Cibler miR‑301 supprime l'angiogenèse et la croissance tumorale dans le carcinome épidermoïde de l'œsophage via l'activation de PTEN

Résumé

Objectif

Le carcinome épidermoïde de l'œsophage (CEC) se caractérise par des métastases précoces et un diagnostic tardif. Le microARN-301 (miR-301) est connu pour participer à divers cancers. Néanmoins, les effets de miR-301 sur le CEC restent inexplorés. Ainsi, nous visons à explorer le rôle de miR-301 dans la progression du CEC.

Méthodes

L'expression de miR-301 et de la phosphatase et tensine homologue (PTEN) dans les tissus et lignées cellulaires de CEC a été évaluée. Ensuite, les cellules criblées ont été traitées avec des oligonucléotides et plasmides miR-301 ou PTEN modifiés, puis la capacité de formation de colonies, la viabilité cellulaire, la migration, l'invasion, la distribution du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules CEC ont été évaluées. De plus, la croissance tumorale et la densité de microvaisseaux (DMV) ont également été évaluées, et la relation de ciblage entre miR-301 et PTEN a été confirmée.

Résultats

MiR-301 était surexprimé, et PTEN était sous-exprimé dans les tissus et cellules de CEC. Les cellules KYSE30 et Eca109 ont été sélectionnées pour les essais fonctionnels. Dans les cellules KYSE30, l'inhibition de miR-301 ou la surexpression de PTEN a supprimé les comportements malignes des cellules, et le silence de PTEN a éliminé l'impact de l'inhibition de miR-301 sur la progression du CEC. Dans les cellules Eca109, la surexpression de miR-301 ou l'inhibition de PTEN a favorisé les comportements malignes des cellules, et la surexpression de PTEN a inversé les effets de l'élévation de miR-301 sur la progression du CEC. L'essai in vivo a révélé que l'inhibition de miR-301 ou la surexpression de PTEN réprimait la croissance tumorale du CEC et la DMV, et l'élévation de miR-301 ou la réduction de PTEN avaient des effets contraires. De plus, PTEN était ciblé par miR-301.

Conclusion

Dans l'ensemble, les résultats de notre étude ont révélé que miR-301 affectait la croissance cellulaire, la métastase et l'angiogenèse via la régulation de l'expression de PTEN dans le CEC.

Introduction

Le cancer de l'œsophage (CO), le 8e cancer le plus courant dans le monde, est une malignité critique avec une mortalité élevée et un pronostic pauvre [1]. Représentant environ 90 % du total des cas de CO, le carcinome épidermoïde de l'œsophage (CEC) est la forme principale de CO en Chine [2]. De multiples causes incluant un faible statut socioéconomique, le tabagisme, la consommation d'alcool, une mauvaise nutrition, des aliments riches en nitrosamines ou contaminés par des mycotoxines conduisent à l'occurrence du CEC [3]. Malgré les résultats cliniques promus ainsi que l'administration, il y a encore un pronostic pauvre parmi les patients CEC, accompagnant un taux de survie à 5 ans de 15-25 % [4]. Donc, il est crucial de confirmer les oncogènes ou gènes suppresseurs de tumeurs qui pourraient fonctionner comme biomarqueurs dans le développement du CEC pour fournir des méthodes thérapeutiques plus efficaces pour les patients CEC.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants jouant un rôle essentiel dans la modulation de l'expression génique [5] et sont clarifiés pour avoir la capacité d'influencer la progression tumorale en régulant la stabilité de l'ARNm et la capacité des ARNm [6]. Une quantité de miARN tels que miR-4324 [7], miR-889-3p [8] et miR-9 [9] ont été trouvés associés au processus de CEC. MiR-301 est un membre des miARN qui est formé par l'unité de transcription fam33a située au 17q22-23 dans le génome humain. La surexpression de miR-301 a été précédemment identifiée, ce qui reflétait qu'elle est impliquée dans les maladies humaines [6, 10]. Cependant, les mécanismes de fonction de miR-301 n'ont pas été découverts dans le CEC. De plus, la phosphatase et tensine homologue (PTEN) a été affirmée comme étant fréquemment perturbée dans les tumeurs et ciblée par des mutations de lignée germinale chez les patients cancéreux, jouant un rôle inhibiteur des tumeurs [11]. Il a été validé que la dysregulation de PTEN est corrélée avec le développement du CEC [12]. Intéressant, une recherche récente a révélé que miR-301 cible PTEN dans le cancer du poumon non à petites cellules [13]. Cependant, cette relation de ciblage entre miR-301 et PTEN dans le développement du CEC reste à être dévoilée. Notre recherche s'est concentrée sur les effets de miR-301 et PTEN sur la progression du CEC, qui restent largement inconnus et sont de nouveauté. Nous avons inféré que miR-301 pourrait influencer l'angiogenèse et la croissance cellulaire dans le CEC en modulant l'expression de PTEN.

