Le microARN-326-5p restauré inhibe l'apoptose neuronale et atténue les dommages mitochondriaux en supprimant STAT3 dans les lésions d'ischémie cérébrale/reperfusion

Introduction

L'ischémie cérébrale/lésion de reperfusion (IC/RI) est une sorte de lésion cérébrale suivie d'un AVC ischémique [1]. La caractéristique la plus caractéristique de l'I/R cérébrale est l'ischémie cérébrale transitoire initiale après reperfusion [2]. CI/RI active l'apoptose neuronale et entraîne des lésions hippocampiques et corticales [3]. À l'heure actuelle, l'application clinique la plus courante est la thrombolytique pour CI/RI [4]. Cependant, la reperfusion augmenterait la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), entraînant des dommages intracellulaires à l'ADN, des dommages liés au stress oxydatif, une oxydation des protéines et une peroxydation lipidique, détériorant ainsi davantage la barrière hémato-encéphalique et l'œdème [5]. Ainsi, l'urgence de rechercher de nouvelles options ciblées est la priorité de CI/RI.

Les microARN (miARN) sont largement considérés comme des rôles potentiels et pronostiques dans l'IC/RI [6, 7]. Par exemple, un article a démontré que miR-202-5p atténue les dommages neuronaux et les déficits neurologiques, ainsi que les dommages cellulaires induits par la privation d'oxygène et de glucose (OGD) chez des rats modèles d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) dans une lésion ischémique [8] . De plus, il a été constaté que la régulation à la hausse de miR-98 améliore les résultats neurologiques chez les souris avec AVC I/R [9] et la surexpression de miR-451 atténue l'apoptose cérébrale ischémique chez les souris avec CI/RI [10]. Plus précisément, miR-326-5p a une capacité pro-angiogénique pour les cellules progénitrices endothéliales et pourrait améliorer la fonction cardiaque après un infarctus aigu du myocarde [11]. Cependant, l'étude pivot sur miR-326-5p en CI/RI en est encore à ses balbutiements. Les transducteurs de signaux et l'activateur transcriptionnel (STAT) sont une famille unique de protéines activées par CI/RI [12]. STAT3 a été prédit comme cible de miR-326-5p sur le site Web de bioinformatique ; ainsi, nous avons étudié le rôle de STAT3 médié par miR-326-5p dans CI/RI. STAT3 détériore les processus neuro-inflammatoires ischémiques et les lésions cérébrales secondaires en libérant des médiateurs pro-inflammatoires [13, 14]. Plus précisément, la voie kinase 2(JAK2)/STAT3 activée par Janus joue un rôle fonctionnel dans le blocage de l'apoptose cellulaire induite par CI/RI [15]. La mitofusine-2 (Mfn2) est un facteur de fusion mitochondrial qui pourrait protéger contre les I/RI cardio-cérébrovasculaires [16] et améliorer l'apoptose neuronale induite par l'hypoxie dans les lésions cérébrales ischémiques [17]. Il a également été enregistré que Mfn2 exerce un effet protecteur sur CI/RI [18].

En un mot, une enquête moins approfondie a découvert le rôle combiné de miR-326-5p et STAT3 dans CI/RI. Compte tenu de cela, cette étude est lancée avec l'hypothèse que miR-326-5p atténue CI/RI via le ciblage de STAT3.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

Les expériences ont été approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'hôpital affilié de l'Université de Yangzhou; l'Université de Yangzhou, et elle a été réalisée avec le Guide de soins et d'utilisation des rats expérimentaux de l'hôpital affilié de l'Université de Yangzhou ; Université de Yangzhou.

Animaux expérimentaux

Des rats mâles adultes Sprague-Dawley (6-8 semaines, 250 ± 30 g) du Center of Comparative Medicine, Yangzhou University (Yangzhou, Chine), ont été maintenus dans un environnement spécifique exempt d'agents pathogènes avec un accès libre à la nourriture et à l'eau, (24 ± 1)°C, (50 ± 5)% d'humidité et cycle lumière/obscurité de 12 h.

Isolement et identification des cellules

Les rats ont été euthanasiés par décapitation, et leurs cerveaux ont été coupés en 1 mm ³ pour configurer des suspensions cellulaires, qui ont été mélangées avec une solution de bleu trypan à 0,4% à 9:1 (la concentration finale de bleu trypan était de 0,04%) et la densité cellulaire et le taux de survie ont été calculés par un hémocytomètre. Les cellules (1 × 10 ⁶ cellules/mL) ont été ensemencées dans un flacon de culture cellulaire pré-revêtu de L-polylysine (0,1 mg/mL) à 5 × 10 ⁶ cellules par flacon. Lorsque les cellules ont adhéré aux parois, elles ont été incubées avec le milieu renouvelé (NeurobasalA + B27 + L-glutamine) et cultivées en continu pendant 6 à 7 jours avec le milieu changé de moitié tous les 2-3 jours.

