Biosenseur électrochimique ADN ultra-sensible pour détection de Vibrio cholerae utilisant nanoparticules polystyrène-acide acrylique et nanoparticules d'or

Résumé

Nous rapportons un biosenseur électrochimique ADN hautement sensible pour la détection de l'ADN de Vibrio cholerae. Le capteur utilise des nanosphères latex de copolymère styrène-acide acrylique (PSA) chargées avec des nanoparticules d'or (AuNP) comme matrice porteuse d'ADN. La voltampérométrie de pouls différentiel (DPV) avec une étiquette oligonucléotide à base d'anthraquinone mesure le signal d'hybridation. Les AuNP amplifient significativement le courant faradique, produisant une réponse linéaire reproductible de 1,0×10⁻²¹ à 1,0×10⁻⁸ M (RSD = 4,5 %, n = 5) et une limite de détection (LOD) de 1,0×10⁻²¹ M (R² = 0,99). La récupération dans des échantillons dopés variait de 91 % à 109 % (n = 3). Le capteur conserve 95 % de sa réponse originale après 58 jours et peut être réutilisé six fois avec un RSD de 5 % (n = 5).

Contexte

Vibrio cholerae reste une menace sanitaire mondiale, particulièrement dans les contextes à faibles ressources. Les méthodes traditionnelles basées sur la culture sont lentes et laborieuses, tandis que la PCR nécessite un équipement coûteux et des opérateurs qualifiés. Des diagnostics rapides, peu coûteux et hautement sensibles sont essentiels pour le contrôle opportun des épidémies. Les biosenseurs électrochimiques ADN offrent haute sensibilité, spécificité et potentiel de miniaturisation, les rendant idéaux pour les tests au point de soin.

Méthodes

Réactifs chimiques

Polystyrène, acide acrylique, HAuCl₄·3H₂O, citrate de trisodium et autres réactifs provenaient de Fluka, Sigma-Aldrich et Riedel-De Haën. Oligonucléotides cible, mismatch et rapporteur étaient synthétisés par Bio Service Unit (NSTDA) et Bioneer.

Appareillage

Les mesures DPV étaient effectuées sur une électrode sérigraphiée au carbone (SPE) avec une référence Ag/AgCl et électrode contre platine, utilisant un potentiostat Autolab PGSTAT12. Paramètres électrochimiques : pas 0,02 V, balayage 0,5 V s⁻¹, tampon phosphate 0,05 M, pH 7.

Synthèse des AuNP et particules latex PSA

Les AuNP étaient préparés par réduction au citrate (méthode Turkevich). Les sphères latex PSA étaient synthétisées par copolymérisation en émulsion sans savon de styrène et acide acrylique, produisant des particules sub-microniques (~186 nm) avec groupes carboxyl abondants pour l'attachement d'ADN.

Modification d'électrode et immobilisation d'ADN

Les particules PSA étaient déposées par goutte sur la SPE, suivies du dépôt d'AuNP. Le couplage EDC/NHS dans un tampon pH 5 activait les groupes carboxyl, puis une sonde de capture 5 µM était immobilisée. L'hybridation avec 1 µM ADN cible et une étiquette anthraquinone 5 mM (AQMS) procédait en deux étapes : capture-cible et liaison rapporteur, chacune 1 h.

Optimisation

Le chargement de sonde (1–6 µM) et la concentration AQMS (0,1–5 mM) étaient optimisés ; 4 µM sonde et 1 mM AQMS donnaient la réponse maximale. pH 7, tampon phosphate 0,05 M et 2,0 M NaCl fournissaient les conditions ioniques optimales. Temps d'hybridation de 60 min et temps d'immobilisation de sonde de 8 h étaient sélectionnés.

Évaluation de performance

Le capteur démontrait une gamme linéaire de 1,0×10⁻²¹ à 1,0×10⁻⁸ M avec LOD de 1,0×10⁻²¹ M. Les tests de récupération dans échantillons dopés (1,0×10⁻⁴ à 1,0×10⁻⁶ µg µL⁻¹) donnaient 91,4 %–108,9 % (n = 3). Les études de durée de vie montraient 95 % d'activité après 58 jours ; le capteur pouvait être régénéré avec 0,1 M NaOH et réutilisé six fois avec 5 % RSD.

Résultats et discussion

Le MEB confirmait des sphères PSA uniformes (~186 nm). L'analyse DPV montrait que le chargement AuNP réduisait la séparation de potentiel de pic (ΔE_p), indiquant un transfert d'électrons amélioré. Les expériences d'hybridation révélaient une augmentation marquée du courant de pic DPV seulement lorsque les sondes cible et rapporteur étaient présentes, confirmant la spécificité de type sandwich. Le chargement optimal de sonde et concentration AQMS étaient identifiés ; des densités de sonde plus élevées menaient à un plateau de réponse, tandis qu'un AQMS excessif causait du bruit de fond. Le pH 7, ions Na⁺ et force ionique élevée (2,0 M NaCl) maximisaient l'efficacité d'hybridation.

La courbe d'étalonnage exhibait une excellente linéarité (R² = 0,99). La LOD sub-zeptomolaire du capteur surpasse les systèmes PSA-basés ou avidine-biotine précédemment rapportés, tout en maintenant un temps d'analyse rapide (~60 min). Les tests de stabilité démontraient une perte de signal minimale sur 58 jours, et les protocoles de régénération restauraient l'activité complète pour jusqu'à six cycles.

Conclusions

Nous avons développé un biosenseur électrochimique ADN robuste, sans amplification, qui détecte l'ADN de V. cholerae à des concentrations sub-zeptomolaires avec haute spécificité et reproductibilité. Sa fabrication simple, temps d'analyse rapide et longue durée de vie le rendent approprié pour le déploiement sur le terrain dans les contextes d'épidémie.