Amélioration de la biocompatibilité d'échafaudages nanofibres PANI/PLA par morphologie de surface contrôlée via dopage par acides inorganiques

Résumé

Les échafaudages nanofibreux conducteurs et dégradables ont un grand potentiel pour favoriser la croissance, la prolifération et la différenciation cellulaire sous un champ électrique externe. Bien que le problème de conductivité électrique inférieure dans les fluides corporels persiste, les nanofibres dégradables à base de polyaniline (PANI) peuvent favoriser l'adhésion, la croissance et la prolifération cellulaire. Pour étudier si l'effet est causé par la morphologie du PANI, nous avons sélectionné trois acides inorganiques comme dopants dans le processus de polymérisation oxydative in situ du PANI : l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide perchlorique. Les nanofibres composites polyaniline/acide polylactique (PANI/PLA) obtenues ont été caractérisées via MEB, FTIR et analyse XPS, et nous avons confirmé que les nanofibres PLA étaient enrobées avec succès par le PANI sans aucun changement de la structure poreuse des nanofibres PLA. Les propriétés mécaniques in vitro et la dégradabilité indiquaient que l'oxydation des dopants acides devait être considérée et qu'elle avait probablement un effet de dégradation oxydative plus élevé sur les nanofibres PLA. Le test d'angle de contact a démontré que les nanofibres composites PANI/PLA avec différentes morphologies de surface ont une bonne mouillabilité, impliquant qu'elles répondent aux exigences des échafaudages d'ingénierie tissulaire osseuse. La rugosité de surface et la viabilité cellulaire ont démontré que différentes morphologies de PANI en surface peuvent favoriser la prolifération cellulaire. Plus la rugosité de surface du PANI est élevée, meilleure est la biocompatibilité. Par conséquent, la morphologie de surface régulée des nanofibres composites PANI/PLA via différents dopages acides a un effet positif sur la biocompatibilité en ingénierie tissulaire.

Introduction

La matrice extracellulaire (MEC) est un type de réseau macromoléculaire sécrété par les cellules dans la stroma extracellulaire. Elle présente la fondation des cellules, des tissus et des organes, accompagnée d'organes, et est caractérisée par une structure de grille complexe [1, 2]. De plus, elle fournit un site approprié pour la survie et l'activité des cellules, déterminant leur forme, contrôlant leur différenciation, participant à leur migration et métabolisme, et affectant finalement leur survie, croissance et mort [3, 4]. Les nanofibres par électrofilage peuvent simuler l'action de la matrice extracellulaire pour réguler le comportement cellulaire en raison de leur grande surface spécifique, de leurs propriétés mécaniques appropriées et de leur biodégradabilité. En outre, les nanofibres par électrofilage peuvent être multifonctionnelles par modification de surface sur la base du maintien de leur structure poreuse. Par conséquent, les nanofibres par électrofilage sont devenues un matériau candidat prometteur en ingénierie tissulaire, largement appliquées dans l'administration de médicaments, la régénération orthopédique, la régénération nerveuse et la réparation [5-10].

Les polymères conducteurs (par ex., polypyrrole [PPy], polythiophène [PTH] et polyaniline [PANI]) ont une bonne biocompatibilité in vitro et in vivo, qui peuvent affecter significativement l'adhésion cellulaire, la prolifération, la différenciation ainsi que la régénération tissulaire [11-13]. Parmi ces polymères conducteurs, le PANI est considéré comme un matériau potentiel pour l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative en raison de sa bonne processabilité, de son excellente conductivité, de sa bonne stabilité redox et de sa biocompatibilité [14, 15]. Sous stimulation électrique, le PANI peut réguler l'adhésion cellulaire, la prolifération, la migration et la différenciation [16, 17]. En fait, de nombreux rapports ont conclu que les nanofibres composites conductrices dégradables à base de PANI favorisent le comportement cellulaire sous un champ électrique [18-21]. Cependant, cela implique un problème crucial : la conductivité du PANI dans l'environnement physiologique (pH = 7,4) sera affaiblie en raison de la dé-dopage du PANI, ce qui, comme l'ont démontré les études antérieures, diminue ses avantages d'activité électrique favorisant la prolifération et la différenciation cellulaire [22]. Bien que cela présente clairement une limitation des nanofibres conductrices dégradables à base de PANI en ingénierie tissulaire osseuse sous stimulation électrique externe, elles peuvent encore favoriser la prolifération et la croissance cellulaire de manière significative [23, 24]. Ici, nous avons spéculé que la morphologie de surface du PANI augmente la rugosité des nanofibres composites, ce qui est propice à l'adhésion, la croissance et la prolifération cellulaire.

