Le microARN-326-5p protège les neurones lors d'un AVC : la suppression de STAT3 réduit l'apoptose et les dommages mitochondriaux

Résumé

Des études ont largement exploré le rôle des microARN (miARN) dans les lésions cérébrales ischémie/réperfusion (LCI/R). Mais le mécanisme spécifique du miR-326-5p dans les LCI/R reste insaisissable. Par conséquent, cette étude visait à dévoiler le mécanisme de l'axe miR-326-5p/transducteur de signal et activateur de la transcription-3 (STAT3) dans les LCI/R. Deux modèles (privation d'oxygène et de glucose [POG] dans les neurones corticaux primaires de rat et occlusion de l'artère cérébrale moyenne [OACM] chez des rats Sprague-Dawley) ont été établis pour imiter les LCI/R in vitro et in vivo, respectivement. Des essais de perte et de gain de fonction ont été réalisés avec des neurones traités par POG et avec des rats OACM. Par la suite, la viabilité, l'apoptose, le stress oxydatif et le potentiel de membrane mitochondriale dans les neurones traités par POG ont été testés, ainsi que les changements pathologiques, l'apoptose et le potentiel de membrane mitochondriale dans les tissus cérébraux des rats OACM. L'expression de Mitofusine-2 (Mfn2), miR-326-5p et STAT3 dans les neurones traités par POG et dans les tissus cérébraux des rats OACM a été détectée. Mfn2 et miR-326-5p étaient réduits, et STAT3 était élevé dans les neurones traités par POG et les tissus cérébraux des rats OACM. Le miR-326-5p ciblait et régulait négativement l'expression de STAT3. La restauration du miR-326-5p ou la réduction de STAT3 renforçait la viabilité, inhibait l'apoptose et le stress oxydatif, augmentait le potentiel de membrane mitochondriale et augmentait l'expression de Mfn2 dans les neurones traités par POG. La surexpression du miR-326-5p ou la sous-régulation de STAT3 soulageait les changements pathologiques, inhibait l'apoptose et augmentait le potentiel de membrane mitochondriale et l'expression de Mfn2 dans les tissus cérébraux des rats avec OACM. Cette étude élucide que le miR-326-5p surexprimé ou le STAT3 sous-régulé protège contre les LCI/R en augmentant l'expression de Mfn2.

Introduction

La lésion cérébrale ischémie/réperfusion (LCI/R) est un type de lésion cérébrale suivie d'un accident vasculaire cérébral ischémique [1]. La caractéristique la plus marquante de l'ischémie/réperfusion cérébrale est l'ischémie cérébrale transitoire initiale suivie de la réperfusion [2]. La LCI/R active l'apoptose neuronale et entraîne des dommages hippocampiques et corticaux [3]. Actuellement, l'application clinique la plus courante est la thrombolyse pour les LCI/R [4]. Cependant, la réperfusion augmenterait la production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), entraînant des dommages à l'ADN intracellulaire, des dommages liés au stress oxydatif, l'oxydation des protéines et la peroxydation lipidique, détériorant davantage la barrière hémato-encéphalique et l'œdème [5]. Ainsi, l'urgence de rechercher de nouvelles options ciblées est une priorité absolue pour les LCI/R.

Les microARN (miARN) sont largement considérés comme des rôles potentiels et pronostiques dans les LCI/R [6, 7]. Par exemple, un article a démontré que le miR-202-5p atténue les dommages neuronaux et les déficits neurologiques, ainsi que les dommages cellulaires induits par la privation d'oxygène et de glucose (POG) chez des rats modèles d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (OACM) dans les lésions ischémiques [8]. De plus, il a été trouvé que la surexpression du miR-98 améliore les résultats neurologiques chez des souris avec un AVC I/R [9] et la surexpression du miR-451 atténue l'apoptose cérébrale ischémique chez des souris avec LCI/R [10]. Spécifiquement, le miR-326-5p a une capacité pro-angiogénique pour les cellules progénitrices endothéliales et pourrait améliorer la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde aigu [11]. Cependant, l'étude pivotant sur le miR-326-5p dans les LCI/R est encore à ses débuts. Les transducteurs de signal et activateurs de la transcription (STAT) sont une famille unique de protéines qui est activée par les LCI/R [12]. STAT3 a été prédit comme une cible du miR-326-5p sur le site web de bioinformatique ; ainsi, nous avons étudié le rôle du STAT3 médié par le miR-326-5p dans les LCI/R. STAT3 détériore les processus neuro-inflammatoires ischémiques et la lésion cérébrale secondaire en libérant des médiateurs pro-inflammatoires [13, 14]. Spécifiquement, la voie Janus-activated kinase 2 (JAK2)/STAT3 joue un rôle fonctionnel dans le blocage de l'apoptose cellulaire induite par les LCI/R [15]. La Mitofusine-2 (Mfn2) est un facteur de fusion mitochondriale qui pourrait protéger contre les lésions I/R cardio-cérébrovasculaires [16] et améliorer l'apoptose neuronale induite par l'hypoxie dans les dommages cérébraux ischémiques [17]. Il a également été enregistré que Mfn2 exerce un effet protecteur sur les LCI/R [18].

