La régulation à la baisse du microARN-342-5p ou la régulation à la hausse de Wnt3a inhibe l'angiogenèse et maintient la stabilité de la plaque athéroscléreuse chez les souris atteintes d'athérosclérose

Introduction

L'athérosclérose (SA) est une maladie artérielle liée à l'âge caractérisée par l'épaississement, la sténose, le durcissement et la formation de plaques d'athérosclérose des artères [1]. C'est la principale cause de décès et de morbidité dans les pays développés [2]. Des études histopathologiques des lésions athéroscléreuses humaines ont montré que le développement et la rupture de la plaque sont caractérisés par une expansion du noyau lipidique/nécrotique, une réduction du nombre de cellules musculaires lisses, une infiltration de macrophages et une diminution de la teneur en collagène [3]. Les éléments cellulaires clés de la SA comprennent l'hyperlipidémie, la formation de cellules spumeuses, la différenciation en macrophages, le recrutement de monocytes et l'inflammation induite [4]. Bien que de nombreux médicaments pour le traitement de la SA aient été largement utilisés en clinique, certains sous-groupes de patients présentent encore un risque élevé d'infarctus du myocarde, d'ischémie myocardique, d'insuffisance cardiaque et d'accident vasculaire cérébral [5]. Par conséquent, une exploration plus poussée des mécanismes moléculaires potentiels peut offrir plus de preuves pour le traitement de la SA.

Un seul microARN (miARN) peut réguler simultanément plusieurs gènes cibles [6]. miR-342-5p est étudié pour être contenu dans le cluster de miARN 14q32 imprimé, agit comme une molécule innovante en aval Notch [7] et module plusieurs voies angiogéniques, telles que la signalisation du facteur de croissance transformant β et le facteur de croissance endothélial vasculaire [8]. Les microARN immunomodulateurs connexes, tels que miR-342-5p, ont de multiples rôles importants dans la régulation de la progression de l'athérosclérose [9]. De plus, certains miARN ont été suggérés pour impliquer dans la résolution de la SA, tels que miR-155 et miR-217 [10, 11]. Une étude a rapporté que miR-342-5p agit comme un nouveau modulateur pour l'activation des macrophages dans la SA [12]. Une autre étude a révélé que le miR-342-5p dérivé des macrophages facilite la SA et augmente la stimulation inflammatoire des macrophages [13]. Qu et al. ont trouvé que l'expression de Wnt3a est modulée négativement par miR-342-5p dans les malformations ano-rectales [14], indiquant qu'il existe une relation cible entre miR-342-5p et Wnt3a. La signalisation Wnt joue un rôle essentiel au cours de l'embryogenèse pour la modulation de la polarité cellulaire, la prolifération cellulaire, la formation de l'axe et l'apoptose [15]. Wnt3a, un composant clé du gène du mésoderme, joue un rôle crucial dans le développement embryonnaire [16]. Il a été présenté que l'analyse guidée par l'épigénome du transcriptome des macrophages de la plaque au cours de la régression de la SA révèle l'activation de la voie de signalisation Wnt [17]. De plus, une étude a rapporté que Wnt3a module l'adhésion et la migration des cellules musculaires lisses vasculaires qui contribuent à la pathogenèse de la SA et de la resténose [18]. Par conséquent, cette étude a pour la première fois exploré l'effet de miR-342-5p ciblé Wnt3a sur la formation de plaques vulnérables et l'angiogenèse de la SA.

Matériaux et méthodes

Déclaration d'éthique

Les animaux ont été traités sans cruauté en utilisant des procédures approuvées conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Hôpital populaire de la province de Qinghai (numéro éthique :201870726).

Animaux expérimentaux

ApoE mâle ^−/− des souris et des souris C57BL/6J (grade sans agent pathogène spécifique) âgées de 8 semaines étaient disponibles auprès de Beijing Vital Laboratory Animal Technology (Beijing, Chine). Les souris (5 à 6 souris dans une cage) ont été hébergées avec un cycle jour/nuit de 12 h/12 h avec un accès à volonté à la nourriture et à l'eau.