Matériaux et Méthodes

Déclaration d'éthique

Des consentements éclairés écrits ont été obtenus de tous les patients avant l'étude. Les protocoles de cette étude ont été approuvés par le Comité d'éthique du Deuxième Hôpital de l'Université de Jilin et basés sur les principes éthiques pour la recherche médicale impliquant des sujets humains de la Déclaration d'Helsinki. Les expériences animales étaient strictement conformes au Guide pour la gestion et l'utilisation des animaux de laboratoire émis par les Instituts nationaux de la santé. Le protocole des expériences animales a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Deuxième Hôpital de l'Université de Jilin.

Sujets d'étude

Cent dix échantillons de tissus CEC et tissus normaux adjacents (> 5 cm de la tumeur) ont été collectés auprès de patients CEC (78 hommes et 32 femmes) qui avaient subi une œsophagectomie au département de chirurgie thoracique du Deuxième Hôpital de l'Université de Jilin de janvier 2015 à décembre 2017. Parmi les 110 patients, il y avait 84 cas > 60 ans, et 26 cas ≤ 60 ans ; taille de la tumeur : 65 cas ≥ 5 cm et 45 cas < 5 cm ; 71 cas sans métastase ganglionnaire (MG) et 39 cas avec MG ; le stade tumeur, nœud et métastase (TNM) : 60 cas étaient au stade I + II, et 50 cas au stade III ; localisation de la tumeur : 13 cas étaient CEC supérieur, et 97 cas étaient CEC moyen-inférieur. Les patients étaient tous diagnostiqués avec CEC et n'avaient pas accepté de radiothérapie ou chimiothérapie avant. Les tumeurs étaient complètement excisées, et la marge chirurgicale négative a été affirmée par pathologie. Selon les critères de stadification du CEC proposés par l'Union pour le contrôle international du cancer (UICC) en 2009 [14], la stadification pathologique postopératoire des patients a été identifiée comme le stade pT1-4N1-2(I-IIIb). Il n'y avait pas de complication significative chez les patients après la chirurgie, et les décès périopératoires étaient exclus.

Réaction de polymérase en chaîne par transcription inverse quantitative (RT-qPCR)

Les ARN totaux dans les tissus et cellules ont été extraits en utilisant des kits Trizol (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA). La concentration et la qualité de l'ARN ont été mesurées. Les amorces ARN (Tableau 1) ont été conçues et synthétisées par TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning Chine). L'ARN a été transcrit inversement en ADNc basé sur les instructions du kit Takara PrimeScript™ RT reagent Kit with g DNA Eraser (Takara). Nous avons effectué le qPCR sur le Light Cycler 480II (Roche) avec le Power PCR SYBR green PCR master mix (Takara). U6 a été utilisé comme contrôle de charge de miR-301, et β-actine a été utilisée comme référence interne de PTEN. Les données ont été analysées en utilisant la méthode 2^−△△Ct [15].

Analyse par Western Blot

Le tampon de lyse RIPA (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Chine) a été utilisé pour extraire la protéine totale dans les cellules et tissus, et la protéine a été quantifiée par un kit de dosage protéique BCA (Beyotime). La concentration de protéine de chaque échantillon a été mesurée, et une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium à 10 % a été réalisée. Les échantillons ont été transférés sur des membranes de nitrocellulose, qui ont ensuite été bloquées avec 5 % de lait écrémé en poudre à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, les membranes ont été supplémentées avec des anticorps primaires PTEN et β-actine (tous deux 1:500 et de Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA) pour incubation pendant la nuit, puis ajoutées avec les anticorps secondaires respectifs et incubées pendant 1 h. Après immersion dans le réactif chimiluminescent amélioré (Pierce Chemical Inc., Dallas, TX, USA) pendant 1 min, les membranes ont été exposées dans un environnement sombre et développées en utilisant l'imageur chimiluminescent mini LAS4000. Les valeurs de gris ont été évaluées par un logiciel de système d'imagerie avec β-actine comme contrôle ; par conséquent, l'expression protéique relative finale a été obtenue. Les bandes de protéines ont été analysées par le logiciel ImageJ2x.

Essai de gène rapporteur luciférase double

La séquence de la région 3'-non traduite (3'UTR) de PTEN a été prédite pour interagir avec miR-301, ou une séquence mutée dans les sites cibles prédits a été synthétisée et insérée dans les sites XbaI et FseI du vecteur rapporteur luciférase pGL3 contrôle (Promega, WI, USA). Ensuite, les vecteurs pGL3-PTEN-wt et pGL3-PTEN-mut ont été produits. Les plasmides rapporteurs luciférase wt et mut correctement identifiés avec miR-301 mimic et mimic NC ont été co-transfectés dans les cellules KYSE30 et Eca109 pendant 48 h. Ensuite, les cellules ont été lysées, et les activités luciférase ont été, respectivement, déterminées par des kits de détection luciférase (Promega).

