Cibler l'axe miR-342-5p/Wnt3a stabilise les plaques d'athérosclérose et supprime l'angiogenèse chez les souris ApoE−/−

Résumé

Le microARN-342-5p (miR-342-5p) a été impliqué dans l'athérosclérose (AS), pourtant son rôle mécanistique reste flou. Dans cette étude, nous avons investigué comment le miR-342-5p régule la voie de signalisation Wnt3a et influence la vulnérabilité de la plaque et la néovascularisation dans un modèle murin ApoE−/− d'AS. Des souris mâles ApoE−/− de 24 semaines étaient nourries avec un régime riche en graisses pendant 16 semaines pour induire des plaques vulnérables. L'expression du miR-342-5p et de Wnt3a était quantifiée par RT-qPCR et Western blot. Les effets fonctionnels de l'inhibition du miR-342-5p (antagomir) et de la surexpression de Wnt3a (vecteur oe-Wnt3a) étaient évalués sur les lipides sériques, cytokines inflammatoires et de stress oxydatif, morphologie de la plaque et densité microvasculaire (DMV). Les résultats révélaient que le miR-342-5p était surexprimé tandis que Wnt3a et β-caténine étaient sous-exprimés dans les aortes AS, et que le miR-342-5p ciblait directement le 3'-UTR de Wnt3a. L'antagonisme du miR-342-5p ou la surexpression de Wnt3a abaissaient le cholestérol total, triglycérides, LDL-c et cytokines pro-inflammatoires (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α), augmentaient le HDL-c et l'activité SOD, réduisaient la zone de cœur lipidique, augmentaient le contenu en collagène, diminuaient l'infiltration macrophagique et abaissaient la DMV. En contraste, la surexpression du miR-342-5p exacerbait tous ces paramètres. Ainsi, le miR-342-5p promeut l'instabilité de la plaque et l'angiogenèse en réprimant Wnt3a ; restaurer Wnt3a atténue ces effets, suggérant une cible thérapeutique pour l'AS.

Introduction

L'athérosclérose (AS) reste la cause majeure de morbidité et mortalité cardiovasculaire mondiale. La déstabilisation de la plaque – caractérisée par des cœurs nécrotiques riches en lipides, des chapeaux fibreux minces, l'infiltration macrophagique et le collagène réduit – mène à la rupture et aux événements aigus. Bien que les thérapies hypolipidémiantes aient amélioré les résultats, de nombreux patients continuent de subir des événements cardiovasculaires, soulignant le besoin d'interventions moléculaires novatrices.

Les microARN (miARN) sont de courts ARN non-codants qui régulent post-transcriptionnellement de multiples gènes cibles. Le miR-342-5p, situé dans le cluster miARN 14q32, a été rapporté pour influencer l'angiogenèse via les voies TGF-β et VEGF et moduler les réponses inflammatoires dans la maladie vasculaire. Cependant, son rôle spécifique dans l'AS et son interaction avec les cascades de signalisation clés restent incomplètement définis.

La voie Wnt/β-caténine est critique pour l'homéostasie des cellules vasculaires, influençant la prolifération des cellules musculaires lisses, l'intégrité endothéliale et la composition de la plaque. Des travaux antérieurs indiquent que le miR-342-5p régule négativement Wnt3a dans d'autres contextes pathologiques, suggérant un axe régulateur potentiel dans l'AS.

Ici, nous élucidons l'interaction miR-342-5p/Wnt3a dans l'AS et évaluons son impact sur la stabilité de la plaque et l'angiogenèse chez les souris ApoE−/−.

Matériaux et Méthodes

Animaux et Éthique

Des souris mâles ApoE−/− et C57BL/6J (8 semaines) étaient logées sous cycle 12 h lumière/12 h obscurité et nourries avec chow standard ou régime riche en graisses (20% graisse, 0,25% cholestérol) pendant 16 semaines. Toutes les procédures adhéraient aux directives NIH et étaient approuvées par le Comité Institutionnel de Soins et d'Utilisation des Animaux de l'Hôpital Provincial du Peuple du Qinghai (numéro éthique 201870726).