En un mot, une investigation moins approfondie a découvert le rôle combiné du miR-326-5p et STAT3 dans les LCI/R. Étant donné cela, cette étude est lancée avec l'hypothèse que le miR-326-5p atténue les LCI/R via le ciblage de STAT3.

Matériaux et Méthodes

Déclaration d'éthique

Les expériences ont été approuvées par le Comité de soins et d'utilisation des animaux de l'Hôpital affilié de l'Université de Yangzhou ; Université de Yangzhou, et ont été menées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des rats expérimentaux de l'Hôpital affilié de l'Université de Yangzhou ; Université de Yangzhou.

Animaux expérimentaux

Des rats Sprague-Dawley mâles adultes (6-8 semaines, 250 ± 30 g) du Centre de médecine comparative, Université de Yangzhou (Yangzhou, Chine), ont été maintenus dans un environnement exempt de pathogènes spécifiques avec un accès libre à la nourriture et à l'eau, (24 ± 1)°C, (50 ± 5)% d'humidité et cycle lumière/obscurité de 12 h.

Isolation et identification des cellules

Les rats ont été euthanasiés par décapitation, et leurs cerveaux ont été coupés en 1 mm³ pour configurer des suspensions cellulaires, qui ont été mélangées avec une solution de bleu de trypan à 0,4% à 9:1 (la concentration finale de bleu de trypan était de 0,04%) et la densité cellulaire et le taux de survie ont été calculés par un hémocytomètre. Les cellules (1 × 10⁶ cellules/mL) ont été ensemencées dans une fiole de culture cellulaire pré-revêtue de L-polylysine (0,1 mg/mL) à 5 × 10⁶ cellules par fiole. Lorsque les cellules adéraient aux parois, elles étaient incubées avec le milieu renouvelé (NeurobasalA + B27 + L-glutamine) et cultivées en continu pendant 6-7 j avec le milieu changé de moitié tous les 2-3 j.

Identification cellulaire : Les neurones corticaux de rat ont été utilisés pour préparer des lames de neurones qui ont été incubées avec l'anticorps polyclonal anti-rat Nestin (NES) de lapin primaire (1:200), ainsi que l'immunoglobuline G (1:50, les deux de Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) marquée au fluorescéine isothiocyanate (FITC) de chèvre anti-lapin. Ensuite, les cellules ont été scellées avec un anti-quencher fluorescent et observées par microscopie à fluorescence.

Établissement du modèle POG

Les neurones ont été cultivés dans une solution d'Earle sans glucose et exposés à un mélange gazeux de 95% N₂ et 5% CO₂. Après 30 min de ventilation à pression positive, un environnement hypoxique a été formé dans lequel les cellules ont été incubées (simulation d'ischémie par POG in vitro). Après 90 min d'incubation, les cellules ont été incubées avec le milieu de maintenance cellulaire après le retrait de la solution d'Earle sans glucose. Les cellules ont été cultivées de routine pour les expériences subséquentes (simulation de réperfusion par réoxygénation-glucose in vitro). Le milieu normal sous normoxie a servi de contrôle.

Les neurones ont été divisés en groupe contrôle ; groupe POG, groupe contrôle négatif (CN) (neurones traités par POG transféctés avec des oligonucleotides brouillés), groupe agomir miR-326-5p (neurones traités par POG transféctés avec agomir miR-326-5p), groupe sh-STAT3 (neurones traités par POG transféctés avec shRNA STAT3) et groupe agomir miR-326-5p + surexpression (oe)-STAT3 (neurones traités par POG transféctés avec agomir miR-326-5p et vecteur pcDNA-STAT3). Les oligonucleotides et vecteurs ont tous été fournis par GenePharma (Shanghai, Chine).

En utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen ; Thermo Fisher Scientific), les oligonucleotides brouillés, l'agomir miR-326-5p, le shRNA STAT3 ou l'agomir miR-326-5p et pcDNA-STAT3 ont été transféctés dans les neurones primaires de rat et l'efficacité de la transfection a été testée par réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse (RT-qPCR) ou Western blot après 48 h.

Essai MTT (3-(4,5-Diméthylthiazol-2-yl)-2,5-Diphényltétrazolium Bromure)

Les neurones ont été mis en suspension à 1 × 10⁶ cellules/mL et cultivés pendant 0, 24 et 48 h, respectivement. Dans un environnement stérile, les neurones ont été incubés pendant 2-4 h dans une solution MTT à 10% et ajoutés avec 150 μL de solution dissoute de Formazan (Diméthylsulfoxyde) jusqu'à ce que le cristal soit suffisamment dissous. La densité optique (DO) a été mesurée sur un lecteur de microplaques à 570 nm.

Essai d'apoptose par cytométrie de flux

Les neurones ont été détachés avec 0,25% de trypsine, centrifugés à 2000 tr/min et resuspendus dans PBS. Ensuite, les neurones ont été centrifugés à 2000 tr/min, et le culot a été resuspendu par tampon de liaison et incubé successivement avec 5 μL Annexin V-FITC et 5 μL iodure de propidium (IP). Un cytomètre de flux a été appliqué pour détecter le taux d'apoptose.

Détection du potentiel de membrane mitochondriale JC-1

Les cellules dans la plaque à 6 puits ont été rincées avec PBS, ajoutées avec 1 mL de milieu de culture cellulaire et 1 mL de solution de travail de coloration JC-1 (50 μL JC-1, 8 mL d'eau ultrapure et 2 mL de tampon de coloration JC-1) (SolarbioScience, Beijing, Chine) et incubées pendant 15 min. Le tampon de coloration JC-1 1× a été configuré par 4 mL d'eau distillée et 1 mL de tampon de coloration JC-1. Après incubation, les cellules ont été trypsinisées, resuspendues dans le tampon JC-1, et testées sur un cytomètre de flux. La proportion relative de fluorescence verte a été calculée.

Détection du stress oxydatif

Les niveaux intracellulaires d'ERO ont été mesurés par le kit de détection de 2,7-dichlorofluorescin diacétate (DCF-DA) (Abcam). En bref, les neurones ont été détachés avec 0,25% de trypsine, resuspendus et incubés avec 10 μm DCF-DA pendant 30 min. Après cela, la fluorescence DCF avec une lumière d'excitation/émission à 495 nm/529 nm a été mesurée par spectroscopie de fluorescence (BD Biosciences).

La détection du contenu intracellulaire en malondialdéhyde (MDA), glutathion (GSH) et de l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) a été réalisée par colorimétrie chimique en utilisant des kits d'essai commerciaux (Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, Chine). La valeur DO a été mesurée par un lecteur de microplaques.

Établissement du modèle rat

Les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (50 μg/kg). Une incision médiane a été faite sur le cou, la carotide externe a été ligaturée, et l'artère carotide commune a été bloquée avec une pince artérielle. Un fil de nylon monofilament enduit de silicone 3-0 a été soigneusement inséré dans l'artère carotide interne jusqu'à une résistance légère. Après 90 min d'ischémie cérébrale transitoire, le fil a été retiré, et la réperfusion a été effectuée pendant 24 h supplémentaires. Le groupe sham a reçu le même traitement, sauf que le fil n'est pas entré dans l'artère carotide interne. Pendant l'opération, un lit thermostatique a été utilisé pour maintenir la température rectale à 37 ± 0,5 °C [19].