Culture cellulaire, groupement et transfection

Les lignées cellulaires CEC (KYSE-150, KYSE-30, Eca109 et KYSE-70) ont été obtenues de l'Institut de biochimie et biologie cellulaire de Shanghai, Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine), et les cellules épithéliales œsophagiennes humaines (HEEC) ont été acquises de Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, Chine). Les cellules ont été cultivées dans le milieu RPMI 1640 (Invitrogen) supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS, Life Technologies, USA), 100 unités/ml pénicilline G sodium (Sigma) et 100 μg/ml sulfate de streptomycine (Sigma). L'expression de miR-301 et l'expression d'ARNm de PTEN dans chaque lignée cellulaire ont été mesurées par RT-qPCR, et la lignée cellulaire avec l'expression relative la plus élevée et la plus basse a été choisie pour les expériences cellulaires subséquentes.

Les cellules KYSE-30 ont été séparées en 7 groupes et, respectivement, traitées avec inhibiteur miR-301, contrôle négatif (NC) inhibiteur, pcDNA-PTEN (nommé surexprimé (oe)-PTEN), pcDNA-NC (nommé oe-NC), inhibiteur miR-301 + petit ARN interférant (si)-PTEN ou inhibiteur miR-301 + si-NC. Les cellules Eca109 ont été séparées en 7 groupes également et sévèrement traitées avec mimic miR-301, mimic NC, si-PTEN, si-NC, mimic miR-301 + oe-PTEN, mimic miR-301 + oe-NC. inhibiteur NC, inhibiteur miR-301, mimic miR-301, mimic NC, si-NC et si-PTEN ont été achetés de GenePharma Ltd., Company (Shanghai, Chine) ; pcDNA-PTEN NC et pcDNA-PTEN ont été obtenus de (Shanghai Sangon Bio-technology Corporation (Shanghai, Chine)). Les cellules ont été transitoirement transféctées dans les cellules CEC par lipofectamine 2000 (Invitrogen) lorsque la confluence cellulaire atteignait 60 %.

Essai Cell Counting Kit (CCK-8)

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits (1 × 10³ cellules/puits) et incubées pendant différentes périodes. Après incubation pendant 24 h, 48 h, 72 h et 96 h, chaque puits a été supplémenté avec 10 μL de solution CCK-8 (5 mg/mL), et ensuite, les cellules de chaque groupe ont été incubées à 37 °C sans exposition à la lumière pendant 2 h. Les valeurs de densité optique (DO) à 450 nm ont été analysées par un lecteur de microplaques (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Essai de formation de colonies

Les cellules ont été ensemencées à 500 cellules/puits dans des plaques à 6 puits après transfection et cultivées pendant 14 j. Les colonies ont été fixées avec du méthanol, colorées en utilisant 0,5 % de violet de cristal et comptées sous le microscope inversé.

Essai Transwell

Les cellules (5 × 10³) incubées dans le milieu RPMI 1640 ont été ensemencées dans les chambres apicales des dispositifs Transwell avec membrane non enduite ou enduite de matrigel (Corning, NY, USA). Après 24 h, les cellules sur les chambres apicales ont été retirées, tandis que les cellules restantes sur la face inférieure ont été fixées et ensuite colorées en utilisant 0,1 % de violet de cristal. Un microscope (Olympus Corporation, Tokyo, Japon) a été utilisé pour compter sur 3 champs aléatoires pour calculer le nombre de cellules.

Cytométrie de flux

Le cycle cellulaire et l'apoptose ont été évalués par cytométrie de flux. L'annexine V-fluorescéine isothiocyanate (10 µL) et l'iodure de propidium (PI ; 5 µL, Sigma) ont été incubés avec les cellules (5 × 10⁵ cellules/puits) dans l'obscurité à 4 °C pendant 30 min. Le pourcentage de cellules apoptotiques a été calculé en utilisant un cytomètre de flux (BD Biosciences, CA, USA) avec le logiciel FlowJo version 10 (FlowJo LLC, OR, USA).

Pour évaluer le cycle cellulaire, les cellules (5 × 10⁵ cellules/puits) ont été fixées avec 75 % d'éthanol pendant la nuit à 4 °C et colorées avec 5 µl PI/ribonucléase A (Sigma) à 4 °C pendant 30 min dans l'obscurité. Les données ont été analysées avec un cytomètre de flux (BD Biosciences). Les signaux de fluorescence (14 000) de chaque échantillon ont été collectés et calculés en utilisant le logiciel ModFit LT version 3.2 (Verity Software House, Inc., ME, USA).

Tumorigénèse sous-cutanée chez les souris nues

Quarante-deux souris nues BALB/c-nu femelles (âgées de 4 s, pesant 16-24 g) ont été obtenues du Centre d'animaux expérimentaux de l'Université de Jilin (Changchun, Chine). Les souris nues ont été séparées en 14 groupes (n = 3). Les souris nues de sept groupes ont été, respectivement, injectées avec des cellules KYSE-30 selon le groupement cellulaire, et les souris nues dans les sept autres groupes ont été séparément injectées avec des cellules Eca109 basées sur le groupement. La concentration des cellules KYSE-30 et Eca109 transféctées a été ajustée à 5 × 10⁶ cellules/100 μL. Les souris nues ont été fixées et sous-cutanément injectées avec les cellules CEC correspondantes sous conditions stériles. La plus grande longueur (L) et largeur (W) des tumeurs ont été mesurées chaque semaine et le volume tumoral (V) = 1/2 × L × W². Les souris nues ont été euthanasiées à la 5^e semaine d'injection avec les tumeurs résecquées, et les tumeurs ont été pesées et photographiées. Le taux de formation tumorale a été calculé comme le nombre de souris avec tumeur sous-cutanée/nombre total de souris nues injectées dans le groupe × 100 %. Le temps d'injection a été pris comme abscisse, et la taille de la tumeur a été prise comme ordonnée ; ainsi, la courbe de croissance tumorale a été tracée.