Design Expérimental

Les souris ApoE−/− étaient aléatoirement allouées à six groupes (n = 12 chacun) : AS, NC (saline), miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir, oe-Wnt3a, et miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a. Les traitements (40 mg/kg, veine caudale) étaient administrés bihebdomadairement pendant 8 semaines. Les souris C57BL/6J servaient de contrôles normaux.

Analyses Biochimiques

Le cholestérol total (CT), triglycérides (TG), LDL-c, HDL-c, malondialdéhyde (MDA) et superoxyde dismutase (SOD) étaient mesurés usando kits commerciaux (Institut de Bioingénierie NanJing JianCheng). Les cytokines (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α) étaient quantifiées par ELISA (MultiSciences).

Traitement des Tissus

Après jeûne de 12 h, les souris étaient euthanasiées ; les aortes étaient récoltées, lavées en PBS sans ARN, et divisées pour histologie (HE, Rouge à l'huile, Rouge Sirius) ou essais moléculaires (RT-qPCR, Western blot). Les échantillons pour histologie étaient inclus en paraffine, sectionnés (4 µm), et colorés selon protocoles standards.

Analyse d'Expression Génique et Protéique

Le RT-qPCR quantifiait miR-342-5p, Wnt3a, β-caténine et gènes de référence (U6, β-actine) utilisant la méthode 2^−ΔΔCt. Le Western blot évaluait Wnt3a, β-caténine, CD34, α-SMA et β-actine, avec densitométrie ImageJ.

Immunohistochimie

Les sections étaient immunostainées pour MOMA-2 (macrophages), α-SMA (cellules musculaires lisses) et CD34 (cellules endothéliales). L'intensité de coloration était quantifiée via Image Pro Plus 6.0, et l'indice de vulnérabilité de la plaque calculé comme (macrophages + % lipides) / (cellules musculaires lisses + % collagène). La DMV était déterminée en comptant les micro-vaisseaux CD34⁺/mm².

Essai de Luciférase Rapport

Le 3'-UTR de Wnt3a (type sauvage et mutant) était cloné dans GP-miRGLO. Les cellules endothéliales aortiques de souris étaient co-transfectées avec le rapporteur et concentrations variables de miR-342-5p agomir ; l'activité luciférase était mesurée après 48 h.

Analyse Statistique

Les données étaient présentées en moyenne ± ET. Les comparaisons à deux groupes utilisaient tests t non-appariés ; groupes multiples utilisaient ANOVA à un facteur avec tests post-hoc Tukey. La significativité était fixée à *p* < 0,05.

Résultats

Le miR-342-5p est surexprimé et Wnt3a sous-exprimé dans les aortes AS

Le RT-qPCR montrait une augmentation significative du miR-342-5p (≈3,5 fois, *p* < 0,01) et une diminution concomitante de Wnt3a (≈0,4 fois, *p* < 0,01) chez les souris AS versus normales. Le Western blot confirmait des niveaux protéiques réduits de Wnt3a et β-caténine. Les essais de luciférase démontraient que le miR-342-5p lie directement le 3'-UTR de Wnt3a, réduisant l'activité du rapporteur jusqu'à 64% à 100 pM, un effet abrogé par mutation du site de liaison.

L'antagomir miR-342-5p ou la surexpression de Wnt3a améliorent les profils lipidiques

L'antagomir miR-342-5p et oe-Wnt3a abaissaient markedly CT, TG et LDL-c (≈30–40% réduction, *p* < 0,01) et augmentaient HDL-c (≈20% augmentation, *p* < 0,05) relatif aux groupes AS et NC. L'agomir miR-342-5p exacerbait la dyslipidémie. La surexpression de Wnt3a sauvait les effets adverses de la surexpression du miR-342-5p.

Marqueurs inflammatoires et de stress oxydatif sont supprimés par l'inhibition du miR-342-5p

L'IL-5 sérique, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α et MDA étaient élevés chez les souris AS (*p* < 0,01). L'antagomir miR-342-5p ou oe-Wnt3a réduisaient ces cytokines et MDA de ~40% et augmentaient l'activité SOD de ~35% (*p* < 0,01). L'agomir miR-342-5p intensifiait davantage les marqueurs inflammatoires et oxydatifs.