Les rats ont été répartis en 6 groupes (n = 6) et injectés avec un plasmide ou miR dans le ventricule latéral cérébroventriculaire avant l'établissement des modèles OACM, y compris le groupe sham, le groupe OACM (rats modélisés), le groupe CN (rats modélisés avec injection ventriculaire latérale de 5 μL d'oligonucleotides brouillés [100 μM]), le groupe agomir miR-326-5p (rats modélisés avec injection ventriculaire latérale de 5 μL d'agomir miR-326-5p [100 μM]), le groupe sh-STAT3 (rats modélisés avec injection ventriculaire latérale de 5 μL de vecteur d'interférence STAT3 [100 μM]) et le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (rats modélisés avec injection ventriculaire latérale de 5 μL d'agomir miR-326-5p [100 μM] et 5 μL de vecteur de surexpression STAT3 [100 μM]) [20, 21].

Collecte des spécimens

Les rats ont été euthanasiés par anesthésie, les cœurs ont été perfusés, et les cerveaux entiers ont été obtenus. Les tissus cérébraux lésés ont été coupés en masses de tissu de 1 × 1 × 1 mm³ pour la préparation de sections paraffine, RT-qPCR, analyse Western blot et détection du potentiel de membrane mitochondriale.

Détection du potentiel de membrane mitochondriale dans le cortex cérébral

Le cortex cérébral de rats SD a été séparé et coupé en 1 mm³. Les blocs de tissu ont été placés sur un filet en nylon de 300 mailles et ajoutés avec PBS. Ensuite, la suspension cellulaire a été centrifugée à 1000 tr/min, ajoutée avec 70% d'éthanol et centrifugée à 1000 tr/min à nouveau. Après cela, l'échantillon a été resuspendu dans 1 mL de PBS, et la suspension (1 × 10⁶ cellules, 100 μL) a réagi avec une solution de colorant Rhodamine123 (10 μL, 5 µg/mL) et analysée sur un cytomètre de flux à 488 nm.

Coloration HE

Le tissu cérébral de rat a été immergé dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h, et des sections paraffine ont été préparées, coupées en 4 µm, étalées dans de l'eau à 40 °C et cuites à 60 °C. Routinièrement déparaffinées et hydratées, les sections paraffine ont été colorées par solution de coloration HE. Après coloration HE, les neurones endommagés montraient une contraction du noyau, un œdème cellulaire, une vacuolisation et des noyaux assombris. Le microscope optique (Nikon, Japon) a été utilisé pour obtenir l'image, et le nombre de neurones survivants (mm²) du cortex ischémique a été compté.

Coloration TUNEL

Les sections paraffine ont été déparaffinées et déshydratées avec 100%, 95%, 80% et 70% d'alcool. Ensuite, les sections ont été immergées dans du paraformaldéhyde à 4% suivi d'une incubation avec 0,1% de tampon citrate de sodium Triton X-100 pendant 20 min et un mélange de réaction TUNEL pendant 1-1,5 h. Ensuite, les sections ont été développées par solution de peroxydase et diaminobenzidine (DAB), contre-colorées par hématoxyline, déshydratées par alcool gradient, perméabilisées, et scellées dans de la gomme neutre. Les sections ont été observées sous un microscope optique pour compter les cellules TUNEL-positives. Des particules brun-jaune dans le noyau étaient définies comme cellules TUNEL-positives (cellules apoptotiques).

Immunohistochimie

Les sections ont été déparaffinées, hydratées et récupérées par antigène citrate, et la catalase endogène a été bloquée par H₂O₂ à 3%. Chaque section a été ajoutée avec du sérum de chèvre (50 μL), incubée avec l'anticorps primaire (50 μL) et réagie avec l'anticorps secondaire (50 μL) et la streptavidine marquée à la peroxydase de raifort (50 μL). Les sections ont été développées par DAB et contre-colorées par hématoxyline, suivi par déshydratation à l'alcool gradient, perméabilisation au xylène et scellement à la gomme neutre. Les sections ont été observées par un microscope (le cytoplasme ou le noyau des tissus cérébraux ischémiques étaient des particules jaunes ou brun-jaune). Les valeurs DO ont été mesurées et moyennées.

RT-qPCR

L'extraction d'ARN total des tissus et cellules a été réalisée par Trizol (Invitrogen). L'expression d'ARNm a été analysée par qPCR en utilisant le mélange SYBR Green PCR (Applied Biosystems, CA, USA) et le système PCR en temps réel QuantStudio TM 6Flex (Applied Biosystems). Des amorces de transcription inverse à boucle spécifique et des amorces directes/inverses (BioTNT, Shanghai, Chine) ont été conçues pour analyser les niveaux de miARN. Le Tableau 1 listait toutes les amorces. La méthode 2^−ΔΔCT a été adoptée pour calculer les niveaux de miARN ou d'ARNm.