Coloration immunohistochimique

Les tissus tumoraux des souris nues ont été fixés par 10 % de formaldéhyde, inclus dans la paraffine et sectionnés en 4 μm. Ensuite, les sections ont été séchées à 60 °C pendant 2 h, déparaffinées au xylène, déshydratées par éthanol gradient et incubées avec 50 μL de H₂O₂ à 3 % pendant 10 min. Ensuite, les sections ont été trempées dans une solution tampon d'acide citrique 0,01 M, bouillies à 95 °C pendant 20 min, bloquées par une solution de travail de sérum de chèvre normal à 37 °C pendant 10 min et ajoutées avec CD₃₄ (1:100, Santa Cruz) à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, les sections ont été supplémentées avec polymère IgG anti-lapin/souris marqué HRP (ZSGB-Bio, Pékin, Chine), contre-colorées par hématoxyline, déshydratées et perméabilisées puis scellées avec baume neutre. Le PBS a été utilisé pour remplacer les anticorps primaires comme NC. Mesure de la densité de microvaisseaux (DMV) : les sections ont été observées sous un microscope à faible grossissement. Une cellule endothéliale ou un groupe de cellules endothéliales colorées en jaune brunâtre et significativement distinguées des cellules tumorales environnantes et des tissus conjonctifs ont été prises comme microvaisseau. La structure de branche a également été prise comme vaisseau si elle était déconnectée, tandis que les vaisseaux avec lumière > 8 érythrocytes, couche musculaire ou lumière plus épaisse étaient exclus. Les nombres de microvaisseaux de 3 champs visuels élevés ont été enregistrés, et le nombre moyen était la DMV de chaque cas.

Analyse statistique

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le logiciel SPSS version SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) et présentées avec le logiciel Graphpad Prism Software 6.0. Les données étaient exprimées comme moyenne ± écart-type. Les différences entre deux groupes indépendants ont été testées avec le test t de Student. L'ANOVA unidirectionnelle a été réalisée pour comparer trois groupes ou plus. La valeur P < 0,05 était indicative de différence statistiquement significative.

Résultats

MiR-301 est hautement exprimé, tandis que PTEN est faiblement exprimé dans les tissus et cellules CEC

L'expression de miR-301 et PTEN dans les tissus CEC et tissus normaux adjacents a été évaluée en utilisant RT-qPCR et analyse Western blot pour révéler leurs rôles dans le CEC, et il a été trouvé que (Fig. 1a-c) miR-301 était surexprimé, tandis que PTEN était sous-exprimé dans les tissus CEC. Les patients ont été divisés en groupes d'expression faible et élevée selon la valeur médiane de l'expression de miR-301 ou PTEN pour analyser la corrélation entre l'expression de miR-301 ou PTEN et les caractéristiques clinicopathologiques des patients CEC. Les résultats ont indiqué que l'expression de miR-301/PTEN n'était pas liée à l'âge, au sexe, à la taille de la tumeur, à la localisation et à la différenciation, tandis qu'elle était corrélée avec le stade TNM et la MG des patients CEC (Tableau 2).

MiR-301 est hautement exprimé, tandis que PTEN est faiblement exprimé dans les tissus et cellules CEC. a Expression de miR-301 et expression d'ARNm de PTEN dans le tissu CEC détectée par RT-qPCR ; b expression protéique de PTEN dans le tissu CEC détectée par analyse Western blot ; c bandes de protéines de PTEN dans le tissu CEC en analyse Western blot ; d expression de miR-301 et expression d'ARNm de PTEN dans la lignée cellulaire CEC détectée par RT-qPCR ; e expression protéique de PTEN dans la lignée cellulaire CEC détectée par analyse Western blot ; f bandes de protéines de PTEN en analyse Western blot. *P < 0,05 versus HEEC. Les données étaient exprimées comme moyenne ± écart-type, et le test t a été effectué pour les comparaisons entre deux groupes

Ensuite, l'expression de miR-301 et PTEN dans 4 lignées cellulaires CEC et HEEC a été déterminée en utilisant RT-qPCR et analyse Western blot. Nous avons trouvé que (Fig. 1d-f) miR-301 était surexprimé et PTEN était sous-exprimé dans les lignées cellulaires CEC, parmi lesquelles KYSE-30 avait la plus haute expression de miR-301 et la plus basse expression de PTEN, tandis que Eca109 avait la tendance opposée. Ainsi, la lignée cellulaire KYSE-30 a été traitée avec miR-301 sous-exprimé/surexprimé PTEN et la lignée cellulaire Eca109 a été traitée avec miR-301 surexprimé/PTEN silencé dans les expériences cellulaires.