Le polyaniline dopé avec des acides inorganiques a généralement une bonne conductivité électrique. Cependant, les anions introduits par divers dopants acides inorganiques affecteront la conductivité et la structure du polyaniline [25-27]. Dans cet article, trois acides inorganiques courants, à savoir l'acide chlorhydrique (HCl, HA), l'acide sulfurique (H₂SO₄, SA) et l'acide perchlorique (HClO₄, PA), ont été sélectionnés comme dopants dans une polymérisation oxydative in situ du PANI. Ensuite, les propriétés mécaniques, la mouillabilité, la morphologie de surface, la biocompatibilité et l'adhésion cellulaire des nanofibres PANI/acide polylactique (PLA) ont été étudiées sous différents dopants acides. Les résultats ont indiqué que plus la rugosité de surface du PANI est élevée, meilleure est la prolifération cellulaire, montrant ainsi une meilleure biocompatibilité.

Méthodes/Expérimental

Produits chimiques

L'aniline (AN) a été achetée chez Sigma, le PLA (Mw = 60 000) chez Solarbio, le dichlorométhane (DCM) chez Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., et le N,N-diméthylformamide (DMF) chez Macklin. Pendant ce temps, le persulfate d'ammonium (APS) a été acheté chez Aladdin, HCl et H₂SO₄ chez Guangzhou Chemical Co., Ltd., et HClO₄ chez Macklin.

Préparation des nanofibres Polyaniline/Acide Polylactique

Fabrication des nanofibres d'acide polylactique par électrofilage

Des particules de PLA avec une masse spécifique ont été ajoutées dans une solution mixte de DCM et DMF (rapport volumique 7:3) avant d'être agitées jusqu'à dissolution, et une solution mixte de 10 % PLA a été obtenue. La solution de PLA a ensuite été distribuée dans une seringue et connectée à une alimentation haute tension. La machine d'électrofilage (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) a été réglée avec une tension de 15 kV et une distance de 15 cm. Les nanofibres PLA obtenues ont été séchées sous vide pendant la nuit à 40 °C.

Préparation des nanofibres Polyaniline/Acide Polylactique dopées avec différents acides inorganiques

Les nanofibres PLA ont été placées dans la chambre de la machine de nettoyage plasma (PCE-6, MTI Corporation, USA) et déchargées pendant 2 min à 30 W de puissance RF. Dans cet article, trois acides inorganiques courants, à savoir HCl, H₂SO₄ et HClO₄, ont été utilisés comme dopants pour la polymérisation oxydative in situ dans la préparation des nanofibres PANI/PLA [24], et les nanofibres PANI correspondantes ont été marquées comme PANI-HA, PANI-SA et PANI-PA, respectivement, tandis que les nanofibres nanocomposites PANI/PLA ont été étiquetées comme PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA et PANI/PLA-PA, respectivement. Le processus de préparation des nanofibres PLA et PANI/PLA composites est montré Fig. 1.

Schéma représentant le processus de préparation des nanofibres PLA et PANI/PLA composites

Les nanofibres nanocomposites PANI/PLA ont été préparées sous conditions de bain de glace [16, 28]. L'APS et l'AN ont été ajoutés à une solution acide 1 M selon un rapport molaire de 1:1. Ici, nous prenons le HCl comme exemple pour illustrer le processus de préparation des nanofibres PANI/PLA. Sous conditions de bain de glace, l'AN (930 mg, 0,01 mol) a été ajouté goutte à goutte dans l'APS (2 280 mg, 0,01 mol) et dissous dans 50 mL de HCl 1 M. Immédiatement, la membrane de nanofibres PLA traitée par plasma a été immergée dans la solution et agitée pendant 2 h à 0 °C. Après la réaction, la membrane de nanofibres PLA a été nettoyée plusieurs fois avec HCl et éthanol pour éliminer le PANI non attaché avant d'être séchée pendant la nuit à 40 °C pour obtenir les nanofibres PANI/PLA-HA, qui ont été mises de côté pour une utilisation ultérieure. Les nanofibres composites PANI/PLA-SA et PANI/PLA-PA ont été obtenues suivant une approche similaire.