Établissement de modèles de souris d'AS

ApoE ^−/− les souris ont été nourries avec des aliments riches en graisses pendant 16 semaines pour établir le modèle de plaque vulnérable AS. Des souris C57BL/6 J ont été utilisées comme groupe normal avec des boissons et de la nourriture naturelles. ApoE ^−/− les souris avaient des poils clairs et brillants et une chute des poils dans le dos après 12 semaines. L'arc aortique et l'artère brachiocéphalique de 3 souris modèles ont été disséqués pour effectuer une coloration à l'hématoxyline-éosine (HE), et il n'y avait pas de dépôts de plaque significatifs sur l'intima. 3 autres souris modélisées ont été identifiées à nouveau après 4 semaines, et la coloration HE a montré qu'il y avait des dépôts de plaque évidents sur l'intima de la crosse de l'aorte, indiquant le succès de l'établissement du modèle.

Regroupement et traitement des souris

ApoE ^−/− les souris avec plaque vulnérable AS ont été divisées en 6 groupes avec 12 souris dans chaque groupe :groupe AS, groupe témoin négatif (NC) (injecté avec une solution saline normale dans ApoE ^−/− souris), groupe miR-342-5p agomir (injecté avec miR-342-5p agomir pour surexprimer l'expression miR-342-5p dans ApoE ^−/− souris), groupe miR-342-5p antagomir (injecté avec miR-342-5p antagomir pour réduire l'expression de miR-342-5p dans ApoE ^−/− souris), surexpression (oe)-groupe Wnt3a (injecté avec le vecteur oe-Wnt3a pour réguler à la hausse l'expression Wnt3a dans ApoE ^−/− souris) et le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (injecté avec miR-342-5p agomir et le vecteur oe-Wnt3a pour réguler à la hausse l'expression de miR-342-5p et Wnt3a dans ApoE ^−/− souris). Les souris C57BL/6 J en tant que groupe normal ont été nourries avec un régime alimentaire normal. L'aliment riche en matières grasses contenait 20 % de matières grasses et 0,25 % de cholestérol. miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir et oe-Wnt3a vector ont été achetés à Sangon (Shanghai, Chine). Le vecteur oe-Wnt3a, miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir ont tous été dissous dans 0,2 ml de solution saline normale et injectés à des souris à une dose de 40 mg/kg via la veine caudale toutes les deux semaines. Après 8 semaines, des échantillons de sang ont été prélevés dans les globes oculaires, puis des souris ont été euthanasiées pour prélever des tissus artériels [19].

Dans l'expérience préliminaire, ApoE ^−/− des souris atteintes de SA ont reçu une injection de 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir ou vecteur oe-Wnt3a (une fois toutes les deux semaines ; 4 fois au total). Ensuite, les niveaux d'expression de la -caténine ont été détectés par amplification en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR).

Collecte et traitement des échantillons

Avant l'échantillonnage, les souris ont été à jeun pendant 12 h et anesthésiées par inhalation d'éther et des échantillons de sang ont été prélevés dans les globes oculaires. Le thorax des souris a été ouvert, l'aorte thoracique a été dissociée à l'extrémité de l'aorte abdominale et le vaisseau entier a été retiré. Après avoir été nettoyés par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans ARN, les tissus ont été inclus pour la coloration HE, le rouge huileux O, la coloration rouge Sirius et la coloration immunohistochimique. Certains des tissus vasculaires ont été conservés à - 80 °C pour la RT-qPCR et le Western blot.

Détection du taux de lipides sanguins

L'analyseur biochimique automatique (Roche, Bâle, Suisse) a été adopté pour détecter le cholestérol total (TC), les triglycérides (TG), le cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL-C) et le cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL-C) dans le sérum. La détection a été mise en œuvre suivant la spécification des kits (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine).

Essai immuno-enzymatique (ELISA)

Détermination de la teneur en cytokines sériques :des kits ELISA commerciaux d'interleukine (IL)-5, d'IL-12p70, de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et d'interféron (IFN)-γ ont été utilisés. Enfin, la valeur de la densité optique (DO) de chaque puits a été testée par un lecteur de microplaques à 450 nm.

Détermination des lésions de stress oxydatif :la teneur en malondialdeyde (MDA) et l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) dans le sérum ont été testées par le kit MDA (la valeur OD a été testée par spectrophotomètre à 532 nm) et le kit SOD (la valeur OD a été déterminée par un lecteur de microplaque à 450 nm) nm). Les kits ELISA IL-5, IL-12p70, TNF-α, IFN-γ, MDA et SOD ont été achetés auprès de MultiSciences (Lianke) Biotechnology Corporate Limited (Hangzhou, Zhejiang, Chine).