PTEN est ciblé par miR-301

Un logiciel bioinformatique (https://www.microrna.org/) a prédit que PTEN était le gène cible de miR-301 (Fig. 2a). Cela a été confirmé davantage par l'essai de gène rapporteur luciférase double que l'activité luciférase était significativement diminuée dans les cellules CEC co-transfectées avec le vecteur PTEN-wt et miR-301 mimic comparées à celles co-transfectées avec le vecteur PTEN-mut et miR-301 mimic, impliquant que miR-301 pouvait se lier particulièrement à PTEN (Fig. 2b, c).

PTEN est le gène cible de miR-301. a Sites de liaison de miR-301 et PTEN prédits par logiciel de prédiction en ligne ; b relation cible entre miR-301 et PTEN dans les cellules KYSE-30 évaluée par essai de gène rapporteur luciférase double ; c relation cible entre miR-301 et PTEN dans les cellules Eca109 évaluée par essai de gène rapporteur luciférase double ; d expression de miR-301 et expression d'ARNm PTEN dans les cellules KYSE-30 détectée par RT-qPCR après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; e expression protéique de PTEN dans les cellules KYSE-30 détectée par analyse Western blot après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; f bandes de protéines de PTEN dans les cellules KYSE-30 en analyse Western blot après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; g expression de miR-301 et expression d'ARNm PTEN dans les cellules Eca109 détectée par RT-qPCR après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN ; h expression protéique de PTEN dans les cellules Eca109 détectée par analyse Western blot après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN ; i bandes de protéines de PTEN dans les cellules Eca109 en analyse Western blot après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN. *P < 0,05 versus groupe inhibiteur-NC, & P < 0,05 versus groupe oe-NC, ^#P < 0,05 versus groupe inhibiteur miR-301 + si-NC, a P < 0,05 versus groupe mimic-NC, b P < 0,05 versus groupe si-NC, c P < 0,05 versus groupe mimic miR-301 + oe-NC ; N = 3. Les données étaient exprimées comme moyenne ± écart-type, et le test t a été effectué pour les comparaisons entre deux groupes. ANOVA a été utilisée pour les comparaisons parmi plusieurs groupes

RT-qPCR et analyse Western blot ont été utilisés pour évaluer l'expression de miR-301 et PTEN dans les cellules transféctées, et il a été trouvé que dans les cellules KYSE-30 (Fig. 2d-f), les cellules traitées avec inhibiteur miR-301 sous-exprimaient miR-301, tandis que surexprimaient PTEN ; les cellules traitées avec pcDNA-PTEN (oe-PTEN) élevaient l'expression de PTEN, et si-PTEN inversait l'effet de l'inhibiteur miR-301 sur l'expression de PTEN. Dans les cellules Eca109 (Fig. 2g-i), les cellules traitées avec mimic miR-301 surexprimaient miR-301, alors que sous-exprimaient PTEN ; les cellules traitées avec si-PTEN diminuaient l'expression de PTEN, et pcDNA-PTEN (oe-PTEN) inversait le rôle inhibiteur du mimic miR-301 dans l'expression de PTEN. Ces données suggéraient que miR-301 ciblait PTEN.

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé restreint la viabilité des cellules CEC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit favorise la viabilité des cellules CEC

La viabilité cellulaire des cellules CEC a été évaluée en utilisant les essais de formation de colonies et CCK-8. Les résultats ont révélé que dans la lignée cellulaire KYSE-30 (Fig. 3a-c), la transfection d'inhibiteur miR-301 ou oe-PTEN réprimait la capacité de formation de colonies et la viabilité cellulaire ; la transfection de PTEN silencé éliminait l'impact de l'inhibiteur miR-301 sur la viabilité des cellules CEC ; dans la lignée cellulaire Eca109 (Fig. 3d-f), la transfection de mimic miR-301 ou si-PTEN favorisait la capacité de formation de colonies et la viabilité cellulaire ; la surexpression de PTEN inversait le rôle promoteur de l'élévation de miR-301 dans la capacité de formation de colonies et la viabilité des cellules Eca109. Ces résultats suggéraient que la sous-expression de miR-301 ou la surexpression de PTEN réprimait la viabilité des cellules CEC, qui étaient favorisées par l'élévation de miR-301 ou l'inhibition de PTEN.

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé restreint la viabilité des cellules CEC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit favorise la viabilité des cellules CEC. a Nombre de colonies dans les cellules KYSE-30 après transfection détecté par essai de formation de colonies après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; b capacité de formation de colonies des cellules KYSE-30 après transfection détectée par essai de formation de colonies après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; c viabilité des cellules KYSE-30 après transfection détectée par essai CCK-8 après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; d nombre de colonies dans les cellules Eca109 après transfection détecté par essai de formation de colonies après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN ; e capacité de formation de colonies des cellules Eca109 après transfection détectée par essai de formation de colonies après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN ; f viabilité des cellules Eca109 après transfection détectée par essai CCK-8 après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN ; *P < 0,05 versus groupe inhibiteur-NC ; & P < 0,05 versus groupe oe-NC ; ^#P < 0,05 versus groupe inhibiteur miR-301 + si-NC ; a P < 0,05 versus groupe mimic-NC ; b P < 0,05 versus groupe si-NC ; c P < 0,05 versus groupe mimic miR-301 + oe-NC, N = 3. Les données étaient exprimées comme moyenne ± écart-type, et ANOVA a été utilisée pour les comparaisons parmi plusieurs groupes