Caractérisation

Les essais de traction uniaxiale pour les nanofibres PLA et les nanofibres composites PANI/PLA ont été réalisés via un test contrainte-déformation (Shimadzu AGX-PLUS, Japon). Ici, l'échantillon a été découpé en forme d'haltère, avec une vitesse de traction maintenue constante à 3 mm/min. Le module de Young a été calculé à partir de la région linéaire 0-15 % de déformation dans la courbe contrainte-déformation, et la résistance à la traction et le taux de rupture de la courbe ont été déterminés à partir de la rupture de la membrane de nanofibres.

La morphologie des échafaudages nanofibres a été caractérisée via microscopie électronique à balayage à émission de champ (MEB-FEC) (Hitachi-SU8220, Japon) pour observer les différentes morphologies du PANI dopé avec différents acides inorganiques. Avant l'observation MEB, les échantillons de nanofibres ont été pulvérisés d'or pendant 60 s pour permettre une observation plus claire de la morphologie. Pendant ce temps, la rugosité de surface des nanofibres composites PANI/PLA a été mesurée en utilisant la microscopie à force atomique (AFM, Bruker Dimension Edge). Pour confirmer que le PANI était complètement chargé sur les nanofibres PLA, la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) a été utilisée pour mesurer le changement de longueur d'onde de 2000 ~ 500 cm⁻¹. La spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS ; Thermo ESCALAB 250) et Al-Kα ont été utilisés comme sources d'émission de rayons X pour déterminer davantage la composition de surface des nanofibres PANI/PLA, tandis que leur mouillabilité a été mesurée en termes d'angle de contact des gouttes d'eau à température ambiante via analyse d'angle de contact (OCA 15 plus, Allemagne). La dégradation des nanofibres a été évaluée en utilisant une méthode de perte de masse [29, 30]. Les membranes de nanofibres ont été découpées en disques de 16 mm et placées dans 20 mL de solution saline tamponnée phosphate (PBS) avec un pH de 7,4 avant que les échafaudages ne soient incubés à 37 °C pendant 7, 14 et 21 jours et séchés à poids constant.

Biocompatibilité des échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA

Biocompatibilité

Dans cet article, la biocompatibilité des échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA a été caractérisée par l'expérience d'activité des cellules d'ostéosarcome humain (HOS). Les cellules HOS ont été achetées auprès de la banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences, Shanghai. Les cellules HOS ont été cultivées dans le milieu Dulbecco modifié à faible glucose (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal bovin, 100 U/mL pénicilline et 100 U/mL streptomycine avant d'être incubées à 37 °C et 5 % CO₂. Lorsque la croissance cellulaire a atteint un degré de fusion de 90 %, les cellules ont été passées à un ratio de 1:3.

Les cellules HOS devaient être ensemencées sur les nanofibres PANI/PLA avant le test de prolifération cellulaire. Ici, les nanofibres ont été placées dans une plaque à 96 puits de manière à recouvrir complètement le fond de la plaque avant d'être stérilisées via UV pendant 30 min et via une solution d'éthanol à 75 % pendant 30 min. Elles ont ensuite été lavées avec PBS. Les nanofibres ont ensuite été inoculées avec une densité de 1 × 10⁴ par puits, tandis qu'un groupe blanc et un groupe témoin étaient simultanément mis en place. Les cellules ont ensuite été incubées dans un incubateur cellulaire à 37 °C pendant un, trois et cinq jours, avec le milieu rafraîchi tous les deux jours.

La viabilité cellulaire des nanofibres PANI/PLA a été évaluée en utilisant un essai 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2-H-tétrazolium bromide (MTT). Après incubation à un, trois et cinq jours, le milieu a été retiré de la plaque à 96 puits et lavé avec PBS trois fois avant d'ajouter 1 mL de DMEM contenant 10 % de 5 mg/mL MTT. Le milieu a ensuite été incubé à 37 °C pendant 4 h puis retiré avant d'ajouter du DMSO pour dissoudre la méthylprednisolone. Le milieu a été vibré pendant 10 min, puis l'absorbance a été déterminée (BioTek Synergy HTX, USA).