Identification cellulaire :des neurones corticaux de rat ont été utilisés pour préparer des lames de neurones qui ont été incubées avec l'anticorps polyclonal primaire de lapin anti-Nestin (NES) de lapin (1 : 200), ainsi que l'immunoglobuline de chèvre anti-lapin marquée à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) G (1:50, tous deux de Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Ensuite, les cellules ont été scellées avec un extincteur anti-fluorescent et observées par une microscopie à fluorescence.

Établissement modèle OGD

Les neurones ont été cultivés dans une solution d'Earle sans glucose et exposés à un mélange gazeux de 95 % de N₂ et 5% de CO₂ . Après 30 min de ventilation en pression positive, un environnement hypoxique s'est formé dans lequel les cellules ont été incubées (simulation d'ischémie par OGD in vitro). Après 90 min d'incubation, les cellules ont été incubées avec le milieu cellulaire d'entretien après élimination de la solution d'Earle sans glucose. Les cellules ont été cultivées en routine pour des expériences ultérieures (simulation de reperfusion par reperfusion oxygène-glucose in vitro). Le milieu normal sous normoxie a servi de témoin.

Les neurones ont été divisés dans le groupe témoin ; le groupe OGD, le groupe contrôle négatif (NC) (neurones traités par OGD transfectés avec des oligonucléotides brouillés), le groupe miR-326-5p agomir (neurones traités par OGD transfectés avec miR-326-5p agomir), le groupe sh-STAT3 (neurones traités par OGD transfectés avec shRNA STAT3) et le groupe miR-326-5p agomir + overexpression (oe)-STAT3 (neurones traités par OGD transfectés avec miR-326-5p agomir et vecteur pcDNA-STAT3). Les oligonucléotides et les vecteurs ont tous été fournis par GenePharma (Shanghai, Chine).

En utilisant la lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific), des oligonucléotides brouillés, miR-326-5p agomir, STAT3 shRNA ou miR-326-5p agomir et pcDNA-STAT3 ont été transfectés dans des neurones primaires de rat et l'efficacité de la transfection a été testée par transcription inverse quantitative réaction en chaîne par polymérase (RT-qPCR) ou Western blot après 48 h.

Dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-diphényltétrazolium (MTT)

Les neurones ont été transformés en une suspension à 1 × 10 ⁶ cellules/mL et cultivées pendant 0, 24 et 48 h, respectivement. Dans un environnement stérile, les neurones ont été incubés pendant 2 à 4 h dans une solution de MTT à 10 % et additionnés de 150 L de solution dissoute de formanzan (diméthylsulfoxyde) jusqu'à ce que le cristal soit suffisamment dissous. La valeur de la densité optique (DO) a été mesurée sur un lecteur de microplaques à 570 nm.

Test d'apoptose par cytométrie en flux

Les neurones ont été détachés avec 0,25% de trypsine, centrifugés à 2000 rpm et remis en suspension dans du PBS. Ensuite, les neurones ont été centrifugés à 2000 rpm, et le culot a été remis en suspension par un tampon de liaison et incubé successivement avec 5 L d'Annexine V-FITC et 5 L d'iodure de propidium (PI). Un cytomètre en flux a été appliqué pour détecter le taux d'apoptose.

Détection du potentiel de la membrane mitochondriale JC-1

Les cellules de la plaque à 6 puits ont été rincées avec du PBS, additionnées de 1 ml de milieu de culture cellulaire et de 1 ml de solution de travail de coloration JC-1 (50 L de JC-1, 8 ml d'eau ultrapure et 2 ml de tampon de coloration JC-1) (SolarbioScience , Pékin, Chine) et incubé pendant 15 min. Le tampon de coloration 1 x JC-1 a été configuré par 4 ml d'eau distillée et 1 ml de tampon de coloration JC-1. Après incubation, les cellules ont été trypsinisées, remises en suspension dans du tampon JC-1 et testées sur un cytomètre en flux. La proportion relative de fluorescence verte a été calculée.

Détection du stress oxydatif

Les niveaux de ROS intracellulaires ont été mesurés par le kit de détection de diacétate de 2,7-dichlorofluorescéine (DCF-DA) (Abcam). En bref, les neurones ont été détachés avec 0,25% de trypsine, remis en suspension et incubés avec 10 µm de DCF-DA pendant 30 min. Après cela, la fluorescence DCF avec lumière d'excitation/émission à 495 nm/529 nm a été mesurée par spectroscopie de fluorescence (BD Biosciences).

