilité

Le TTPa est une méthode simple et fiable pour détecter le sang ou le plasma via le mécanisme de coagulation intrinsèque. Le TTPa a été testé pour mesurer l'influence des nanofibres électrofilées sur le retard possible de la coagulation sanguine. Le temps de coagulation détecté par TTPa a affiché une diminution statistiquement significative des temps de coagulation entre le PG contrôle et les nanofibres 5%CS@PG et 10%CS@PG. En revanche, un TTPa prolongé a été trouvé après incubation des nanofibres 15%CS@PG avec PPP, indiquant sa caractéristique anticoagulante améliorée. Comme présenté dans la Fig. 6a, l'impact de la coagulation sanguine dépendait du diamètre des échantillons nanofiber. Le temps de coagulation TTPa le plus bas a été trouvé après interaction avec les nanofibres 5%CS@PG et le plus haut TTPa avec les nanofibres 10%CS@PG électrofilées, de manière similaire au degré d'hémolyse. Le temps de coagulation était prolongé avec l'augmentation du rapport CS.

Selon l'ASTM F756-00 (2000), le taux d'hémolyse des biomatériaux est requis d'être < 5% [30]. Le degré d'hémolyse dans cette étude a été réalisé en utilisant un essai colorimétrique d'hémoglobine libérée des érythrocytes et peut être calculé par l'équation : Hémolyse (%) = (OD_sam − OD_neg)/(OD_pos − OD_neg) × 100%. Comme indiqué dans la Fig. 6b, tous les échantillons étaient non-hémolytiques et n'entraînaient aucune hémolyse marquée (taux d'hémolyse inférieur à 5%).

Les données de l'expérience de viabilité plaquettaire sont montrées dans la Fig. 6c. Après 2 h, l'activité métabolique des thrombocytes adhérents était la plus élevée avec des valeurs maximales atteintes après interaction du PRP avec les nanofibres, particulièrement les nanofibres PG. Intéressant, après 24 h, l'activité plaquettaire a diminué dans tous les échantillons. Ce résultat pourrait être dû à l'activation rapide des thrombocytes par la structure des nanofibres, résultant en une consommation et une libération rapides de facteurs de croissance comparées à une activation plaquettaire stable et à long terme au contact d'une surface lisse [31]. La durée de vie normale des thrombocytes est d'environ 8-10 jours, et elle sera raccourcie à mesure que les plaquettes commencent à s'activer.

Coloration Vivant/Mort des Cellules

L'influence du CS sur la cytocompatibilité des nanofibres a été explorée par l'évaluation de la viabilité cellulaire, de la morphologie adhésive et de la prolifération des CEAH sur les nanofibres pendant 6 jours. Les cellules adhérentes ont été évaluées en utilisant le kit de double coloration Calcein-AM/IP, la coloration DAPI et le kit d'essai CCK-8.

La Figure 7a-e montrait les images de fluorescence des CEAH vivantes et mortes adhérentes aux différentes nanofibres. Calcein-AM (vert) et IP (rouge) étaient utilisés pour colorer les cellules vivantes et mortes, respectivement. On pouvait observer que des cellules vivantes adéraient sur les nanofibres composites CS@PG, indiquant que les nanofibres contenant différents rapports de CS n'avaient pas de toxicité pour les CEAH. Une analyse quantitative plus approfondie du nombre de cellules vivantes/mortes sur les nanofibres a été examinée par Image J (Fig. 7f). Comparé à la proportion de cellules vivantes et mortes sur les nanofibres PG, les trois autres groupes de PG contenant différents rapports de CS, en particulier les groupes 10%CS@PG et 15%CS@PG présentaient un pourcentage plus élevé de cellules vivantes, et le pourcentage augmentait avec l'augmentation de la concentration de CS. Ce résultat montrait que la présence de CS dans les nanofibres était avantageuse pour maintenir la viabilité cellulaire [32].