Immunomarquage fluorescent

Les cellules HOS ont été incubées dans l'incubateur de nanofibres PANI/PLA pendant 24 h et ont été lavées avec PBS trois fois. Ensuite, les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 10 min à température ambiante. Les cellules fixées ont été lavées avec PBS trois fois (10 min chaque fois) et 10 μL de peptide marqué FITC à 100 nM ont été ajoutés avant que les cellules ne soient incubées pendant 30 min à température ambiante et puis lavées avec PBS trois fois (5 min chaque fois). L'actine extracellulaire des cellules HOS a été colorée, avec la microscopie confocale (Type A1, Nikon, Japon) utilisée pour observer la coloration cellulaire à un grossissement 20×.

Adhésion cellulaire

L'adhésion des cellules HOS sur les échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA a été observée via MEB. Ici, le milieu de culture a été retiré après la culture de 24 h des cellules HOS sur nanofibres PANI/PLA et a ensuite été lavé avec PBS trois fois avant l'ajout de 4 % PFA. Le milieu a été fixé pendant la nuit à 4 °C, lavé avec PBS trois fois, déshydraté avec une solution d'éthanol gradient (30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 90 % et 100 % respectivement ; 20 min chaque fois), puis lyophilisé pendant 24 h. Avant l'observation MEB, les nanofibres ont été pulvérisées de platine pendant 120 s pour permettre une meilleure observation.

Activité de la phosphatase alcaline (ALP)

L'ALP est l'un des marqueurs précoces de différenciation ostéoblastique couramment utilisés qui dépendent de l'expression de l'enzyme phosphatase alcaline. Ici, l'activité ALP a été réalisée en utilisant le kit ALP Assay (Beyotime Biotechnology, P0321S). Les cellules HOS ont été cultivées sur différents échafaudages composites PANI/PLA pendant 7 jours désignés. Les cellules ont été lysées en utilisant 50 μL de Tris-HCl (0,1 M, pH 8) avec 0,1 % (v/v) triton X-100. L'activité ALP est analysée en quantifiant la concentration de p-nitrophénol à partir de p-nitrophényl phosphate (PNPP), qui est estimée en enregistrant l'absorbance à 405 nm. Le pourcentage d'activité ALP des cellules cultivées le long des nanofibres PANI/PLA est calculé en comparant l'activité ALP des cellules cultivées sur des nanofibres PLA pures.

Analyse statistique

La signification statistique des résultats a été évaluée via une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) en utilisant GraphPad Prism (version 8.02). Ici, les différences dans les propriétés mécaniques, la biodégradabilité in vitro et la viabilité cellulaire parmi les différents échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA ont été analysées. Les résultats étaient considérés comme significatifs lorsque p < 0,05 (∗) et très significatifs lorsque p < 0,005 (∗∗).

Résultats et Discussion

Les propriétés mécaniques des échafaudages d'ingénierie tissulaire sont des indicateurs importants dans l'évaluation de la capacité des échafaudages à résister à la dynamique des fluides. La présence d'acides inorganiques peut affecter les propriétés physico-chimiques de la matrice PLA des nanofibres composites PANI/PLA dans le processus de polymérisation oxydative chimique in situ du PANI. Par conséquent, l'exploration des propriétés mécaniques des nanofibres composites PANI/PLA dopées avec des acides inorganiques est nécessaire. Ici, les propriétés mécaniques des nanofibres composites PANI/PLA ont été évaluées via un essai de traction, qui est montré Fig. 2, incluant contrainte-déformation, module de Young, résistance à la traction et allongement à la rupture. Comme montré Fig. 2a, les nanofibres PLA présentaient un comportement élastique linéaire, et les nanofibres composites PANI/PLA-HA et PANI/PLA-SA présentaient un comportement de seuil clair, tandis que les nanofibres composites PANI/PLA-PA se rompaient immédiatement après la déformation élastique. Le module de Young (Fig. 2b) des nanofibres composites PANI/PLA était plus élevé que celui des nanofibres PLA. Comparé au PLA, l'augmentation du module d'élasticité de PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA et PANI/PLA-PA était de 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 et 28,43 ± 8,34 MPa, respectivement. En termes de résistance à la traction (Fig. 2c) et de rapport de rupture à la traction (Fig. 2d), ceux de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-PA diminuaient, tandis que ceux de PANI/PLA-SA augmentaient légèrement ; la résistance à la traction et l'allongement à la rupture de PANI/PLA-PA étaient les plus bas. Comparé aux nanofibres PLA, la résistance à la traction de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-PA diminuait de 0,15 ± 0,01 et 0,64 ± 0,03 MPa, respectivement, tandis que celle de PANI/PLA-SA augmentait légèrement de 0,13 ± 0,05 MPa. L'allongement à la rupture de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-PA diminuait de 16,93 ± 1,38 % et 35,42 ± 3,94 %, respectivement, tandis que celui de PANI/PLA-SA augmentait de 3,32 ± 0,13 %.