Coloration HE, coloration Oil Red O et coloration Sirius Red

Après fixation et enrobage, les spécimens ont été découpés en sections consécutives de 4 micromètres d'épaisseur. Les tranches ont été déparaffinées et hydratées, colorées à l'hématoxyline et à l'éosine, différenciées, déshydratées, nettoyées au xylène, séchées et scellées par de la gomme neutre. Le noyau était bleu et d'autres tissus tels que le cytoplasme et les tissus conjonctifs étaient rouges dans différentes nuances. La formation de plaque a été observée par un microscope à fluorescence. Les parois artérielles des coupes colorées à l'HE ont été sélectionnées au microscope et les résultats expérimentaux ont été collectés par un appareil photo numérique. Le module logiciel d'analyse d'images Image Pro Plus6.0 (IPP6.0) a été utilisé pour calculer la surface de plaque de la section transversale de chaque tranche et la surface de la paroi ainsi que leur rapport.

Des tranches de 4 à 5 μm ont été choisies pour la coloration O rouge à l'huile. Les tranches ont été séchées avec une température excessive pendant 20 min et incubées avec de l'isopropanol à 100 % pendant 5 min. Ensuite, les tranches ont été incubées avec une solution de coloration O rouge à l'huile à 0,5 % dans un four à 60 °C pendant 8 min, lavées dans de l'isopropanol à 85 % pendant 3 min, teintes à l'hématoxyline pendant 1 min, nettoyées et scellées. Les résultats de la coloration à l'huile rouge O suggèrent que le lipide est rouge ou orange et que le noyau est bleu clair. Le logiciel IPP6.0 a été utilisé pour calculer la zone de graisse et la zone de plaque dans la plaque de la tranche de tissu. La teneur en lipides = Oil rouge O zone de coloration positive/zone de plaque × 100 %.

Coloration au rouge Sirius :les tranches ont été déparaffinées et hydratées, teintes pendant 10 min avec une solution de coloration au bleu de célestine, avec une solution de coloration au rouge Sirius pendant 20 min et contre-colorées pendant 10 min avec de l'hématoxyline. Enfin, les tranches ont été déshydratées par gradient d'éthanol, nettoyées au xylène et scellées avec de la gomme neutre. La zone de collagène dans la plaque de la tranche de tissu a été calculée par le logiciel IPP6.0. La zone de collagène =  zone de coloration positive au rouge Sirius/zone de plaque × 100 %. Le pourcentage de lipides et de collagène dans la zone de plaque a été calculé.

L'hématoxyline, l'éosine et le colorant Sirius étaient disponibles auprès de China Pharmaceutical Group Shanghai Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Chine). La poudre d'O rouge à l'huile a été achetée à Sigma-Aldrich Chemical Company (St Louis, MO, USA).

Réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR)

Les tissus aortiques ont été ajoutés au réactif d'extraction d'ARN total Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA) puis homogénéisés pour extraire l'ARN total et composé d'ADN complémentaire. Les amorces ont toutes été référencées à la séquence fournie par Genbank, conçue par Primer 5.0 et synthétisée par Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. société, Hilden, Allemagne); Wnt3a :sens direct :5′-AGGTAAGCTACTCCCTCAACTA-3′, sens inverse :5′-CTGAAGCACCCTCTCATGTATC-3′; -actine :directe :5′-GCACCACACCTTCTACAATGAGC -3′, inverse :5′-TCGTTGCCAATAGTGATGACC-3′; β-caténine :direct :5′-TCAAGAGAGCAAGCTCATCATTCT-3′, inverse :5′-CACCTTCAGCACTCTGCTTGTG-3′. Après réaction, le cycle seuil (Ct) a été analysé par ordinateur. Le rapport relatif de miR-342-5p à U6 a été utilisé comme expression, le rapport relatif de Wnt3a à la -actine a été utilisé comme expression et le rapport relatif a été calculé par 2 ^−ΔΔCt méthode.

Analyse Western Blot

La protéine totale a été extraite des tissus aortiques. La concentration en protéines a été mesurée par la méthode à l'acide bicinchoninique. Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide a été réalisée. Ensuite, la protéine a été transférée sur la membrane en fluorure de polyvinylidène et la bande cible a été obtenue. La membrane a été scellée dans du lait écrémé à 5 % pendant 1 h, additionnée d'anticorps primaires Wnt3a (1 : 500), de -caténine (1 : 1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), CD34 (1 :2500, Abcam, MA, USA) et de la -actine (1 :2000, Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, Chine) à 4 °C pendant la nuit. La membrane a été lavée avec une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween 20 (pH = 7,5, 10 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L NaCl et 0,2% Tween-20) pendant 10 min × 3 fois, puis ajoutée avec un anticorps secondaire (1 :1000, ZSGB-Bio, Pékin, Chine) pendant 2 h. Le logiciel ImageJ a été adopté pour évaluer la valeur grise des bandes et quantifier l'expression des protéines.