Analyse Western Blot

Les échantillons de protéines ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% de dodécylsulfate de sodium et électrotransférés sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF). Après cela, la membrane PVDF a été bloquée avec 5% de lait écrémé en poudre dans du salin contenant du Tris, sondée avec les anticorps primaires et re-sondée avec l'anticorps secondaire pendant 2 h. Ensuite, les bandes de protéines ont été analysées avec un tampon phosphatase alcaline contenant du chlorure de nitroblue tetrazolium et du phosphate 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl et quantifiées par le logiciel ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Les principaux anticorps étaient STAT3 (1:1000), Mfn2 (1:1000, Abcam, MA, USA) et glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Essai de gène rapporteur luciférase double

L'3'UTR de STAT3 contenant les sites de liaison miR-326-5p de type sauvage (TS) ou mutant (Mut) a été cloné dans le vecteur pmirGLO (Promega, WI, USA), nommé STAT3-TS et STAT3-Mut. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 24 puits à 2 × 10⁴ cellules/puits et co-transféctées avec 100 ng de vecteur luciférase STAT3-TS ou STAT3-Mut et 50 nM d'agomir miR-326-5p ou son agomir CN à 70% de confluence. L'activité luciférase a été mesurée en utilisant le système d'essai de gène rapporteur luciférase double (Promega Corporation, WI, USA).

Analyse statistique

Le logiciel statistique SPSS 21.0 (IBM, NY, USA) a été utilisé pour l'analyse des données. Les données étaient exprimées en moyenne ± écart-type (ET). La différence entre deux groupes a été analysée par le test t de Student, tandis que les comparaisons multiples ont été analysées par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA), suivie du test post-hoc de Tukey. P représentait un test bilatéral, et P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

La surexpression du miR-326-5p ou la sous-régulation de STAT3 atténue l'apoptose des neurones corticaux traités par POG

Cultivés pendant une semaine, les neurones corticaux de rat étaient différenciés et matures. Microscopiquement, les neurones montraient des corps neuronaux plus grands, un cytoplasme plus transparent, un noyau large à faible densité et un fort indice de réfraction. Les corps neuronaux étaient coniques ou ronds, et les dendrites étaient décalées et adéraient aux parois (Fig. 1a, b). NES était un marqueur chimique spécifique des neurones cérébraux pour localiser les neurones avec une haute spécificité par essai d'immunofluorescence. Les neurones ont été trouvés pour se lier spécifiquement à NES et montraient une fluorescence verte (Fig. 1c).

L'essai MTT a été appliqué pour détecter la viabilité des neurones corticaux (Fig. 1d). Les résultats ont démontré que la viabilité des neurones corticaux de rat était altérée dans le groupe POG et le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3 par rapport au groupe contrôle et au groupe agomir miR-326-5p, mais améliorée dans le groupe agomir miR-326-5p et le groupe sh-STAT3 par rapport au groupe CN (tous P < 0,05).

L'apoptose des neurones corticaux de rat a été déterminée par cytométrie de flux, tandis que l'expression d'ARNm Bcl-2 et Bax par RT-qPCR (Fig. 1e-g). Les résultats ont expliqué qu'en comparaison avec le groupe contrôle et le groupe agomir miR-326-5p, le groupe POG et le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3 ont démontré un taux d'apoptose accru, une expression de Bcl-2 réduite et une expression de Bax augmentée (tous P < 0,05). En contraste avec les groupes CN, le taux d'apoptose était abaissé, le niveau de Bcl-2 était élevé et le niveau de Bax était supprimé dans le groupe agomir miR-326-5p et le groupe sh-STAT3 (tous P < 0,05).

La surexpression du miR-326-5p ou la sous-régulation de STAT3 augmente Mfn2 et le niveau de potentiel de membrane mitochondriale dans les neurones corticaux après lésion POG

L'expression de Mfn2 dans les neurones corticaux traités par POG a été détectée par analyse Western blot (Fig. 2a, b). Par rapport au groupe contrôle et au groupe agomir miR-326-5p, l'expression protéique de Mfn2 a diminué dans le groupe POG et le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3, tandis qu'elle a augmenté dans le groupe agomir miR-326-5p et le groupe sh-STAT3 par rapport au groupe CN (tous P < 0,05).