Propriétés mécaniques des nanofibres PLA et nanofibres composites PANI/PLA. a Courbes représentatives contrainte-déformation, b Module de Young, c résistance à la traction à la rupture, d allongement à la rupture

Comme montré Fig. 2, les acides inorganiques sélectionnés peuvent augmenter le module d'élasticité des nanofibres PLA par la connexion du revêtement PANI. En termes de résistance à la traction et d'allongement à la rupture, comparé aux nanofibres PLA, les propriétés mécaniques de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-SA variaient à des degrés divers, tandis que celles de PANI/PLA-PA diminuaient le plus clairement, et dès que la contrainte était appliquée pendant le test, une rupture se produisait en moins de 5 s. Ces résultats peuvent être dus à l'oxydation de HClO₄, qui a entraîné la rupture de la liaison ester dans la chaîne moléculaire de PLA et la décomposition oxydative du groupe carboxyle, conduisant ensuite à des propriétés mécaniques inférieures [31]. Pendant ce temps, les différentes propriétés mécaniques de PANI/PLA-HA et PANI/PLA-SA peuvent être liées à la densité différente du PANI dopé par HCl et H₂SO₄, tandis que l'introduction de l'APS dans le processus de réaction peut aussi avoir eu un léger impact sur les nanofibres PLA, l'effet complet de ces facteurs exhibant différentes propriétés mécaniques [32].

L'adhésion cellulaire, la prolifération et la différenciation sont affectées par la morphologie, une surface rugueuse étant généralement considérée comme propice à l'adhésion cellulaire [33]. L'hydrophobicité des nanofibres PLA implique que la polymérisation uniforme du PANI présente une barrière, tandis que le traitement de surface des nanofibres PLA avec plasma peut améliorer significativement la mouillabilité [34]. Suite à la polymérisation in situ à base de PANI avec différents dopants acides inorganiques, des nanofibres composites PANI/PLA avec un dépôt de surface uniforme ont été obtenues.

La morphologie du PANI sur la surface des différentes fibres PANI/PLA a été observée via MEB-FEC (Fig. 3). La figure montre clairement que la surface des nanofibres PLA était recouverte par de nombreuses nanoparticules irrégulières et que les nanofibres composites PANI/PLA dopées avec les acides inorganiques étaient capables de maintenir une bonne morphologie de fibre et une structure nanofibreuse poreuse. Les observations de morphologie ont révélé que les nanofibres composites PANI/PLA étaient chargées avec succès en PANI, ce qui fournissait une base pour l'adhésion et la prolifération cellulaire. Pendant ce temps, l'AFM a été utilisé pour mesurer la rugosité de surface des nanofibres composites PANI/PLA, comme montré Fig. 4. Ra, la valeur moyenne de la rugosité de surface à trois positions différentes de chaque échantillon, est généralement utilisée pour évaluer la rugosité de surface de l'échantillon. De plus, le Ra des nanofibres composites PANI/PLA était supérieur à celui des nanofibres PLA, et le Ra de PANI/PLA-PA était le plus élevé. Cette augmentation de la rugosité de surface a accéléré la surface et la polarité, fournissant potentiellement plus de sites de croissance pour les cellules et favorisant l'adhésion cellulaire.