Coloration immunohistochimique

Des tranches de 4 à 5 μm ont été placées sur les lames recouvertes de 100 mg/L de polylysine et fixées par de l'acétone. La peroxydase endogène a été bloquée par l'albumine de sérum bovin. Les tissus ont été égouttés avec de l'anticorps MOMA-2 (1 : 200), du -SMA (1 : 200) et du CD34 (1 : 200, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) ainsi qu'une solution de travail d'anticorps secondaire ( 1 :1000). Les tissus ont été développés par la diaminobenzidine, contre-colorés par l'hématoxyline (1 min), déshydratés, nettoyés, scellés et observés au microscope. Trois champs visuels différents ont été sélectionnés pour chaque coupe immunohistochimique. Le logiciel IPP6.0 a été utilisé pour l'analyse quantitative. Une coloration immunohistochimique positive de MOMA-2 et -SMA, respectivement, indique que les macrophages et les cellules musculaires lisses sont principalement situés dans le cytoplasme, qui est jaune à brun. Les pourcentages de macrophages et de cellules musculaires lisses ont été calculés séparément, qui ont été combinés avec le pourcentage de lipides et de collagène dans la plaque pour calculer l'indice de vulnérabilité de la plaque. L'indice de vulnérabilité de la plaque = (pourcentage positif de macrophages + pourcentage positif de lipides)/(pourcentage positif de collagène + pourcentage positif de cellules musculaires lisses) [20]. La densité des microvaisseaux (MVD) a été évaluée par la mesure de l'expression de CD34 et quantifiée en nombre de microvaisseaux/mm ² .

Dosage du gène rapporteur double luciférase

Le gène cible de miR-342-5p a été analysé par le site Web de prédiction biologique (http://www.microRNA.org). Le test du gène rapporteur double luciférase a été utilisé pour vérifier si Wnt3a était le gène cible de miR-342-5p. La séquence de type sauvage ou mutante de la région 3' non traduite de Wnt3a (3'-UTR) a été clonée dans le vecteur GP-miRGLO (GenePharma, Shanghai, Chine). Le rapporteur (0,5 μg) et 1, 10 ou 100 pM d'agomir miR-342-5p ont été transfectés dans des cellules endothéliales aortiques de souris (n° 506, MingzhouBio, Ningbo, Chine) pendant 48 h pour tester l'activité de la luciférase à l'aide d'un système de dosage double de la luciférase. (Promega, WI, États-Unis).

Analyse statistique

Toutes les données ont été interprétées par le logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Les données de mesure ont été indiquées en tant que moyenne ± écart type. Les disparités entre deux groupes ont été formulées par t -test, tandis que ceux parmi plusieurs groupes par analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivi du test de comparaisons multiples de Tukey. La signification statistique a été établie par P valeur < 0,05.

Résultats

miR-342-5p augmente et Wnt3a diminue dans les tissus aortiques d'ApoE ^−/− souris et miR-342-5p ciblent directement Wnt3a

Les gènes cibles des microARN (miARN) sont associés à des fonctions liées à l'athérosclérose. miR-342-5p, Wnt3a et -caténine ont été testés dans les tissus aortiques de souris modèles AS par RT-qPCR et Western blot test. Il a été révélé que par rapport au groupe normal, miR-342-5p était augmenté tandis que Wnt3a et la -caténine étaient diminués dans le groupe AS (les deux P < 0,05). En comparaison avec le groupe NC, miR-342-5p a été amélioré ainsi que Wnt3a et la -caténine ont diminué dans le groupe miR-342-5p agomir (les deux P < 0,05), tandis que miR-342-5p était diminué, Wnt3a et -caténine étaient augmentés dans le groupe miR-342-5p antagomir (tous deux P < 0,05). L'expression de Wnt3a et de -caténine était accrue dans le groupe oe-Wnt3a par rapport au groupe NC (les deux P < 0,05). Par rapport au groupe miR-342-5p agomir, l'expression de Wnt3a et de la -caténine a été augmentée dans le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (P < 0,05) (Fig. 1A–D). De plus, dans l'expérience préliminaire, l'expression de la β-caténine sous le traitement de différentes concentrations de miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir et oe-Wnt3a a été testée et les résultats ont montré (Fichier supplémentaire 1 :Fig. S1 ) plus la concentration d'agomir miR-342-5p est élevée, plus l'expression de la β-caténine est faible ; plus la concentration en antagomir miR-342-5p est élevée, plus l'expression de la β-caténine est élevée; et plus la concentration en oe-Wnt3a est élevée, plus l'expression de la β-caténine est élevée.