Le potentiel de membrane mitochondriale détecté par JC-1 a montré que (Fig. 2c, d) par rapport au groupe contrôle et au groupe agomir miR-326-5p, le niveau de potentiel de membrane mitochondriale a diminué dans le groupe POG et le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (tous P < 0,05). Relativement aux groupes CN, le niveau de potentiel de membrane mitochondriale a augmenté dans le groupe agomir miR-326-5p et le groupe sh-STAT3 (tous P < 0,05).

Les contenus en ERO et MDA, et les activités GSH et SOD dans les neurones corticaux traités par POG ont été déterminés et les résultats ont indiqué que par rapport au groupe contrôle et au groupe agomir miR-326-5p, le groupe POG et le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3 présentaient des contenus en ERO et MDA augmentés et des activités GSH et SOD altérées (tous P < 0,05). En comparaison avec les groupes CN, le groupe agomir miR-326-5p et le groupe sh-STAT3 montraient des contenus en ERO et MDA réduits et des activités GSH et SOD renforcées (tous P < 0,05) (Fig. 2e-g).

La surexpression du miR-326-5p ou la sous-régulation de STAT3 empêche les dommages pathologiques des neurones corticaux et inhibe l'apoptose chez les rats avec LCI/R

La coloration HE a été adoptée pour observer les dommages pathologiques des tissus cérébraux (Fig. 3a, b), montrant que dans le groupe sham, les neurones étaient normaux en structure et bien arrangés avec un cytoplasme rouge pâle, un noyau bleu et un nucléon clair. Dans le groupe OACM, le groupe CN et le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3, hormis la nécrose, on observait que les neurones étaient désordonnés et colorés plus foncés, avec rupture de la membrane nucléaire, disparition de la structure cellulaire, karyopyknose, noyau profondément coloré et lyse en grande quantité. Dans le groupe agomir miR-326-5p et le groupe sh-STAT3, l'œdème neuronal était atténué et les neurones étaient arrangés de manière ordonnée, et les cellules nécrotiques étaient réduites, indiquant un meilleur statut par rapport au groupe OACM et au groupe CN.

La coloration TUNEL a été utilisée pour la détection de l'apoptose neuronale et RT-qPCR pour l'expression d'ARNm Bcl-2 et Bax dans les tissus cérébraux. Les résultats ont affiché que (Fig. 3c-e) en comparaison avec le groupe sham et le groupe agomir miR-326-5p, le taux de cellules TUNEL-positives a augmenté, l'expression d'ARNm Bcl-2 a diminué et l'expression d'ARNm Bax a augmenté dans le groupe OACM et le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (tous P < 0,05). Un taux de cellules TUNEL-positives et une expression d'ARNm Bax plus bas, et une expression d'ARNm Bcl-2 plus élevée ont été montrés dans le groupe agomir miR-326-5p et le groupe sh-STAT3 que le groupe CN (tous P < 0,05).

La surexpression du miR-326-5p ou la sous-régulation de STAT3 augmente le niveau de potentiel de membrane mitochondriale dans les tissus cérébraux chez les rats avec LCI/R

La détection de l'expression protéique de Mfn2 dans le tissu cérébral de rat a été réalisée par immunohistochimie, et les résultats ont affiché que (Fig. 4a, b) une expression protéique de Mfn2 plus faible a été testée dans le groupe sham et le groupe agomir miR-326-5p par rapport au groupe OACM et au groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3, tandis qu'une expression protéique de Mfn2 plus élevée a été mesurée dans le groupe agomir miR-326-5p et le groupe sh-STAT3 au lieu du groupe CN (tous P < 0,05).

La détection du niveau de potentiel de membrane mitochondriale a découvert que (Fig. 4c) par comparaison avec le groupe sham et le groupe agomir miR-326-5p, le niveau de potentiel de membrane mitochondriale a diminué dans le groupe OACM et le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3, tandis qu'il a augmenté dans le groupe agomir miR-326-5p et le groupe sh-STAT3 en contraste avec le groupe CN (tous P < 0,05).