La détection de la malondialchehyche (MDA) intracellulaire, du contenu en glutathion (GSH) et de l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) a été détectée par colorimétrie chimique à l'aide de kits de dosage commerciaux (Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, Chine). La valeur de DO a été mesurée par un lecteur de microplaques.

Établissement de modèle de rat

Les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (50 µg/kg). Une incision médiane a été pratiquée sur le cou, la carotide externe a été ligaturée et l'artère carotide commune a été bloquée avec un clip artériel. Une suture en nylon monofilament enduit de silicone 3-0 a été soigneusement insérée dans l'artère carotide interne jusqu'à une légère résistance. Après 90 min d'ischémie cérébrale transitoire, la suture a été retirée et une reperfusion a été réalisée pendant 24 h supplémentaires. Le groupe simulé a reçu le même traitement, sauf que la suture n'a pas pénétré dans l'artère carotide interne. Pendant l'opération, un lit thermostatique a été utilisé pour maintenir la température rectale à 37 ± 0,5 °C [19].

Les rats ont été répartis en 6 groupes (n = 6) et injectés de plasmide ou de miR dans le cérébroventriculaire latéral avant l'établissement de modèles MCAO, y compris le groupe simulé, le groupe MCAO (rats modélisés), le groupe NC (rats modélisés avec injection cérébroventriculaire latérale de 5 L d'oligonucléotides brouillés [100 M]), le groupe miR-326-5p agomir (rats modélisés avec injection cérébroventriculaire latérale de 5 L miR-326-5p agomir [100 M]), le groupe sh-STAT3 (rats modélisés avec injection cérébroventriculaire latérale de 5 L de vecteur d'interférence STAT3 [100 μM]) et le groupe miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (rats modélisés avec injection cérébroventriculaire latérale de 5 L miR-326-5p agomir [100 M] et 5 μL vecteur de surexpression STAT3 [100 M]) [20, 21].

Collection de spécimens

Les rats ont été euthanasiés par anesthésie, les cœurs ont été perfusés et les cerveaux entiers ont été obtenus. Les tissus cérébraux lésés ont été coupés en 1 × 1 × 1 mm ³ masses tissulaires pour la préparation de coupes en paraffine, la RT-qPCR, l'analyse western blot et la détection du potentiel membranaire mitochondrial.

Détection du potentiel de la membrane mitochondriale dans le cortex cérébral

Le cortex cérébral de rats SD a été séparé et coupé en 1 mm ³ . Les blocs de tissus ont été placés sur un filet en nylon de 300 mesh et additionnés de PBS. Ensuite, la suspension cellulaire a été centrifugée à 1000 tr/min, additionnée d'éthanol à 70 % et centrifugée à nouveau à 1000 tr/min. Ensuite, l'échantillon a été remis en suspension dans 1 mL de PBS, et la suspension (1 × 10 ⁶ cellules, 100 L) a été mis à réagir avec une solution de colorant Rhodamine123 (10 L, 5 g/mL) et analysé sur un cytomètre en flux à 488 nm.

Coloration HE

Le tissu cérébral de rat a été immergé dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h, et des coupes de paraffine ont été préparées, coupées en 4 µm, étalées dans de l'eau à 40 °C et cuites à 60 °C. Régulièrement déparaffinées et hydratées, les coupes en paraffine ont été colorées par une solution de coloration HE. Après coloration HE, les neurones endommagés ont montré une contraction du noyau, un œdème cellulaire, une vacuolisation et des noyaux assombris. Le microscope optique (Nikon, Japon) a été utilisé pour obtenir l'image, et le nombre de neurones survivants (mm ² ) du cortex ischémique a été compté.

Coloration TUNEL

Les coupes en paraffine ont été déparaffinées et déshydratées avec de l'alcool à 100 %, 95 %, 80 % et 70 %. Ensuite, les coupes ont été immergées dans du paraformaldéhyde à 4 %, ce qui a été suivi d'une incubation avec un tampon de citrate de sodium Triton X-100 à 0,1 % pendant 20 min et le mélange réactionnel TUNEL pendant 1 à 1,5 h. Ensuite, les sections ont été développées par une solution de peroxydase et de diaminobenzidine (DAB), contre-colorées par de l'hématoxyline, déshydratées par un gradient d'alcool, perméabilisées et scellées dans une gomme neutre. Les coupes ont été observées au microscope optique pour compter les cellules TUNEL-positives. Les particules jaune brunâtre dans le noyau ont été définies comme des cellules TUNEL-positives (cellules apoptotiques).