miR-342-5p augmente et Wnt3a diminue dans les tissus aortiques d'ApoE ^−/− les souris et miR-342-5p ciblent directement Wnt3a. Un Expression de miR-342-5p dans le tissu aortique de souris détecté par RT-qPCR. B Expression de l'ARNm de Wnt3a dans le tissu aortique de souris détecté par RT-qPCR (n = 12). C , D Expression des protéines Wnt3a et β-caténine dans les tissus aortiques de souris testées par analyse Western blot (n = 12). E Site de liaison de miR-342-5p dans Wnt3a 3'-UTR. F miR-342-5p agomir a diminué de manière dose-dépendante l'activité relative dans les cellules transfectées avec Wnt3a 3′-UTR (N = 3). G Activité relative de la luciférase dans les cellules avec Wnt3a 3′-UTR de type sauvage et mutant après transfection avec miR-342-5p agomir ou scramble (N = 3). *P < 0,05 par rapport au groupe normal, ^# P <0,05 vs le groupe NC. &P <0,05 vs le groupe miR-342-5p agomir. Les données de mesure ont été indiquées en tant que moyenne ± écart type. Les comparaisons entre deux groupes ont été formulées par t -test, tandis que les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. SA, athérosclérose; NC, contrôle négatif

Les miARN pourraient inhiber la traduction de gènes spécifiques en se liant à leur ARN messager 3'UTR. Le site Web de bioinformatique a prédit qu'il existait une relation cible entre miR-342-5p et Wnt3a (Fig. 1E). Le test du gène rapporteur double luciférase a indiqué que dans les cellules endothéliales aortiques de souris transfectées par le vecteur Wnt3a 3′UTR, la valeur renilla/luciole de la luciférase était diminuée de manière dose-dépendante par transfection avec miR-342-5p agomir, avec une diminution significative de 10 à 100 pM miR-342-5p agomir et une diminution de 64 % s'est produite dans le groupe 100 pM miR-342-5p agomir par rapport au groupe NC. Cela indiquait la présence d'un site cible miR-342-5p dans le Wnt3a 3'UTR. Cependant, la valeur renilla/luciole de l'activité de la luciférase n'a pas été affectée dans le groupe de mutation Wnt3a (Fig. 1F, G). Ainsi, il a pu être confirmé que Wnt3a était un gène cible direct de miR-342-5p, et miR-342-5p/Wnt3a pourrait réguler la progression de la SA.

Effets du Wnt3a régulé à la hausse ou du miR-342-5p régulé à la baisse sur les niveaux de lipides dans l'ApoE ^−/− Souris

En outre, pour déterminer si miR-342-5p ciblant et régulant la voie de signalisation Wnt3a affecterait les niveaux de lipides des souris AS, un analyseur biochimique automatique a été utilisé pour observer le changement des niveaux de lipides. Les résultats ont révélé que (Fig. 2A–D) contrairement au groupe normal, les teneurs en TC, TG et LDL-C étaient augmentées et la teneur en HDL-C était diminuée dans le groupe AS (tous les P < 0,05). Par rapport au groupe NC, les teneurs en TC, TG et LDL-C ont été augmentées et la teneur en HDL-C a diminué dans le groupe miR-342-5p agomir (tous les P < 0,05), tandis que les teneurs en TC, TG et LDL-C ont diminué et la teneur en HDL-C a été augmentée dans le groupe miR-342-5p antagomir et le groupe oe-Wnt3a (tous P < 0,05). Par rapport au groupe miR-342-5p agomir, les teneurs en TC, TG et LDL-C ont été réduites et la teneur en HDL-C a été augmentée dans le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (tous les P < 0,05). Ces résultats suggèrent que miR-342-5p et Wnt3a régulent le taux de lipides sanguins des souris AS, et illustrent en outre la relation de régulation ciblée entre miR-342-5p et Wnt3a. La surexpression de Wnt3a inverserait les effets induits par miR-342-5p surexprimés sur les souris AS.