Le miR-326-5p cible STAT3

L'expression du miR-326-5p et STAT3 dans les neurones corticaux et les tissus cérébraux a été détectée par RT-qPCR et analyse Western blot. Dans les neurones corticaux in vitro, une diminution suggérée dans l'expression du miR-326-5p et une augmentation dans l'expression de STAT3 dans le groupe POG par rapport au groupe contrôle (tous deux P < 0,05). Par rapport au groupe CN, l'expression du miR-326-5p a augmenté et l'expression de STAT3 a diminué dans le groupe agomir miR-326-5p (tous deux P < 0,05) ; l'expression de STAT3 a diminué (P < 0,05) dans le groupe sh-STAT3. En contraste avec le groupe agomir miR-326-5p, l'expression de STAT3 a été élevée dans le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (P < 0,05) (Fig. 5a-c).

Dans les tissus cérébraux in vivo, par rapport au groupe sham, un miR-326-5p plus bas et un STAT3 plus élevé apparaissaient dans le groupe OACM (tous deux P < 0,05). Relativement au groupe CN, l'expression du miR-326-5p a augmenté tandis que l'expression de STAT3 a diminué dans le groupe agomir miR-326-5p (tous deux P < 0,05). L'expression de STAT3 a diminué dans le groupe sh-STAT3 (P < 0,05). Avec le groupe agomir miR-326-5p par contraste, l'expression de STAT3 a augmenté dans le groupe agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (P < 0,05) (Fig. 5d-f).

Les sites de ciblage potentiels du miR-326-5p sur l'3'UTR de STAT3 ont été trouvés par les logiciels DIANA et miRDB (Fig. 5g). L'3'UTR de STAT3 contenant le site de liaison miR-326-5p TS et le site de liaison Mut ont été construits et insérés dans le plasmide pmirGLO. La liaison du miR-326-5p à l'3'UTR de STAT3 a été davantage validée par essai de rapporteur luciférase. L'essai de rapporteur luciférase a révélé que l'agomir miR-326-5p a réduit l'activité luciférase relative de STAT3-TS, mais pas STAT3-Mut (Fig. 5h), impliquant que STAT3 était un gène cible direct du miR-326-5p.

Discussion

La LCI/R est la principale cause de décès cérébrovasculaire [22]. Les miARN sont indiqués comme étant impliqués dans les LCI/R [23]. Cependant, la compréhension complète du mécanisme lié au miR-326-5p est encore insuffisante dans les LCI/R. Ainsi, cette étude est ciblée pour découvrir les rôles concrets du miR-326-5p dans les LCI/R avec l'accent sur le réciproque combiné du miR-326-5p et STAT3. Productivement, cette étude a déclaré que la surexpression du miR-326-5p atténuait les LCI/R et augmentait l'expression de Mfn2 via l'inhibition de STAT3.

Au début, l'expression du miR-326-5p a été déterminée pour réduire dans les LCI/R in vivo et in vitro. Par la suite, nous avons organisé une série d'essais et avons trouvé que la surexpression du miR-326-5p améliorait la viabilité neuronale et la fonction mitochondriale, augmentait l'expression de Mfn2 et limitait le stress oxydatif et l'apoptose. De plus, les expériences in vivo chez les rats ont vérifié davantage les rôles fonctionnels du miR-326-5p restauré dans les LCI/R. En fait, un miR-326 élevé est prouvé pour corréler avec une survie globale longue des patients atteints de glioblastome, le type commun de tumeur cérébrale [24]. Aussi, l'expression du miR-326 a été davantage prouvée pour réduire dans la maladie de Parkinson et le miR-326 pouvait supprimer l'apoptose des neurones dopaminergiques et réduire la réponse inflammatoire [25]. Excepté cela, la réduction du miR-326-5p est manifestée dans les cellules progénitrices endothéliales au cours de l'infarctus du myocarde, et l'introduction de cellules progénitrices endothéliales surexprimant pourrait promouvoir la récupération de la fonction cardiaque [11]. Il y a eu une étude illustrant que la surexpression du miR-326 améliore la fonction comportementale, améliore la viabilité neuronale et déprime l'apoptose neuronale chez des souris avec la maladie d'Alzheimer [26]. De plus, il est documenté que la surexpression du miR-326 par mimique miR-326 pourrait supprimer la synthase d'oxyde nitrique inducible dans les neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson [27].