Comportement d'Adhésion Cellulaire sur les Nanofibres

Les échafaudages nanofiber avec une bonne biocompatibilité sont considérés comme la exigence primaire pour la génération de vaisseaux sanguins. Le PCL avec une bonne biodégradabilité et le Gt naturel avec une excellente biocompatibilité ont été largement utilisés en ingénierie tissulaire avec différentes structures, y compris les hydrogels, les nanofibres électrofilées et les échafaudages tridimensionnels [21, 33, 34]. La morphologie des CEAH sur les nanofibres composites et l'interaction cellule-matériau à 24 h a été observée par microscope à fluorescence. La densité cellulaire 10%CS@PG et 15%CS@PG était statistiquement significative par rapport à PG et 5%CS@PG, indiquant que l'ajout de CS à un niveau plus élevé favorise l'adhésion cellulaire. Comme montré dans la Fig. 8c, l'aire monocellulaire de 5%CS@PG et 15%CS@PG était plus grande que les autres groupes de nanofibres. Cependant, l'élongation cellulaire de 10%CS@PG était significativement plus élevée que PG, 5%CS@PG et 15%CS@PG (Fig. 8d). Ce résultat pourrait s'expliquer par le fait que l'ajout de CS à une concentration de 10% peut faciliter l'étalement des CEAH. Il a été trouvé que les CEAH pouvaient adhérer, s'étaler et croître bien sur les nanofibres composites, en particulier 10%CS@PG et 15%CS@PG. Ainsi, ces deux matériaux nanofiber peuvent être considérés comme un matériau vasculaire candidat sûr et prometteur en application clinique.

Prolifération Cellulaire

La croissance et la viabilité cellulaire sur les nanofibres CS@PG ont été étudiées in vitro par microscope à fluorescence et test CCK-8 (Fig. 9a-c). L'échafaudage électrofilé PG a été sélectionné comme contrôle positif. Les résultats de l'essai CCK-8 pour différents films nanofiber sont affichés dans la Fig. 9c. En 2, 4, 6 jours de culture cellulaire, le nombre de cellules a augmenté avec le temps de culture pour tous les groupes. Au jour 6, la valeur DO des nanofibres 10%CS@PG était significativement plus élevée que celle de l'échafaudage PG. La comparaison de la prolifération cellulaire de 5%CS@PG, 10%CS@PG et 15%CS@PG indiquait que le taux de prolifération cellulaire augmentait avec la présence de CS dans les nanofibres composites dans une certaine plage. Cependant, la capacité de prolifération cellulaire était également influencée par la morphologie de surface des matériaux nanofiber. Puisque les nanofibres 15%CS@PG présentaient une forte viscosité due au rapport CS plus élevé dans la solution polymère d'électrofilage, la prolifération cellulaire pourrait être affectée.

Conclusions

En résumé, des nanofibres composites biomimétiques CS@PG ont été fabriquées avec succès en utilisant la technologie d'électrofilage. Une morphologie et un diamètre de fibre modifiés ont été obtenus en variant les concentrations de CS dans les nanofibres PG. Les nanofibres CS@PG possédaient une porosité appropriée (~ 80%) et une absorption de solution PBS (jusqu'à 650%). L'incorporation de CS dans les nanofibres PG a significativement amélioré leurs propriétés anticoagulantes, prolongé leur temps de coagulation et amélioré les réponses cellulaires. Particulièrement, les nanofibres 10%CS@PG ont exhibé une adhésion cellulaire, une élongation et une prolifération favorables. Par conséquent, les nanofibres composites PG incorporées avec une certaine quantité de CS inhibent l'antithrombogénicité et améliorent les réponses des cellules endothéliales, ce qui pourrait être développé comme un échafaudage d'ingénierie tissulaire prometteur dans la réparation et la régénération des vaisseaux sanguins.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données générées ou analysées pendant cette étude sont incluses dans cet article.