Effets du Wnt3a régulé à la hausse ou du miR-342-5p régulé à la baisse sur les taux de lipides dans l'ApoE ^−/− souris. Un Comparaison des teneurs en HDL-C dans le sérum d'un groupe de souris. B Comparaison des teneurs en LDL-C dans le sérum d'un groupe de souris. C Comparaison des teneurs en TG dans le sérum d'un groupe de souris. D Comparaison des teneurs en TC dans le sérum du groupe de souris. n = 12. *P < 0,05 par rapport au groupe normal, ^# P <0,05 vs le groupe NC. &P <0,05 vs le groupe miR-342-5p agomir. Les données de mesure ont été indiquées en tant que moyenne ± écart type. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. SA, athérosclérose; NC, contrôle négatif

Effets de la surexpression de Wnt3a ou de la faible expression de miR-342-5p sur les cytokines liées au stress inflammatoire et oxydatif dans le sérum d'ApoE ^−/− Souris

Ensuite, le contenu des cytokines dans le sérum de souris AS a été testé par ELISA, et les résultats ont indiqué que (Fig. 3A–D) par rapport au groupe normal, l'IL-5, l'IL-12p70, l'IFN-γ et le TNF-α étaient améliorés dans le groupe AS (tous les P < 0,05). Par rapport au groupe NC, les teneurs en IL-5, IL-12p70, IFN-γ et TNF-α ont été augmentées dans le groupe miR-342-5p agomir (tous les P < 0,05), tandis que les teneurs en IL-5, IL-12p70, IFN-γ et TNF-α étaient dégradées dans le groupe miR-342-5p antagomir et le groupe oe-Wnt3a (tous P < 0,05). Contrairement au groupe miR-342-5p agomir, les teneurs en IL-5, IL-12p70, IFN-γ et TNF-α ont diminué dans le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (tous P < 0,05). Il a été laissé entendre que la régulation ciblée par miR-342-5p de la voie de signalisation Wnt3a régulait davantage le niveau de cytokines apparentées dans le sérum des souris AS.

Effets de la surexpression de Wnt3a ou de la faible expression de miR-342-5p sur les cytokines liées au stress inflammatoire et oxydatif dans le sérum d'ApoE ^−/− souris. Un Comparaison des teneurs en IL-5 dans le sérum d'un groupe de souris. B Comparaison des teneurs en IL-12p70 dans le sérum du groupe de souris. C Comparaison des teneurs en IFN-γ dans le sérum d'un groupe de souris. D Comparaison des teneurs en TNF-α dans le sérum d'un groupe de souris. E, Comparaison de la teneur en MDA dans le sérum du groupe de souris. F Comparaison de l'activité SOD dans le sérum du groupe de souris. n = 12. *P < 0,05 par rapport au groupe normal, ^# P <0,05 vs le groupe NC. &P <0,05 vs le groupe miR-342-5p agomir. Les données de mesure ont été indiquées en tant que moyenne ± écart type. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. SA, athérosclérose; NC, contrôle négatif

De plus, la teneur en MDA et l'activité SOD dans le sérum de souris ont été testées et il a été révélé que (Fig. 3E, F) par rapport au groupe normal, la teneur en MDA était augmentée et l'activité SOD était diminuée dans le groupe AS (les deux P < 0,05). Par rapport au groupe NC, le contenu en MDA a été amélioré et l'activité SOD a diminué dans le groupe miR-342-5p agomir (à la fois P < 0,05), tandis que la teneur en MDA a diminué et l'activité SOD a été augmentée dans le groupe antagomir miR-342-5p et le groupe oe-Wnt3a (tous P < 0,05). Par rapport au groupe miR-342-5p agomir, le contenu en MDA était diminué et l'activité SOD était améliorée dans le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (tous deux P < 0,05). Par conséquent, un résumé a été obtenu selon lequel l'épuisement de miR-342-5p et la restauration de Wnt3a ont inhibé le stress oxydatif chez les souris AS.