Dans cette étude, nous avons trouvé que STAT3 était un gène cible du miR-326-5p. Soutenu par une étude avancée, il est indiqué que l'expression de STAT3 est régulée négativement par le miR-326 dans les cellules souches de carcinome endométrial humain [28]. Dans l'étude présente, nous avons mesuré que l'expression de STAT3 était augmentée dans les LCI/R. Actuellement, il a été trouvé que la lésion I/R et POG induiraient l'expression de STAT3 à augmenter [29]. Intriguant, l'expression d'ARNm STAT3 tend à un incrément chez les animaux I/R [30]. De plus, l'expression protéique STAT3 est rapportée pour se surexprimer dans les LCI/R [31]. Ensuite, notre étude a révélé que la sous-régulation de STAT3 avait des effets thérapeutiques sur les rats LCI/R et les neurones traités par POG. Comme soutenu par une étude, il est conclu que l'induction du miR-31 décourage le stress oxydatif par inactivation de la voie JAK/STAT3 dans l'AVC ischémique [32]. Aussi, l'inhibition de la voie JAK2/STAT3 est bénéfique pour l'altération du stress oxydatif dans les LCI/R [31]. De plus, le knockdown de la voie JAK/STAT3 est identifié pour améliorer la viabilité cellulaire, et réduire le stress oxydatif et l'apoptose neuronale dans la lésion cérébrale ischémique [33]. Récemment, la voie de signalisation JAK/STAT3 inhibée est témoin pour soulager l'infarctus du myocarde dans la lésion I/R myocardique [34]. Comme démontré, l'appauvrissement de STAT3 sape l'apoptose neuronale chez les rats avec lésion de la substance blanche [35]. De plus, la suppression de l'apoptose neuronale, et l'atténuation de la taille de l'infarctus cérébral sont attribuées à l'inhibition JAK2/STAT3 chez les rats avec LCI/R [36].

Finalement, nous nous sommes concentrés sur les effets du miR-326-5p et STAT3 sur l'expression de Mfn2 et avons découvert que le niveau réduit de Mfn2 chez les rats avec LCI/R et les neurones traités par POG pouvait être élevé soit en restaurant le miR-326-5p soit en silencant STAT3. Comme impliqué par une étude précédente, il est documenté que Mfn2 est diminué dans la phase tardive de la réperfusion et une expression pauvre de Mfn2 exacerbe les LCI/R via la formation d'autophagosome restreinte et la fusion autophagosome et lysosome [18]. De plus, Mfn2 est impliqué pour réduire même disparaître dans la lésion I/R dans les hépatocytes âgés [37]. Cependant, peu de recherches ont discuté du mécanisme régulateur du miR-326-5p et STAT3 pour Mfn2.

Conclusion

En général, cette étude a élucidé les mécanismes par lesquels le miR-326-5p élevé inhibe l'apoptose neuronale, atténue les dommages pathologiques des neurones et augmente l'expression de Mfn2 via la sous-régulation de STAT3 dans les LCI/R. L'étude peut mettre à jour le mécanisme potentiel du miR-326-5p et STAT3 dans les LCI/R. Cependant, plus d'études sont encore nécessaires pour le développement ultérieur du mécanisme moléculaire dans les LCI/R.

Disponibilité des données et matériaux

Non applicable.

Abréviations

miARN:

MicroARN

STAT3:

Transducteur de signal et activateur de la transcription-3

POG:

Privation d'oxygène et de glucose

OACM:

Occlusion de l'artère cérébrale moyenne

ERO:

Espèces réactives de l'oxygène

STAT:

Transducteurs de signal et activateurs de la transcription

Mfn2:

Mitofusine-2

FITC:

Fluorescéine isothiocyanate

NES:

Nestine

CN:

Contrôle négatif

Oe:

Surexpression

RT-qPCR:

Réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse

DO:

Densité optique

IP:

Iodure de propidium

MDA:

Malondialdéhyde

GSH:

Glutathion

SOD:

Superoxyde dismutase

DAB:

Diaminobenzidine

PVDF:

Fluorure de polyvinylidène

TS:

Type sauvage

Mut:

Mutant

ET:

Écart-type

ANOVA:

Analyse de variance unidirectionnelle