Morphologie de a nanofibres PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA et d nanofibres composites PANI/PLA-PA

Image AFM et rugosité de surface (Ra) de a nanofibres PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA et d nanofibres composites PANI/PLA-PA

L'adhésion cellulaire, la migration et la prolifération sont significativement affectées par la mouillabilité des échafaudages [35, 36]. En général, la mouillabilité est évaluée en termes d'angle de contact entre l'échafaudage et l'eau. Étant donné que le PLA est hydrophobe, nous avons mesuré l'angle de contact des gouttes d'eau sur la membrane de nanofibres dans 1 s, comme montré Fig. 5, et les angles de contact des nanofibres PANI/PLA après traitement ont été trouvés significativement diminués. Les angles de contact correspondants du PLA, PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA et PANI/PLA-PA étaient de 112°, 61,6°, 36,7° et 37,2°, respectivement. La morphologie PANI de PANI/PLA a augmenté l'énergie de surface du système, avec la zone de contact augmentant au contact initial avec l'eau, résultant en la diminution de l'angle de contact et l'amélioration de la mouillabilité. L'angle de contact des nanofibres composites est passé à 0° après 5 s de contact avec l'eau, démontrant ainsi une bonne hydrophilie. Cet échafaudage hydrophile fournissait également des conditions favorables pour l'adhésion et la diffusion cellulaire [37] puisque les groupes fonctionnels contenant de l'oxygène (par ex., -OH et -COOH) sur la surface PLA étaient plus liés à la surface des nanofibres suite au traitement plasma, et la morphologie PANI et les groupes fonctionnels contenant de l'oxygène travaillaient ensemble pour assurer que les nanofibres composites PANI/PLA étaient finalement complètement mouillées [38, 39].

Angle de contact de a nanofibres PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA et d nanofibres composites PANI/PLA-PA

Les spectres FTIR du PANI pur et des nanofibres composites PANI/PLA dopés par différents acides inorganiques sont montrés Fig. 6. Dans le spectre PANI pur dopé (Fig. 6a), les pics caractéristiques forts à 1 565, 1 485, 1 298 et 1 125 cm⁻¹ correspondent à un étirement C=C des cycles quinoïdes et un étirement C=C, étirement C-N et étirement =C-H des cycles benzoïdes, respectivement. Dans le spectre PANI pur dopé (Fig. 6b), en plus du pic caractéristique PANI, un pic PLA peut également être vu (pics de vibration d'étirement C-O de 1092 et 1184 cm⁻¹, pic de vibration d'étirement C=O de 1757 cm⁻¹). Ces résultats indiquent que le PANI a été chargé avec succès sur la surface des nanofibres PANI/PLA dopées avec des acides inorganiques. Pour étudier davantage la composition chimique des nanofibres PANI/PLA, la XPS a été utilisée pour analyser leur composition de surface. De plus, dans les spectres XPS (Fig. 7a), des pics N1s clairs étaient visibles à ~ 400 eV dans les nanofibres composites PANI/PLA. De plus, des pics Cl2p étaient visibles à ~ 200 eV dans PANI/PLA-HA et PANI/PLA-PA, tandis que l'intensité du pic Cl2p avec PANI/PLA-PA était plus élevée qu'avec PANI/PLA-HA. Un pic S2p apparaissait à ~ 210 eV sur les spectres XPS dans PANI/PLA-SA. Les spectres XPS indiquaient que Cl⁻, SO₄²⁻ et ClO₄⁻ étaient dopés sur les nanofibres PANI/PLA correspondantes. En outre, les atomes d'azote imine du PANI étaient complètement ou partiellement oxydés pour produire une série d'états d'oxydation accompagnés de degrés variables de protonation. Les changements d'état d'oxydation et de niveau de protonation du PANI étaient mesurés en termes de spectres de niveau nucléaire N1s (Fig. 7b-d). Chaque spectre N1s peut être déconvolué en quatre composants majeurs avec des énergies de liaison d'environ 398,7, 399,6, 400,4 et 401,8 eV, qui peuvent être attribués à l'imine quinoïde (–N=), l'amine benzoïde (–NH–), l'amine protonée (–N⁺) et l'imine protonée (=N⁺), respectivement [40, 41]. En référence à l'étude de Kumar [42], le pic d'ajustement du spectre N1s a été considéré comme affecté par la charge dans les anions liés par les atomes N protonés, ce qui a entraîné une délocalisation et un léger décalage.