Effets de l'épuisement de miR-342-5p ou restauration de Wnt3a sur le contenu lipidique et collagène dans la plaque aortique d'ApoE ^−/− Souris

Afin d'explorer l'effet de miR-342-5p ciblé Wnt3a sur la zone de plaque dans le tissu aortique de souris, une coloration HE a été réalisée et les résultats ont révélé que (Fig. 4A, B), à l'exception du groupe normal, des plaques AS se sont formées dans tous sections des autres groupes. Dans le groupe AS, la zone de plaque était large, la coiffe fibreuse était plus mince, le noyau lipidique était agrandi, davantage de cellules spumeuses et de précipitations de cristaux de cholestérol apparaissaient dans la plaque, la paroi interne de l'artère et la couche musculaire étaient épaissies et la plaque était instable. La situation dans le groupe NC était similaire à celle du groupe AS. Dans l'antagomir miR-342-5p et le groupe oe-Wnt3a, la zone de plaque était petite, l'intima de l'artère était lisse et les coiffes fibreuses étaient en petit nombre et sont devenues plus minces. Il n'y avait pas de rupture mais des cellules spumeuses de différentes tailles dans la plaque. Le cristal de cholestérol était distribué de manière asymétrique et partiellement calcifié, le nombre de cellules musculaires lisses et de fibres de collagène était augmenté et la plaque avait tendance à être stable. Par rapport au groupe NC, la zone de plaque était augmentée et les lésions AS étaient aggravées dans le groupe miR-342-5p agomir (P < 0,05) tandis que la zone de plaque était diminuée dans le groupe miR-342-5p antagomir et le groupe oe-Wnt3a avec des lésions AS réduites (tous deux P < 0,05). Par rapport au groupe miR-342-5p agomir, la zone de plaque a diminué dans le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (P < 0,05).

Effets de la déplétion de miR-342-5p ou de la restauration de Wnt3a sur la teneur en lipides et en collagène dans la plaque aortique d'ApoE ^−/− souris. Un Résultats de la coloration HE aortique chez la souris (barre d'échelle :50 μm). B Comparaison de la surface de la plaque aortique dans chaque groupe de souris. C Résultats de la coloration aortique Oil Red O dans tous les groupes de souris (barre d'échelle :100 μm). D Comparaison de la teneur en lipides dans le tissu aortique de souris. E Résultats de la coloration aortique au rouge Sirius dans chaque groupe de souris (barre d'échelle :50 μm). F Comparaison des teneurs en collagène dans les tissus aortiques de souris. n = 12. ^# P <0,05 vs le groupe NC. &P <0,05 vs le groupe miR-342-5p agomir. Les données de mesure ont été indiquées en tant que moyenne ± écart type. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. SA, athérosclérose; NC, contrôle négatif

La coloration Oil red O et la coloration au rouge Sirius ont été adoptées pour détecter l'effet du miR-342-5p ciblé Wnt3a sur la teneur en lipides et la teneur en collagène dans la plaque du tissu aortique de souris, et les résultats ont démontré que (Fig. 4C-F) Oil red La coloration O montrait de la graisse rouge et un noyau bleu tandis que la coloration rouge Sirius montrait des fibres de collagène rouges et un noyau bleu. Par rapport au groupe NC, la teneur en lipides a été augmentée et la teneur en collagène a été réduite dans le groupe miR-342-5p agomir ainsi que la teneur en lipides a été réduite et la teneur en collagène a été accumulée dans le groupe miR-342-5p antagomir et l'oe-Wnt3a groupe (tous les P < 0,05). En ce qui concerne le groupe miR-342-5p agomir, la teneur en lipides était diminuée et la teneur en collagène était élevée dans le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (tous deux P < 0,05). Les résultats expérimentaux ont pleinement illustré que la régulation ciblée par miR-342-5p de la voie de signalisation Wnt3a avait un effet régulateur sur la teneur en lipides et en collagène dans la plaque aortique des souris AS.

Effets du miR-342-5p régulé à la baisse ou du Wnt3a régulé à la hausse sur les macrophages et les cellules musculaires lisses dans la plaque aortique d'ApoE ^−/− Souris

Le degré de SA est directement proportionnel au contenu des macrophages mononucléés [21]. Les CMLV sont les principales cellules de la couche intermédiaire des artères et sont essentielles au maintien de l'intégrité de la paroi artérielle. Les CMLV sont impliquées dans la reconstruction de la paroi artérielle et jouent un rôle important dans la SA à différents stades [22]. L'α-SMA est un marqueur spécifique des cellules musculaires lisses [23]. Dans cette étude, un anticorps marqueur des macrophages (MOMA-2) a été utilisé pour marquer les macrophages, et l'immunohistochimie a été appliquée pour détecter l'expression de MOMA-2 et α-SMA, respectivement.