Immunohistochimie

Les coupes ont été déparaffinées, hydratées et récupérées par l'antigène citrate, et la catalase endogène a été bloquée par 3% H₂ O₂ . Chaque section a été additionnée de sérum de chèvre (50 L), incubée avec l'anticorps primaire (50 L) et mise à réagir avec l'anticorps secondaire (50 L) et de la streptavidine marquée à la peroxydase de raifort (50 L). Les coupes ont été développées par DAB et contre-colorées à l'hématoxyline, qui ont été suivies d'une déshydratation par gradient d'alcool, d'une perméabilisation au xylène et d'un scellement de gomme neutre. Les coupes ont été observées au microscope (le cytoplasme ou le noyau des tissus cérébraux ischémiques était constitué de particules jaunes ou jaune brunâtre). Les valeurs de DO ont été mesurées et moyennées.

RT-qPCR

L'extraction de l'ARN total des tissus et des cellules a été réalisée par Trizol (Invitrogen). L'expression de l'ARNm a été analysée par qPCR en utilisant SYBR Green PCR Mix (Applied Biosystems, CA, USA) et le système de PCR en temps réel QuantStudio TM 6Flex (Applied Biosystems). Des amorces spécifiques de transcription inverse tige-boucle et des amorces directes/inverses (BioTNT, Shanghai, Chine) ont été conçues pour analyser les niveaux de miARN. Le tableau 1 répertorie toutes les amorces. Le 2 ^−△△CT méthode a été adoptée pour calculer les niveaux de miARN ou d'ARNm.

Analyse Western Blot

Les échantillons de protéines ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sulfate de sodium à 10 % et électroblottés sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF). Après cela, la membrane PVDF a été bloquée avec 5 % de poudre de lait écrémé dans une solution saline contenant du Tris, sondée avec les anticorps primaires et re-sondée avec l'anticorps secondaire pendant 2 h. Ensuite, les bandes de protéines ont été analysées avec du tampon phosphatase alcaline contenant du chlorure de Nitroblue tetrazolium et du 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate et quantifiées par le logiciel ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Les principaux anticorps étaient STAT3 (1:1000), Mfn2 (1:1000, Abcam, MA, USA) et la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Dosage du gène rapporteur double luciférase

Le STAT3 3'UTR contenant les sites de liaison miR-326-5p de type sauvage (WT) ou mutant (Mut) a été cloné dans le vecteur pmirGLO (Promega, WI, USA), nommé STAT3-WT et STAT3-Mut. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de 24 puits à 2 × 10 ⁴ cellules/puits et co-transfectées avec 100 ng de vecteur luciférase STAT3-WT ou STAT3-Mut et 50 nM miR-326-5p agomir ou it agomir NC à 70 % de confluence. L'activité de la luciférase a été mesurée à l'aide du Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Corporation, WI, États-Unis).

Analyse statistique

Le logiciel statistique SPSS 21.0 (IBM, NY, USA) a été utilisé pour l'analyse des données. Les données ont été exprimées en moyenne ± ± écart type (SD). La différence entre les deux groupes a été analysée par le test t de Student, tandis que les comparaisons multiples ont été analysées par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA), suivie du test post hoc de Tukey. P test bilatéral représenté, et P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

La régulation à la hausse de miR-326-5p ou la régulation à la baisse de STAT3 atténue l'apoptose des neurones corticaux traités par OGD

Cultivés pendant une semaine, les neurones corticaux du rat ont été différenciés et mûris. Au microscope, les neurones présentaient des corps neuronaux plus gros, un cytoplasme plus transparent, un gros noyau à faible densité et un indice de réfraction élevé. Les corps des neurones étaient coniques ou ronds, et les dendrites étaient décalées et adhéraient aux parois (Fig. 1a, b). NES était un marqueur chimique spécifique des neurones cérébraux pour localiser les neurones avec une spécificité élevée par dosage d'immunofluorescence. Les neurones se lient spécifiquement à la NES et présentent une fluorescence verte (Fig. 1c).