Spectres FTIR de a PANI, b PLA et nanofibres composites PANI/PLA

Spectres XPS (a) des échafaudages nanofibreux composites PANI/PLA préparés et PANI/PLA-HA (b), PANI/PLA-SA (c) et PANI/PLA-PA (d) du signal de niveau de cœur N1s

En tant que modèle pour la réparation et la régénération tissulaire, les échafaudages bioactifs sont dégradés et excrétés hors du corps suite à la réparation cellulaire et tissulaire induite [43]. Dans cet article, les propriétés de dégradation des échafaudages nanofibres ont été évaluées en utilisant une méthode de perte de masse, comme montré Fig. 8. La perte de masse de tous les échantillons a augmenté à 7, 14 et 21 jours, et les taux de perte de masse des nanofibres PLA étaient de 4,34 ± 0,41 %, 7,84 ± 1,57 % et 12,65 ± 0,83 %, respectivement. Pendant ce temps, la perte de masse des nanofibres composites PANI/PLA-PA augmentait progressivement suite à la polymérisation oxydative in situ, avec des taux de perte de masse de 31 ± 2,15 %, 34 ± 1,86 % et 40 ± 2,54 % à 7, 14 et 21 jours, respectivement, qui étaient significativement plus élevés que ceux des nanofibres PANI/PLA-HA et PANI/PLA-SA. Dans le processus de polymérisation oxydative in situ du PANI, la présence de l'oxydant APS aurait pu détruire la liaison ester dans le PLA et induire une réaction d'hydrolyse, résultant en des microfissures dans les nanofibres PLA. Avec la prolongation du temps d'immersion dans le PBS, les microfissures s'accumulaient progressivement et la matrice PLA commençait à se dégrader progressivement. Le PANI chargé en surface tombait également, résultant en un taux de perte de qualité des nanofibres. Avec l'augmentation du temps, le rapport de perte de masse devenait plus clair. Ici, la forte oxydation de HClO₄ aggravait la dégradation du PLA et accélérait la perte de masse des nanofibres PANI/PLA-PA, ce qui est cohérent avec les propriétés mécaniques présentées Fig. 2.

Propriétés de dégradation du PLA et nanofibres PANI/PLA

La biocompatibilité des échafaudages bioactifs est la base pour favoriser l'adhésion, la croissance et la prolifération cellulaire [44]. Ici, nous avons étudié la prolifération cellulaire des HOS sur les nanofibres PLA et PANI/PLA composites pour illustrer l'adhésion et la biocompatibilité associées. Pendant le traitement chimique et la fonctionnalisation [45], un certain nombre de facteurs d'influence potentiels pourraient entrer en jeu dans la préparation d'échafaudages bioactifs. Par conséquent, l'investigation de leur biocompatibilité est essentielle pour évaluer leur application pratique.

Pour étudier la biocompatibilité des nanofibres composites PANI/PLA, leur viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant une méthode MTT. La Figure 9 montre l'activité cellulaire incubée sur les nanofibres PLA et PANI/PLA composites après 1, 3 et 5 jours. La figure montre clairement qu'avec la prolongation du temps d'incubation, l'activité cellulaire des nanofibres augmentait progressivement ; les cellules PANI/PLA-PA présentaient la meilleure activité, et l'activité cellulaire après une culture de cinq jours était la plus élevée.

Viabilité cellulaire HOS cultivées pendant 1, 3 et 5 jours sur nanofibres PLA et nanofibres composites PANI/PLA (*p < 0,05 ; **p < 0,005)

Le PLA est biodégradable, mais hydrophobe, ce qui signifie qu'il n'est pas propice à l'adhésion, la croissance et la prolifération cellulaire. Suite au traitement plasma, la surface des nanofibres composites PANI/PLA était chargée de groupes contenant de l'oxygène, et la surface fonctionnelle démontrait une bonne hydrophilie. Les résultats de morphologie et AFM ci-dessus indiquent que le PANI dopé avec différents acides inorganiques exhibait différentes morphologies et niveaux de rugosité sur la surface des nanofibres PLA. Pendant ce temps, les nanofibres composites PANI/PLA exhibaient une excellente mouillabilité. Par conséquent, nous avons considéré que les différentes morphologies du PANI dopé avec des acides inorganiques conduisaient à l'amélioration de l'énergie de surface et de la polarité des nanofibres composites PANI/PLA, ce qui affectait par conséquent la croissance, la migration et la prolifération cellulaire, résultant en une performance améliorée en termes d'activité cellulaire [46].