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé réprime la migration et l'invasion des cellules CEC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit induit la migration et l'invasion des cellules CEC

Les capacités de migration et d'invasion des cellules CEC ont été évaluées en utilisant l'essai Transwell. Les résultats ont suggéré que dans la lignée cellulaire KYSE-30 (Fig. 4a, b), les capacités de migration et d'invasion cellulaires étaient retenues par l'inhibition de miR-301 ou la surexpression de PTEN ; le rôle suppresseur de l'inhibiteur miR-301 dans les capacités de migration et d'invasion cellulaires était inversé par si-PTEN. Dans la lignée cellulaire Eca109 (Fig. 4c, d), les capacités de migration et d'invasion cellulaires étaient favorisées après la transfection de mimic miR-301 ou si-PTEN ; PTEN surexprimé inversait l'impact du mimic miR-301 sur les capacités de migration et d'invasion cellulaires. Les résultats ci-dessus impliquaient que la migration et l'invasion des cellules CEC étaient inhibées par la répression de miR-301 ou l'élévation de PTEN, alors qu'elles étaient facilitées par la surexpression de miR-301 ou la sous-expression de PTEN.

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé réprime la migration et l'invasion des cellules CEC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit favorise la migration et l'invasion des cellules CEC. a Capacités de migration et d'invasion des cellules KYSE-30 transféctées évaluées par essai Transwell après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; b résultats statistiques des cellules migrées et invasives dans les cellules KYSE-30 par essai Transwell après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; c capacités de migration et d'invasion des cellules Eca109 parmi les groupes évaluées par essai Transwell après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN ; d résultats statistiques des cellules migrées et invasives dans les cellules Eca109 par essai Transwell après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN. *P < 0,05 versus groupe inhibiteur-NC ; & P < 0,05 versus groupe oe-NC ; ^#P < 0,05 versus groupe inhibiteur miR-301 + si-NC ; a P < 0,05 versus groupe mimic-NC ; b P < 0,05 versus groupe si-NC ; c P < 0,05 versus groupe mimic miR-301 + oe-NC, N = 3. Les données étaient exprimées comme moyenne ± écart-type, et ANOVA a été utilisée pour les comparaisons parmi plusieurs groupes

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé induit l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules CEC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit supprime l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules CEC

La cytométrie de flux a été utilisée pour détecter la transition du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules après transfection, et les résultats ont indiqué que dans la lignée cellulaire KYSE-30 (Fig. 5a-d), la transfection d'inhibiteur miR-301 ou oe-PTEN favorisait le taux d'apoptose et augmentait les cellules en phase G0/G1, tout en diminuant celles en phases S et G2/M ; l'altération de l'apoptose et de l'arrêt du cycle cellulaire induite par l'inhibiteur miR-301 pouvait être inversée par si-PTEN.

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé induit l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules CEC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit supprime l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose des cellules CEC. a Distribution du cycle cellulaire des cellules KYSE-30 dans chaque groupe détectée par cytométrie de flux après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; b résultats statistiques du pourcentage en G0/G1, S et G2/GM phases des cellules KYSE-30 en cytométrie de flux après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; c apoptose des cellules KYSE-30 détectée par cytométrie de flux après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; d taux d'apoptose des cellules KYSE-30 transféctées détecté par cytométrie de flux après sous-expression de miR-310 ou surexpression de PTEN ; e distribution du cycle cellulaire des cellules Eca109 dans chaque groupe détectée par cytométrie de flux après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN ; f résultats statistiques du pourcentage en G0/G1, S et G2/GM phases des cellules Eca109 en cytométrie de flux après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN ; g apoptose des cellules Eca109 détectée par cytométrie de flux après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN ; h taux d'apoptose des cellules Eca109 transféctées détecté par cytométrie de flux après surexpression de miR-310 ou sous-expression de PTEN. *P < 0,05 versus groupe inhibiteur-NC ; & P < 0,05 versus groupe oe-NC ; ^#P < 0,05 versus groupe inhibiteur miR-301 + si-NC ; a P < 0,05 versus groupe mimic-NC ; b P < 0,05 versus groupe si-NC ; c P < 0,05 versus groupe mimic miR-301 + oe-NC, N = 3. Les données étaient exprimées comme moyenne ± écart-type, et ANOVA a été utilisée pour les comparaisons parmi plusieurs groupes

Selon les résultats de cytométrie de flux, nous avons trouvé que dans la lignée cellulaire Eca109 (Fig. 5e-h), la transfection de mimic miR-301 ou si-PTEN inhibait le taux d'apoptose, diminuait les cellules en phase G0/G1 et augmentait celle de la phase S et G2/M ; la surexpression de PTEN inversait l'effet du mimic miR-301 sur le taux d'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire des cellules Eca109. Nous avons conclu de ces résultats que la sous-expression de miR-301 ou la surexpression de PTEN favorisait la transition du cycle cellulaire et l'apoptose dans les cellules CEC, tandis que l'inhibition de miR-301 ou le silence de PTEN exerçaient des effets opposés.