La morphologie de la plaque s'améliore avec l'inhibition du miR-342-5p ou la surexpression de Wnt3a

La coloration HE révélait que les groupes antagomir miR-342-5p et oe-Wnt3a exhibaient des zones de plaque plus petites, chapeaux fibreux plus épais, cœurs lipidiques réduits et contenu en collagène augmenté (Rouge Sirius) comparé aux groupes AS et NC (*p* < 0,01). La quantification Rouge à l'huile confirmait une diminution ~30% du contenu lipidique dans les groupes traités. L'indice de vulnérabilité de la plaque diminuait de 45% dans les groupes antagomir et oe-Wnt3a, tandis que l'agomir miR-342-5p l'augmentait de 60% (*p* < 0,01).

L'accumulation macrophagique et la présence de cellules musculaires lisses sont modulées

L'immunohistochimie montrait que l'antagomir miR-342-5p et oe-Wnt3a réduisaient les pourcentages de macrophages MOMA-2⁺ de ~50% et augmentaient les cellules musculaires lisses α-SMA⁺ de ~30% relatif aux groupes AS et NC (*p* < 0,01). Le traitement combiné miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a restaurait les niveaux de macrophages et cellules musculaires lisses vers la ligne de base.

L'angiogenèse est atténuée en ciblant l'axe miR-342-5p/Wnt3a

L'immunostaining CD34 et Western blot démontraient que l'antagomir miR-342-5p et oe-Wnt3a réduisaient la DMV de ~55% comparé aux souris AS (*p* < 0,01). L'agomir miR-342-5p augmentait la DMV de ~70% (*p* < 0,01). Le traitement combiné modérait les réponses angiogéniques.

Discussion

Nos découvertes révèlent un axe miR-342-5p/Wnt3a non caractérisé auparavant qui gouverne le métabolisme lipidique, l'inflammation, le stress oxydatif, la composition de la plaque et la néovascularisation dans l'athérosclérose. La surexpression du miR-342-5p dans les aortes AS supprime directement Wnt3a, amortissant ainsi la signalisation β-caténine et promouvant un phénotype de plaque vulnérable. Inversement, inhiber le miR-342-5p ou restaurer Wnt3a rétablit des profils lipidiques protecteurs, réduit les cytokines pro-inflammatoires, renforce les défenses antioxydantes, stabilise l'architecture de la plaque et freine l'angiogenèse pathologique.

Ces résultats s'alignent avec les rapports d'implication du miR-342-5p dans l'activation macrophagique et l'inflammation, et avec le rôle établi de la signalisation Wnt dans la biologie vasculaire. Le potentiel thérapeutique de moduler cet axe est souligné par l'inversion robuste des marqueurs d'AS observés in vivo.

Conclusion

Cette étude est la première à démontrer que le miR-342-5p promeut la vulnérabilité de la plaque et l'angiogenèse en ciblant Wnt3a chez les souris ApoE−/−. L'inhibition pharmacologique du miR-342-5p ou la surexpression de Wnt3a stabilise les plaques d'athérosclérose et peut représenter une stratégie prometteuse pour le traitement de l'AS.

Disponibilité des Données et Matériaux

Toutes les données générées pendant cette étude sont incluses dans l'article et ses matériaux supplémentaires. Des demandes supplémentaires peuvent être adressées à l'auteur correspondant.

Abréviations

miR-342-5p

MicroARN-342-5p

AS

Athérosclérose

α-SMA

α-Actine musculaire lisse

DMV

Densité micro-vasculaire

miARN

MicroARN

oe

Surexpression

NC

Contrôle négatif

PBS

Tampon phosphate salin

CT

Cholestérol total

TG

Triglycéride

LDL-c

Cholestérol lipoprotéine basse densité

HDL-c

Cholestérol lipoprotéine haute densité

ELISA

Dosage immunoenzymatique

IL

Interleukine

TNF-α

Facteur de nécrose tumorale alpha

IFN

Interféron

MDA

Malondialdéhyde

SOD

Superoxyde dismutase

RT-qPCR

Réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse