GoldMag : revêtement PSS-MA améliore la stabilité et la précision optique pour la détection de protéines

Résumé

Les nanoparticules magnétiques dorées (GoldMag) ont attiré une grande attention en raison de leurs performances physiques et chimiques uniques combinant celles des nanoparticules individuelles de Fe₃O₄ et Au. Le revêtement de GoldMag avec des polymères non seulement augmente la stabilité des particules composites en suspension dans le tampon mais joue aussi un rôle clé pour établir des tests optiques de point-of-care pour des biomolécules cliniquement pertinentes. Dans cet article, le poly(acide 4-styrènesulfonique-co-maleique) (PSS-MA), un polyélectrolyte chargé négativement avec des groupes anioniques sulfonate et carboxylate, a été utilisé pour recouvrir la surface de GoldMag chargé positivement (30 nm). Le complexe GoldMag revêtu de PSS-MA a un pic d'adsorption de résonance plasmonique stable à 544 nm. Un couple d'anticorps anti-D-dimère a été couplé sur la surface de cette nanoparticule composite GoldMag, et une protéine cible, le D-dimère, a été détectée dans la gamme de 0,3–6 µg/mL. Le décalage du pic caractéristique, causé par l'assemblage de GoldMag dû à la formation de ponts sandwich D-dimère-anticorps, a permis la détection.

Contexte

En tirant parti d'une propriété de magnétisation spécifique, à savoir le superparamagnétisme, les nanoparticules magnétiques ont été largement étudiées pour des applications biomédicales, telles que l'administration de médicaments/gènes, l'imagerie par résonance magnétique et les essais biologiques. Les nanoparticules magnétiques dorées (GoldMag), composées de Fe₃O₄/Au, non seulement ont les propriétés physico-chimiques des nanoparticules d'oxyde de fer mais présentent aussi les caractéristiques des nanoparticules d'or telles que la fonctionnalisation de surface aisée et des propriétés optiques uniques. Ces caractéristiques distinctives ont attiré une grande attention dans le domaine de la biologie, en particulier dans la détection de biomolécules basée sur les propriétés optiques. Par exemple, Wang et al. ont utilisé des tiges Fe₃O₄-Au comme sondes optiques pour la détection multiplexe de pathogènes. Cependant, comme pour d'autres nanoparticules, l'énergie de surface élevée force les particules GoldMag à s'approcher les unes des autres pour former des agrégats dans la solution tampon. Cela limite grandement leur application pour la détection optique dans le domaine biomédical. Il est donc crucial de prévenir l'agrégation de GoldMag et d'assurer une solution colloïdale stable. La personnalisation de GoldMag pour la détection de molécules cibles basée sur le revêtement avec des polymères a une grande utilité. Il a été rapporté que la dispersité de GoldMag peut être améliorée par modification de surface avec divers composés macromoléculaires organiques, tels que l'acide 11-mercaptoundécanoïque (MUA), le polystyrènesulfonate (PSS) et le polyéthylèneimine (PEI). Le MUA a été apporté sur la surface de GoldMag en utilisant la stratégie d'échange de ligand. Il a amélioré la stabilité des solutions colloïdales GoldMag par modification de surface avec MUA. Ces MUA-GoldMag ont été utilisés dans la détection de protéines basée sur les propriétés optiques. Cependant, la chaîne de MUA était trop courte pour fournir assez d'encombrement stérique pour assurer une dispersité suffisante des particules. De plus, la faible densité de groupes carboxyle dans le MUA limite la quantité de protéine qui peut être absorbée sur le GoldMag. Ces inconvénients restreignent l'application des particules MUA dans les instruments optiques et limitent la sensibilité requise pour la détection de biomarqueurs.

Le poly(acide 4-styrènesulfonique-co-maleique) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20 000), un copolymère par blocs, est obtenu par liaison covalente de PSS et d'acide polymaleique et contient à la fois des groupes sulfonate et carboxylate. La répulsion électrostatique fournie par le grand nombre de groupes carboxyle et sulfonate, ainsi que l'encombrement stérique provenant de la longue chaîne polymère de PSS-MA rendent ce polymère très utile pour maintenir la stabilité des nanoparticules. En fait, PSS-MA a été utilisé comme stabilisateur dans la préparation de nanoparticules, tels que les nanomatériaux d'oxyde de fer, les nanostructures bimetalliques Pd et Ag-Au. Johnston et al. ont rapporté que les nanoclusters d'oxyde de fer revêtus de copolymère assurent un degré plus élevé de stabilisation électrostérique que les nanoclusters d'oxyde de fer revêtus de polymère macromoléculaire unique. En outre, le grand nombre de groupes carboxyle dans le moiety d'acide polymaleique de PSS-MA permet la modification chimique avec des biomolécules pour applications biomédicales.

Les D-dimères sont des produits finaux stables de la dégradation de la fibrine réticulée, résultant d'une formation accrue de fibrine et de fibrinolyse. La détermination du niveau de D-dimère dans le sang est largement utilisée dans le diagnostic d'événements thromboemboliques et d'infarctus du myocarde. Ici, nous avons utilisé le D-dimère comme modèle pour évaluer le potentiel d'utilisation de PSS-MA-GoldMag pour la détection optique de protéines spécifiques. Nous avons utilisé un couple d'anticorps anti-D-dimère pour l'immobilisation sur PSS-MA-GoldMag afin de former des sondes pour la détection de D-dimère par immunoessai sandwich à double anticorps.

Ainsi, dans la présente étude, PSS-MA a été utilisé pour la modification de surface de GoldMag. Cela a non seulement amélioré la stabilité des nanoparticules magnétiques mais aussi médiatisé la conjugaison entre nanoparticules et anticorps pour la détection de D-dimère.

Méthodes

Matériaux et réactifs

GoldMag (5 mg/mL) étaient fournis par Xi'an GoldMag Nanobiotech Co., Ltd. (Xi'an, Chine). Acide borique, borax, bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), Poly(acide 4-styrènesulfonique-co-maleique) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20 000) ont été achetés chez Sigma-Aldrich, USA. Un couple d'anticorps monoclonaux anti-D-dimère (anticorps 1 : M-2.1.16 ; anticorps 2 : M-1.2.57) ont été achetés chez Roche. Le D-dimère a été acheté chez Meridian Chemicals, USA.

GoldMag modifié en surface avec PSS-MA

Les GoldMag ont été synthétisés comme décrit précédemment. 13,3 mL de CTAB (50 mmol/L) ont été ajoutés à 13,3 mL de GoldMag (environ 3 mg/mL). Le mélange a été agité mécaniquement (200 tr/min) combiné avec ultrasons (SB-5200DTD, Chine) pendant 30 min suivi d'une agitation supplémentaire sans ultrasons pendant 30 min. Les particules ont été lavées abondamment à l'eau déionisée. Les CTAB-GoldMag ont été redispersés dans 10 mL d'eau déionisée et 16 mL de solution PSS-MA à 25 % (p/p) ont été ajoutés suivis d'agitation (180 tr/min) pendant 90 min. Les particules modifiées ont été lavées deux fois à l'eau déionisée et dispersées dans l'eau déionisée.

Caractérisation

Les PSS-MA-GoldMag ont été observés au microscope électronique en transmission (MET, Hitachi H-600, Hitachi Corporation, Japon). La distribution de taille a été analysée par DLS (zeta-sizer, Malvern Instruments, UK). La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR, Thermo Nicolet 5700, Thermo Nicolet Corporation, USA) a été utilisée pour caractériser les groupes fonctionnels des PSS-MA-GoldMag. Un analyseur thermogravimétrique Metter Toledo SDTA 851e (TGA) a été utilisé pour analyser la proportion de coquille polymère de surface parmi les PSS-MA-GoldMag. Le spectre de résonance plasmonique de surface (SPR) de GoldMag a été enregistré en utilisant un spectrophotomètre UV-2550 (Shimadzu, Japon) dans la gamme de longueurs d'onde 450–700 nm.