La régulation à la hausse de miR-326-5p ou la régulation à la baisse de STAT3 atténue l'apoptose des neurones corticaux traités par OGD. un Neurones cérébraux avec culture adhérente 2 jours (barre d'échelle :100 m) ; b Neurones cérébraux avec culture adhérente 7 jours (barre d'échelle :100 m); c Neurones cérébraux avec culture adhérente 7 jours colorées par dosage d'immunofluorescence NES (barre d'échelle :50 m) ; d Viabilité des neurones corticaux traités par OGD par dosage MTT ; e Apoptose des neurones corticaux traités par OGD détectée par cytométrie en flux ; f Taux d'apoptose des neurones corticaux traités par OGD ; g Expression de l'ARNm de Bcl-2 et de Bax dans les neurones corticaux traités par OGD ; *P < 0,05 par rapport au groupe témoin ; #P < 0,05 par rapport au groupe NC ; &P < 0,05 par rapport au groupe miR-326-5p agomir

Le test MTT a été appliqué pour détecter la viabilité des neurones corticaux (Fig. 1d). Les résultats ont démontré que la viabilité des neurones corticaux du rat était altérée dans le groupe OGD et le groupe miR-326-5p agomir + oe-STAT3 par rapport au groupe témoin et au groupe miR-326-5p agomir, mais améliorée dans le groupe miR-326-5p groupe agomir et groupe sh-STAT3 versus groupe NC (tous P < 0,05).

L'apoptose des neurones corticaux du rat a été déterminée par cytométrie en flux, tandis que l'expression des ARNm de Bcl-2 et Bax par RT-qPCR (Fig. 1e–g). Les résultats ont expliqué qu'en comparaison avec le groupe témoin et le groupe miR-326-5p agomir, le groupe OGD et le groupe miR-326-5p agomir + oe-STAT3 ont démontré un taux d'apoptose accru, une expression réduite de Bcl-2 et une expression accrue de Bax. (tous les P < 0,05). Avec les groupes NC en revanche, le taux d'apoptose a été abaissé, le niveau de Bcl-2 a été élevé et le niveau de Bax a été supprimé dans le groupe miR-326-5p agomir et le groupe sh-STAT3 (tous P < 0,05).

La régulation à la hausse de miR-326-5p ou la régulation à la baisse de STAT3 augmente Mfn2 et le niveau potentiel de la membrane mitochondriale dans les neurones corticaux après une lésion OGD

L'expression de Mfn2 dans les neurones corticaux traités par OGD a été détectée par analyse de transfert de Western (Fig. 2a, b). En ce qui concerne le groupe témoin et le groupe miR-326-5p agomir, l'expression de la protéine Mfn2 a été réduite dans le groupe OGD et miR-326-5p agomir + oe-STAT3, alors qu'elle augmentait dans le groupe miR-326-5p agomir et sh -Groupe STAT3 versus groupe NC (tous les P < 0,05).

La régulation à la hausse de miR-326-5p ou la régulation à la baisse de STAT3 augmente Mfn2 et le niveau de potentiel de la membrane mitochondriale dans les neurones corticaux traités par OGD. un , b Expression de la protéine Mfn2 dans les neurones corticaux traités par OGD ; c Cytométrie en flux JC-1 du niveau de potentiel de la membrane mitochondriale dans les neurones corticaux traités par OGD ; d Contenu ROS dans les neurones corticaux traités par OGD après régulation positive de miR-326-5p ou régulation négative de STAT3 ; e Activité GSH dans les neurones corticaux traités par OGD après régulation positive de miR-326-5p ou régulation négative de STAT3 ; f Contenu en MDA dans les neurones corticaux traités par OGD après régulation positive de miR-326-5p ou régulation négative de STAT3 ; g Activité SOD dans les neurones après régulation positive de miR-326-5p ou régulation négative de STAT3 ; *P < 0,05 par rapport au groupe témoin ; #P < 0,05 par rapport au groupe NC ; &P < 0,05 par rapport au groupe miR-326-5p agomir

Le potentiel membranaire mitochondrial détecté par JC-1 a révélé que (Fig. 2c, d) par rapport au groupe témoin et au groupe miR-326-5p agomir, le niveau de potentiel membranaire mitochondrial diminuait dans le groupe OGD et le miR-326-5p agomir + groupoe-STAT3 groupe (tous les P < 0,05). Par rapport aux groupes NC, le niveau de potentiel de la membrane mitochondriale a augmenté dans le groupe miR-326-5p agomir et le groupe sh-STAT3 (tous P < 0,05).

Les contenus ROS et MDA, et les activités GSH et SOD dans les neurones corticaux traités par OGD ont été déterminés et les résultats ont indiqué que par rapport au groupe témoin et au groupe miR-326-5p agomir, le groupe OGD et le miR-326-5p agomir + oe -Le groupe STAT3 a présenté une augmentation des contenus ROS et MDA et des activités GSH et SOD altérées (tous les P < 0,05). En comparaison avec les groupes NC, le groupe miR-326-5p agomir et le groupe sh-STAT3 ont montré des contenus ROS et MDA réduits et des activités GSH et SOD renforcées (tous les P < 0,05) (Fig. 2e–g).