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé restreint la croissance tumorale et l'angiogenèse in vivo dans le CEC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit augmente la croissance tumorale et l'angiogenèse in vivo dans le CEC

La croissance et les changements des tumeurs CEC chez les souris nues ont été observés dans chaque groupe. La croissance tumorale a été évaluée, et les résultats impliquaient que dans la lignée cellulaire KYSE-30 (Fig. 6a-e), les souris nues injectées avec inhibiteur miR-301 ou oe-PTEN réduisaient le volume et le poids tumoral ; le rôle répresseur de l'inhibiteur miR-301 dans la croissance tumorale était aboli par si-PTEN. Dans la lignée cellulaire Eca109 (Fig. 6f-j), le volume tumoral et le poids tumoral étaient avancés chez les souris nues injectées avec mimic miR-301 ou si-PTEN ; la surexpression de PTEN inversait l'effet du mimic miR-301 sur la croissance tumorale. Pendant ce temps, l'expression de CD34 dans les xénogreffes des souris nues a été évaluée en utilisant la coloration immunohistochimique et les résultats ont montré que (Fig. 7a-d) dans les xénogreffes KYSE-30, la DMV était retenue après la sous-expression de miR-301 ou la surexpression de PTEN ; PTEN silencé inversait l'impact de l'inhibition de miR-301 sur la DMV. Dans les xénogreffes Eca109, la DMV était augmentée après la surexpression de miR-301 ou la sous-expression de PTEN ; l'amélioration de la DMV induite par la surexpression de miR-301 pouvait être abolie par PTEN surexprimé. Ces données indiquaient que l'inhibition de miR-301 ou la surexpression de PTEN réprimait la croissance tumorale et l'angiogenèse dans le CEC, tandis que l'élévation de miR-301 ou le silence de PTEN avaient des effets inverses.

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé restreint la croissance tumorale dans le CEC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit augmente la croissance tumorale dans le CEC. a Figures représentatives pour la croissance tumorale observée par tumorigénèse sous-cutanée chez les souris nues après transfection des cellules KYSE-30 ; b-d changements de volume tumoral de chaque groupe après transfection des cellules KYSE-30 ; e changements de poids tumoral de chaque groupe après transfection des cellules KYSE-30 ; f figures représentatives pour la croissance tumorale observée par tumorigénèse sous-cutanée chez les souris nues après transfection des cellules Eca109 ; g-i changements de volume tumoral de chaque groupe après transfection des cellules Eca109 ; j changements de poids tumoral de chaque groupe après transfection des cellules Eca109. *P < 0,05 versus groupe inhibiteur-NC ; & P < 0,05 versus groupe oe-NC ; ^#P < 0,05 versus groupe inhibiteurs miR-301 + si-NC ; a P < 0,05 versus groupe mimic-NC ; b P < 0,05 versus groupe si-NC ; c P < 0,05 versus groupe mimic miR-301 + oe-NC, n = 3 souris. Les données étaient exprimées comme moyenne ± écart-type, et ANOVA a été utilisée pour les comparaisons parmi plusieurs groupes

MiR-301 inhibé ou PTEN surexprimé restreint l'angiogenèse dans le CEC ; miR-301 élevé ou PTEN réduit augmente l'angiogenèse dans le CEC. a Images représentatives des tissus tumoraux observées par coloration immunohistochimique chez les souris nues après transfection des cellules KYSE-30 ; b comparaisons de DMV de KYSE-30 dans les tissus tumoraux parmi les groupes ; c images représentatives des tissus tumoraux observées par coloration immunohistochimique chez les souris nues après transfection des cellules Eca109 ; d comparaisons de DMV de Eca109 dans les tissus tumoraux parmi les groupes *P < 0,05 versus groupe inhibiteur-NC ; & P < 0,05 versus groupe oe-NC ; ^#P < 0,05 versus groupe inhibiteurs miR-301 + si-NC ; a P < 0,05 versus groupe mimic-NC ; b P < 0,05 versus groupe si-NC ; c P < 0,05 versus groupe mimic miR-301 + oe-NC, n = 3 souris. Les données étaient exprimées comme moyenne ± écart-type, et ANOVA a été utilisée pour les comparaisons parmi plusieurs groupes

Discussion

Le CO est un type de malignité invasive dans le tractus gastro-intestinal [16]. En tant que type majeur de CO, le CEC est une tumeur maligne se produisant dans les cellules épithéliales de l'œsophage [17]. Les miARN, connus comme petits ARN non codants, ont été démontrés pour fonctionner comme des rôles significatifs dans les molécules directrices dans le silence de l'ARN [18]. Notre recherche a été conçue pour explorer les effets de miR-301 et son gène cible PTEN sur la progression du CEC, et nous avons trouvé que le miR-301 inhibé pouvait supprimer l'angiogenèse et la croissance cellulaire dans le CEC en élevant PTEN.