Préparation de la sonde anticorps anti-D-dimère-PSS-MA-GoldMag

Un milligramme de GoldMag a été suspendu dans 1 mL de tampon borax/borate (0,02 M, pH 7,4), contenant 75 mg/mL de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC). Ensuite, 100 µg d'anticorps anti-D-dimère a été ajouté à la suspension suivi d'ultrasons pendant 1 h. Trois millilitres de tampon de blocage (0,02 M tampon borax/borate, pH 7,4, contenant 5 % BSA) ont été ajoutés au mélange et incubés pendant 1,5 h. Après séparation sous un champ magnétique externe, le composite anticorps anti-D-dimère-PSS-MA-GoldMag a été conservé dans le tampon borax/borate sous 4 °C. La conjugaison de l'anticorps anti-D-dimère sur la surface PSS-MA-GoldMag a été confirmée par spectroscopie SPR et mesure de diffusion dynamique de la lumière (DLS).

La solution de D-dimère a été préparée en diluant une solution mère de D-dimère (40 mg/mL) avec du sérum de veau. Trois concentrations de D-dimère (0,6, 2 et 6 µg/mL) ont été utilisées pour optimiser le temps de réaction entre le D-dimère et le complexe anticorps anti-D-dimère-PSS-MA-GoldMag. Dix microlitres d'anticorps anti-D-dimère-PSS-MA-GoldMag (0,3 mg/mL) ont été mélangés avec 80 µL de solution de D-dimère (0,6, 2 et 6 µg/mL), et le mélange a été incubé à 25 °C pendant 10, 20, 30 et 40 min. La longueur d'onde du pic SPR du composite PSS-MA-GoldMag a été lue en utilisant un spectrophotomètre UV-2550.

Des solutions de D-dimère avec des concentrations de 6, 3, 1,5, 0,75 et 0,3 µg/mL ont été préparées pour analyser la relation entre la concentration de D-dimère et le changement du spectre SPR. Dix microlitres d'anticorps anti-D-dimère-PSS-MA-GoldMag (0,3 mg/mL) ont été mélangés avec 80 µL de solution de D-dimère (6, 3, 1,5, 0,75 et 0,3 µg/mL) et le mélange a été incubé à 25 °C pendant 30 min. La longueur d'onde du pic SPR du PSS-MA-GoldMag a été lue en utilisant un spectrophotomètre UV-2550.

Afin d'évaluer si les triglycérides, la bilirubine et l'hémoglobine peuvent interférer avec notre système de détection de protéines, des solutions de D-dimère (0 et 3 µg/mL) ont été préparées et 22 mg/mL triglycérides, 0,2 mg/mL bilirubine et 2 mg/mL échantillons d'hémoglobine ont été ajoutés séparément. Dix microlitres d'anticorps anti-D-dimère-PSS-MA-GoldMag ont été ajoutés aux mélanges ci-dessus, et la longueur d'onde du pic SPR du composite PSS-MA-GoldMag a été lue en utilisant un spectrophotomètre UV-2550.