Au microscope, une coloration immunohistochimique positive de MOMA-2 et de α-SMA, respectivement, indique que les macrophages et les cellules musculaires lisses sont principalement situés dans le cytoplasme, qui est jaune à brun. MOMA-2 immunopositive a indiqué que les macrophages étaient principalement localisés dans le cytoplasme avec du jaune au brun. Déterminé par immunohistochimie, il s'est manifesté que par rapport au groupe NC, le pourcentage de coloration positive des macrophages de la plaque (MAMO-2) était augmenté et le pourcentage de cellules musculaires lisses positives était diminué dans l'agomir miR-342-5p (les deux P < 0,05). Le pourcentage de coloration positive des macrophages de la plaque (MAMO-2) a été réduit et le pourcentage de cellules musculaires lisses positives a été augmenté dans le groupe antagomir miR-342-5p et le groupe oe-Wnt3a (tous P < 0,05). En comparaison avec le groupe miR-342-5p agomir, le pourcentage de coloration positive des macrophages de la plaque (MAMO-2) était diminué et le pourcentage de cellules musculaires lisses positives était augmenté dans le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (tous deux P < 0,05) (Fig. 5A–D). Il était sous-entendu que la régulation ciblée par miR-342-5p de la voie de signalisation Wnt3a pourrait réguler l'agrégation des macrophages et des cellules musculaires lisses dans les plaques du tissu artériel des souris AS.

Effets d'une expression élevée de Wnt3a ou d'une expression médiocre de miR-342-5p sur la vulnérabilité de la plaque aortique d'ApoE ^−/− souris. Un Coloration immunohistochimique de MOMA-2 dans chaque groupe de souris (barre d'échelle :50 μm). B Analyse quantitative de la figure A. C Coloration immunohistochimique de l'-SMA dans chaque groupe de souris (barre d'échelle :50 μm). D Analyse quantitative de la figure C . E Comparaison de l'indice de vulnérabilité de la plaque dans les tissus aortiques de souris AS. n = 12. ^# P <0,05 vs le groupe NC. &P <0,05 vs le groupe miR-342-5p agomir. Les données de mesure ont été indiquées en tant que moyenne ± écart type. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. SA, athérosclérose; NC, contrôle négatif

Effets d'une expression élevée de Wnt3a ou d'une faible expression de miR-342-5p sur la vulnérabilité de la plaque aortique à l'ApoE ^−/− Souris

L'indice de vulnérabilité de la plaque a été calculé :(pourcentage positif de macrophages + pourcentage positif de lipides)/(pourcentage positif de cellules musculaires lisses + pourcentage positif de collagène). Par rapport au groupe NC, l'indice de vulnérabilité de la plaque a été augmenté dans le groupe miR-342-5p agomir (P < 0,05) et a diminué dans le groupe miR-342-5p antagomir et le groupe oe-Wnt3a (tous deux P < 0,05). Par rapport au groupe miR-342-5p agomir, l'indice de vulnérabilité de la plaque a diminué dans le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (P < 0,05) (Fig. 5E). En bref, miR-342-5p a ciblé la régulation de la vulnérabilité des plaques médiée par la voie de signalisation Wnt3a dans les tissus artériels des souris AS.

Effets de la faible expression de miR-342-5p ou de la surexpression de Wnt3a sur l'angiogenèse dans la plaque aortique d'ApoE ^−/− Souris

Les anticorps contre le marqueur des cellules endothéliales CD34 peuvent détecter la densité des vaisseaux sanguins [24]. Par immunohistochimie et Western blot. Par rapport au groupe NC, la MVD a été augmentée dans le groupe miR-342-5p agomir et atténuée dans le groupe miR-342-5p antagomir et le groupe oe-Wnt3a (tous P < 0,05). En comparaison avec le groupe miR-342-5p agomir, la MVD a diminué dans le groupe miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (P < 0,05) (Fig. 6A–C). Collectivement, miR-342-5p ciblant et régulant la voie de signalisation Wnt3a a directement participé à la régulation de la densité de néovascularisation dans les plaques des souris AS.

Effets de la faible expression de miR-342-5p ou de la surexpression de Wnt3a sur la MVD dans la plaque aortique d'ApoE ^−/− souris. Un Coloration immunohistochimique de CD34 dans chaque groupe d'ApoE ^−/− souris (barre d'échelle :50 μm). B Comparaison de la MVD dans la plaque aortique en ApoE ^−/− souris. C Comparaison de l'expression de la protéine CD34 dans ApoE ^−/− souris. n = 12. ^# P <0,05 vs le groupe NC. &P <0,05 vs le groupe miR-342-5p agomir. Les données de mesure ont été indiquées en tant que moyenne ± écart type. Les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. SA, athérosclérose; NC, contrôle négatif