L'expression de miR-301 a été évaluée, et nous avons trouvé que miR-301 était hautement exprimé dans les cellules CEC en comparaison avec HEEC, et la plus haute expression de miR-301 a également été trouvée dans les tissus CEC en contraste avec les tissus normaux adjacents. Similaire à ce résultat, Li et al. ont identifié que miR-301 présentait une haute expression dans les tissus d'infarctus myocardique [19]. En outre, nous avons élucidé que PTEN était ciblé par miR-301, et la relation cible a été pointée par une littérature existante [20]. Nous avons également découvert que PTEN, qui a été affirmé comme ciblé par miR-301, était sous-exprimé dans les tissus et cellules CEC. Similairement, une recherche précédente a déterré que PTEN était faiblement exprimé dans le CEC comparé au tissu épithélial œsophagien non tumoral [21]. De plus, Ma et al. ont illuminé que l'expression de PTEN était dégradée dans la lignée cellulaire Eca109 [22], qui a également été sélectionnée pour une série d'expériences dans cette recherche. Ces études fournissent des preuves pour la haute expression de miR-301 et la faible expression de PTEN dans le CEC.

Un autre résultat important dans cette recherche indiquait que le miR-301 inhibé pouvait réprimer la capacité de formation de colonies ainsi que la prolifération cellulaire des cellules CEC via l'amélioration de l'expression de PTEN, et miR-301 élevé ou PTEN réduit avait des effets contraires. Similairement, Han et al. ont élucidé que la sous-expression de miR-301 médiatisée par la lutéoline a la capacité de restreindre la prolifération cellulaire dans le cancer de la prostate [6]. Une littérature récente a révélé que la surexpression de PTEN supprime la prolifération des cellules de cancer du pancréas [23], et un même résultat a été résumé dans une étude se concentrant sur le cancer de la prostate [24]. En plus, nous avons aussi déterré que la sous-expression de miR-301 ou l'élévation de PTEN pouvait inhiber la migration et l'invasion des cellules CEC, et miR-301 élevé ou PTEN réduit exhibait les tendances opposées. Conformément à ce résultat, Shi et al. ont soutenu que miR-301 inhibé atténuait la migration et l'invasion des cellules de cancer du sein [10], et il a été rapporté que la migration et l'invasion des cellules CEC pouvaient être réprimées par l'inhibition de miR-130b et l'élévation de PTEN [25]. Ces publications ont aidé à vérifier le rôle oncogénique de miR-301 et l'effet suppresseur de tumeur de PTEN dans divers cancers humains. Un autre résultat dans notre recherche était que miR-301 inhibé surexprimait PTEN pour promouvoir l'apoptose cellulaire et induire l'arrêt du cycle cellulaire à la phase G0/G1 dans les cellules CEC, et miR-301 élevé ou PTEN réduit avait les résultats inverses. Similairement, il a été découvert par une littérature récente que PTEN activé induit l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose dans le CEC [26]. Consistamment, Tian et al. ont trouvé dans leur étude que l'élévation de PTEN inhibait l'angiogenèse en réduisant l'expression du facteur de croissance endothélial vasculaire dans le carcinome hépatocellulaire [27]. Basé sur les données ci-dessus, les rôles de miR-301 et PTEN dans l'apoptose cellulaire et l'angiogenèse dans diverses maladies étaient davantage confirmés. Par conséquent, nous avons conclu que la sous-expression de miR-301 pouvait restreindre la croissance tumorale dans le CEC à travers la haute expression de PTEN, et la conclusion similaire a également été dévoilée dans le cancer du sein [10] et le cancer de la prostate [28]. Au contraire, l'élévation de miR-301 ou la réduction de PTEN induisait la croissance tumorale dans le CEC. On pourrait conclure que miR-301 et PTEN participaient à la croissance des cellules cancéreuses in vivo.

Conclusion

Dans cette étude, nous avons montré que la répression de miR-301 interdit l'angiogenèse, la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion mais favorise l'apoptose dans les cellules CEC en surexprimant PTEN. Cette recherche peut faire avancer la compréhension des mécanismes moléculaires potentiels du CEC et fournir de nouvelles cibles pour le traitement du CEC.

Abréviations

CEC :

Carcinome épidermoïde de l'œsophage

PTEN :

Phosphatase et tensine homologue

DMV :

Densité de microvaisseaux

CO :

Cancer de l'œsophage

miARN :

MicroARN

MG :

Métastase ganglionnaire

UICC :

Union pour le contrôle international du cancer

RT-qPCR :

Réaction de polymérase en chaîne par transcription inverse quantitative

3'UTR :

Région 3'-non traduite

WT :

Type sauvage

MUT :

Type mutant

HRP :

Peroxydase de raifort

FBS :

Sérum fœtal bovin

OE :

Surexprimé

NC :

Contrôle négatif

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire

DMEM :

Milieu Dulbecco modifié Eagle

PI :

Iodure de propidium

FITC :

Fluorescéine isothiocyanate

ANOVA :

Analyse de variance