La régulation à la hausse de miR-326-5p ou la régulation à la baisse de STAT3 empêche les dommages pathologiques des neurones corticaux et inhibe l'apoptose chez les rats avec CI/RI

La coloration HE a été adoptée pour observer les dommages pathologiques des tissus cérébraux (Fig. 3a, b), montrant que dans le groupe fictif, les neurones étaient de structure normale et bien agencés avec un cytoplasme rouge pâle, un noyau bleu et un nucléole clair. Dans le groupe MCAO, le groupe NC et le groupe miR-326-5p agomir + oe-STAT3, à l'exception de la nécrose, il a été observé que les neurones étaient disposés de manière désordonnée et colorés plus sombres, avec rupture de la membrane nucléaire, disparition de la structure cellulaire, caryopycnose, profondeur noyau coloré et lyse en grande quantité. Dans le groupe miR-326-5p agomir et le groupe sh-STAT3, le gonflement des neurones a été atténué et les neurones ont été organisés de manière ordonnée, et les cellules nécrotiques ont été réduites, indiquant un meilleur statut par rapport au groupe MCAO et au groupe NC.

La régulation à la hausse de miR-326-5p ou la régulation à la baisse de STAT3 empêche les dommages pathologiques des neurones corticaux et inhibe l'apoptose chez les rats avec CI/RI. un Dommages pathologiques des tissus cérébraux chez les rats MCAO observés par coloration HE (barre d'échelle :50 m); b Le nombre de neurones intacts des tissus cérébraux du rat MCAO après régulation positive de miR-326-5p ou régulation négative de STAT3 ; c Apoptose neuronale dans les tissus cérébraux du rat MCAO détectée par coloration TUNEL (barre d'échelle :50 m); d Taux TUNEL-positifs dans les tissus cérébraux du rat MCAO après régulation positive de miR-326-5p ou régulation négative de STAT3 ; e Expression de l'ARNm de Bcl-2 et de Bax dans les tissus cérébraux du rat MCAO après régulation positive de miR-326-5p ou régulation négative de STAT3 ; *P < 0,05 par rapport au groupe simulé ; #P < 0,05 par rapport au groupe NC ; &P < 0,05 par rapport au groupe miR-326-5p agomir

La coloration TUNEL a été utilisée pour la détection de l'apoptose neuronale et la RT-qPCR pour l'expression de l'ARNm de Bcl-2 et Bax dans les tissus cérébraux. Les résultats ont montré que (Fig. 3c-e) par rapport au groupe sham et au groupe miR-326-5p agomir, le taux de TUNEL positif a augmenté, l'expression de l'ARNm de Bcl-2 a diminué et l'expression de l'ARNm de Bax a augmenté dans le groupe MCAO et le groupe miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (tous P < 0,05). Un taux de TUNEL positif et une expression d'ARNm de Bax inférieurs, et une expression d'ARNm de Bcl-2 plus élevée ont été observés dans le groupe miR-326-5p agomir et le groupe sh-STAT3 que dans le groupe NC (tous P < 0,05).

La régulation à la hausse de miR-326-5p ou la régulation à la baisse de STAT3 augmente le niveau potentiel de la membrane mitochondriale dans les tissus cérébraux des rats avec CI/RI

La détection de l'expression de la protéine Mfn2 dans le tissu cérébral du rat a été réalisée par immunohistochimie, et les résultats ont montré que (Fig. 4a, b) une expression plus faible de la protéine Mfn2 a été testée dans le groupe simulé et le groupe miR-326-5p agomir par rapport au groupe MCAO et au groupe miR-326-5p agomir  +  oe-STAT3, tandis que l'expression plus élevée de la protéine Mfn2 a été mesurée dans le groupe miR-326-5p agomir et le groupe sh-STAT3 au lieu du groupe NC (tous P < 0,05).