Pour étudier davantage le comportement cellulaire des nanofibres composites PANI/PLA, la croissance et l'adhésion sur les nanofibres ont été observées via l'immunomarquage fluorescent (Fig. 10) et MEB (Fig. 11). Ici, nous avons comparé l'actine et la morphologie cellulaire sur la surface de différentes nanofibres. Lorsque les cellules poussaient sur les fibres PLA et les nanofibres PANI/PLA, les faisceaux d'actine démontraient un bon état d'étirement. Pendant ce temps, la densité cellulaire des nanofibres composites PANI/PLA était plus élevée que celle des nanofibres PLA du groupe témoin, avec la densité de croissance cellulaire suivant l'ordre PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA. Les cellules HOS poussaient sur les nanofibres PANI/PLA et adhéraient sous une forme plate multipolaire. Clairement, de nombreuses cellules étaient incrustées dans les pores des fibres PANI/PLA mais étaient mal étirées sur les nanofibres PLA et ne pouvaient pas être pleinement étendues. Ces résultats indiquent que les nanofibres composites PANI/PLA pouvaient favoriser l'adhésion et la prolifération des cellules HOS.

Images micrographiques de fluorescence sur a nanofibres PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA et d nanofibres composites PANI/PLA-PA après incubation de 24 h

Micrographies MEB de HOS ensemencées sur a nanofibres PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA et d nanofibres composites PANI/PLA-PA après 24 h

Pendant ce temps, les résultats de coloration immunofluorescente cellulaire et d'adhésion cellulaire indiquaient que les différentes morphologies de PANI sur la surface des nanofibres composites PANI/PLA affectaient la croissance, l'adhésion et la prolifération des cellules HOS, ce qui était cohérent avec les résultats ci-dessus.

En tant que marqueur ostéogénique précoce, le test ALP a été réalisé sur les échafaudages de nanofibres PLA et PANI/PLA composites pendant 7 jours. Comparé aux nanofibres PLA pures, le résultat (Fig. 12) a montré que l'activité ALP était significativement améliorée dans les nanofibres composites PANI/PLA. Évidemment, l'activité ALP des nanofibres composites PANI/PLA-PA est la meilleure. Ces résultats ont prouvé que les nanofibres composites PANI/PLA exhibaient une meilleure biocompatibilité, ce qui est cohérent avec les résultats ci-dessus d'adhésion cellulaire, croissance et prolifération.

Activité de la phosphatase alcaline sur les échafaudages nanofibres composites PANI/PLA (ns = non significatif)

Conclusions

Dans cet article, des nanofibres composites PANI/PLA de différentes morphologies de surface ont été préparées par trois types d'acide inorganique comme dopant dans la polymérisation in situ. Nous avons confirmé que le PANI pouvait être chargé avec succès sur la surface du PLA sans changer la structure poreuse des nanofibres. Les expériences de propriétés mécaniques et de dégradation in vitro ont démontré que les acides oxydants peuvent affaiblir significativement les propriétés mécaniques et accélérer la dégradation des nanofibres polyester. Pendant ce temps, une surface plus rugueuse a entraîné une meilleure mouillabilité et a favorisé l'adhésion, la croissance et la prolifération des cellules, ce qui indiquait une meilleure biocompatibilité. En conclusion, la morphologie de PANI régulée via différents dopages acides a un effet positif sur la biocompatibilité en ingénierie tissulaire.

Disponibilité des données et matériaux

Les auteurs déclarent que les matériaux et données sont rapidement disponibles pour les lecteurs sans qualifications indues pour les accords de transfert de matériel. Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article.

Abréviations

PANI :

Polyaniline

PLA :

Acide polylactique

MEC :

Matrice extracellulaire

PPy :

Polypyrrole

PTH :

Polythiophène

AN :

Aniline

DCM :

Dichlorométhane

DMF :

N,N-Diméthylformamide

APS :

Persulfate d'ammonium

HOS :

Cellules d'ostéosarcome humain

DMEM :

Milieu Dulbecco modifié Eagle

PBS :

Solution saline tamponnée phosphate

MTT :

3–2,5-Diphényl-2-H-tétrazolium bromide

FITC :

Fluorescéine isothiocyanate

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

MEB-FEC :

Microscopie électronique à balayage à émission de champ

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

ALP :

Phosphatase alcaline