La régulation à la hausse de miR-326-5p ou la régulation à la baisse de STAT3 augmente le niveau de potentiel de la membrane mitochondriale dans les tissus cérébraux chez les rats avec CI/RI. un Expression de Mfn2 détectée par immunohistochimie dans le tissu cérébral de rat (barre d'échelle :50 m); b Nombre de cellules positives pour Mfn2 dans les tissus cérébraux de rat MCAO après régulation positive de miR-326-5p ou régulation négative de STAT3 ; c Potentiels transmembranaires mitochondriaux dans les neurones des tissus cérébraux du rat MCAO après régulation positive de miR-326-5p ou régulation négative de STAT3 ; *P < 0,05 par rapport au groupe simulé ; #P < 0,05 par rapport au groupe NC ; &P < 0,05 par rapport au groupe miR-326-5p agomir

La détection du niveau de potentiel de la membrane mitochondriale a découvert que (Fig. 4c) par rapport au groupe sham et au groupe miR-326-5p agomir, le niveau de potentiel de la membrane mitochondriale a diminué dans le groupe MCAO et le miR-326-5p agomir + oe-STAT3 groupe, alors qu'il a augmenté dans le groupe miR-326-5p agomir et le groupe sh-STAT3 contrairement au groupe NC (tous P < 0,05).

miR-326-5p Cibles STAT3

L'expression de miR-326-5p et de STAT3 dans les neurones corticaux et les tissus cérébraux a été détectée par RT-qPCR et analyse western blot. Dans les neurones corticaux in vitro, une diminution suggérée de l'expression de miR-326-5p et une augmentation de l'expression de STAT3 dans le groupe OGD par rapport au groupe témoin (à la fois P < 0,05). En ce qui concerne le groupe NC, l'expression miR-326-5p élevée et l'expression STAT3 réduite dans le groupe miR-326-5p agomir (les deux P < 0,05) ; L'expression de STAT3 a diminué (P < 0,05) dans le groupe sh-STAT3. Contrairement au groupe miR-326-5p agomir, l'expression de STAT3 a été augmentée dans le groupe miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (P < 0,05) (Fig. 5a–c).

miR-326-5p cible STAT3. un expression de l'ARNm de miR-326-5p et STAT3 dans les neurones corticaux traités par OGD in vitro ; b , c Expression de la protéine STAT3 dans les neurones corticaux traités par OGD in vitro ; d expression de l'ARNm miR-326-5p et STAT3 dans les tissus cérébraux du rat MCAO ; e , f Expression de la protéine STAT3 dans les tissus cérébraux du rat MCAO ; g Site de liaison prévu de miR-326-5p et STAT3 par un logiciel de bioinformatique ; h La relation de ciblage entre miR-326-5p et STAT3 validée par le test du gène rapporteur double luciférase ; Dans la figure a –c , *P < 0,05 par rapport au groupe témoin ; #P < 0,05 par rapport au groupe NC ; &P < 0,05 par rapport au groupe miR-326-5p agomir. Dans la figure d –f , *P < 0,05 par rapport au groupe simulé ; #P < 0,05 par rapport au groupe NC ; &P < 0,05 par rapport au groupe miR-326-5p agomir

Dans les tissus cérébraux in vivo, par rapport au groupe fictif, un miR-326-5p inférieur et un STAT3 supérieur sont apparus dans le groupe MCAO (à la fois P < 0,05). Par rapport au groupe NC, l'expression de miR-326-5p a augmenté tandis que l'expression de STAT3 a diminué dans le groupe d'agomir miR-326-5p (à la fois P < 0,05). L'expression de STAT3 a diminué dans le groupe sh-STAT3 (P < 0,05). En revanche, avec le groupe miR-326-5p agomir, l'expression de STAT3 est élevée dans le groupe miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (P < 0,05) (Fig. 5d–f).

Les sites potentiels de ciblage miR-326-5p sur STAT3 3′UTR ont été trouvés par les logiciels DIANA et miRDB (Fig. 5g). STAT3 3'UTR contenant le site de liaison WT miR-326-5p et le site de liaison Mut ont été construits et insérés dans le plasmide pmirGLO. La liaison de miR-326-5p à STAT3 3′UTR a été en outre validée par le test de rapporteur de luciférase. Le test du rapporteur de la luciférase a révélé que miR-326-5p agomir réduisait l'activité relative de la luciférase de STAT3-WT, mais pas de STAT3-Mut (Fig. 5h), ce qui implique que STAT3 était un gène cible direct de miR-326-5p.

Discussion

L'IC/RI est la principale cause de décès cérébrovasculaire [22]. Les miARN sont indiqués pour être impliqués dans CI/RI [23]. Cependant, la compréhension globale du mécanisme lié à miR-326-5p est encore insuffisante en CI/RI. Ainsi, cette étude vise à découvrir les rôles concrets de miR-326-5p dans CI/RI en mettant l'accent sur la réciproque combinée de miR-326-5p et STAT3. De manière productive, cette étude a déclaré que la régulation à la hausse de miR-326-5p atténuait CI/RI et augmentait l'expression de Mfn2 via l'inhibition de STAT3.

Au début, il a été déterminé que l'expression de miR-326-5p réduisait CI/RI in vivo et in vitro. Par la suite, nous avons organisé une série d'essais et constaté que la régulation à la hausse de miR-326-5p améliorait la viabilité des neurones et la fonction mitochondriale, augmentait l'expression de Mfn2 et limitait le stress oxydatif et l'apoptose. En outre, des expériences in vivo chez le rat ont confirmé les rôles fonctionnels du miR-326-5p restauré dans CI/RI. As a matter of fact, high miR-326 is proved to correlate with long overall survival of patients with glioblastoma, the common type of brain tumor [24]. Also, miR-326 expression has been further evidenced to reduce in Parkinson's disease and miR-326 could suppress apoptosis of dopaminergic neurons and reduce inflammatory response [25]. Except for that, the reduction in miR-326-5p is manifested in endothelial progenitor cells in the course of myocardial infarction, and introduction of endothelial progenitor cells overexpressing could promote cardiac function recovery [11]. There has been a study illustrating that up-regulation of miR-326 improves the behavioral function, enhances neuronal viability and depresses neuronal apoptosis in mice with Alzheimer's disease [26]. Furthermore, it is documented that up-regulation of miR-326 by miR-326 mimic could suppress inducible nitric oxide synthase in dopaminergic neurons in Parkinson's disease [27].

In this study, we found that STAT3 was a target gene of miR-326-5p. Supported by an advanced study, it is indicated that STAT3 expression is negatively regulated by miR-326 in human endometrial carcinoma stem cells [28]. In the present study, we measured that STAT3 expression was enhanced in CI/RI. Currently, it has been found that I/R injury and OGD would induce STAT3 expression to increase [29]. Intriguingly, STAT3 mRNA expression trends to an increment in I/R animals [30]. Additionally, STAT3 protein expression is reported to up-regulate in CI/RI [31]. Next, our study revealed that down-regulating STAT3 had the therapeutic effects on CI/RI rats and OGD-treated neurons. As supported by a study, it is concluded that miR-31 induction discourages oxidative stress by inactivation of JAK/STAT3 pathway in ischemic stroke [32]. Also, inhibition of JAK2/STAT3 pathway is beneficial to oxidative stress impairment in CI/RI [31]. Furthermore, knockdown of JAK/STAT3 pathway is identified to enhance cell viability, and reduce oxidative stress and neuron apoptosis in ischemic brain injury [33]. Lately, inhibited JAK/STAT3 signaling pathway is witnessed to relieve myocardial infarction in myocardial I/R injury [34]. As demonstrated, depleted STAT3 undermines neuronal apoptosis in rats with white matter injury [35]. Moreover, the suppression of neuronal apoptosis, and alleviation of cerebral infarct size are attributed to JAK2/STAT3 inhibition in rats with CI/RI [36].

Finally, we focused on the effects of miR-326-5p and STAT3 on Mfn2 expression and discovered that the reduced level Mfn2 in rats with CI/RI and OGD-treated neurons could be elevated by either restoring miR-326-5p or silencing STAT3. As implicated by a previous study, it is documented that Mfn2 is decreased in the lately phase of reperfusion and poorly expressed of Mfn2 exacerbates CI/RI via restrained autophagosome formation and autophagosome and lysosome fusion [18]. Additionally, Mfn2 is implied to reduce even disappear in I/R injury in old hepatocytes [37]. However, few researches have discussed the regulatory mechanism of miR-326-5p and STAT3 for Mfn2.

Conclusion

In general, this study has elucidated the mechanisms that elevated miR-326-5p inhibits neuronal apoptosis, attenuates pathological damage of neurons and increases the expression of Mfn2 via STAT3 downregulation in CI/RI. The study may update the potential mechanism of miR-326-5p and STAT3 in CI/RI. However, more studies are still needed for further development of the molecular mechanism in CI/RI.

Disponibilité des données et des matériaux

Non applicable.

Abréviations

miRNAs:

MicroRNAs

STAT3:

Signal transducer and activator of transcription-3

OGD:

Oxygen and glucose deprivation

MCAO:

Middle cerebral artery occlusion

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

STAT:

Signal transducers and transcriptional activator

Mfn2:

Mitofusin-2

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

NES:

Nestin

NC :

Contrôle négatif

Oe:

Surexpression

RT-qPCR :

Réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcription inverse

OD :

Densité optique

IP :

Propidium iodide

MDA :

Malondialchehyche

GSH :

Glutathione

SOD :

Superoxyde dismutase

DAB:

Diaminobenzidine

PVDF :

Fluorure de polyvinylidène

WT:

Wild-type

Mut:

Mutant

SD :

Écart type

ANOVA :

Analyse unidirectionnelle de la variance