Résultats et discussion

Le Schéma 1 illustre les procédures développées pour la modification de surface et la fonctionnalisation des particules pour la détection colorimétrique de protéines. Afin d'étudier l'adsorption et l'incorporation de PSS-MA sur les structures PSS-MA-GoldMag, des analyses spectroscopiques FTIR, spectroscopie SPR et TGA ont été effectuées. La Figure 1a montre le spectre FTIR pour PSS-MA pur, PSS-MA-GoldMag et GoldMag, respectivement. La bande large et forte à 3000–3700 cm⁻¹ correspond à l'étirement des groupes –CO–OH et des groupes hydroxyle de –SO₂–OH dans les chaînes polymères. Les vibrations symétriques des groupes sulfonate : (SO₃⁻) étaient à 1037 et 1126 cm⁻¹ et les vibrations d'étirement de C=C du benzène à 1403 et 1637 cm⁻¹. Ces bandes d'absorption caractéristiques de PSS-MA ont été observées dans PSS-MA-GoldMag démontrant que les particules brutes ont été revêtues avec succès de PSS-MA. Le changement de groupes chimiques de surface de GoldMag a été confirmé par un décalage vers le bleu net de 11 nm de 555 à 544 nm dans la bande SPR après modification (Fig. 1b). La position et la largeur du pic SPR étaient liées à la surface, l'environnement et la dispersité des nanoparticules. L'analyse TGA indiquait que le rapport de poids de matériau organique à GoldMag était près de 1:4 (Fig. 1c). À basse température, la perte de poids peut être attribuée à la déshydratation ; quand la température monte, la perte de poids peut être attribuée à la décomposition oxydative des molécules organiques sur la surface des particules modifiées. Pendant la modification, les CTAB-GoldMag étaient chargés positivement (+12,2 mV) et la surface des particules est devenue chargée négativement (−24,5 mV) après le revêtement PSS-MA sur la surface des particules (Fig. 1d). Tous les résultats ci-dessus montrent que PSS-MA est adhérent avec succès sur la surface des nanoparticules.

Les micrographies (Fig. 2a, b) des GoldMag et PSS-MA-GoldMag obtenues par MET montrent que ces particules étaient monodisperses après modification. La couche de polymère sur la surface des particules est clairement visible sous l'image microscopique électronique à haute résolution indiquant davantage que le revêtement de polymère sur GoldMag a réussi (Fig. 2b). La Figure 2c montre que le diamètre moyen de PSS-MA-GoldMag est de 116 nm. La suspension PSS-MA-GoldMag a une couleur vin rouge ce qui indique une bonne stabilité des nanoparticules (1 an dans l'eau).

La stabilité des caractéristiques optiques de GoldMag et PSS-MA-GoldMag dans des solutions tampon avec différentes valeurs de pH a été analysée par spectroscopie SPR. Comme montré Fig. 3a, le pic caractéristique SPR était décalé vers des longueurs d'onde plus longues de 555 nm quand GoldMag étaient suspendus dans un tampon borax/borate avec un pH de 6,0 à 9,0. La composition de la solution tampon influence aussi la stabilité de la suspension GoldMag. La position du pic caractéristique SPR était déplacée vers des longueurs d'onde plus élevées (558 nm) quand GoldMag étaient suspendus dans un tampon PB (pH 7,4), un tampon borax/borate (pH 7,4) et une solution NaCl (10 mM) comparé à ceux dans l'eau déionisée (550 nm) (Fig. 3c). Cependant, le pic SPR caractéristique (545 ± 2 nm) ne changeait pas significativement quand PSS-MA-GoldMag étaient dispersés dans une solution électrolytique ou dans un tampon avec différentes valeurs de pH (Fig. 3b, d). Xia et al. et Storhoff et al. ont aussi rapporté que l'agrégation de nanoparticules peut faire décaler le spectre SPR vers des longueurs d'onde plus longues. Le potentiel zêta de GoldMag et PSS-MA-GoldMag a aussi été mesuré (Fig. 3e, f). Il a été rapporté qu'un faible potentiel zêta (moins de ±30 mV) mènera à l'agrégation des particules. Quand GoldMag étaient suspendus dans un tampon PB (pH 7,4), un tampon borax/borate (pH 7,4) et une solution NaCl (10 mM), le potentiel zêta de GoldMag était −16,7 ± 1,1 mV, −14,3 ± 2,1 mV et −8,9 ± 1,5 mV, respectivement. Le potentiel zêta de GoldMag était −14,2 ± 1,7 mV, −17 ± 1,1 mV, 13,9 ± 1,7 mV et −18,1 ± 1,6 mV quand les particules étaient suspendues dans un tampon borax/borate avec pH de 6,0 à 9,0. Cependant, l'adhérence de PSS-MA à GoldMag diminue dramatiquement son potentiel zêta dans différentes solutions électrolytiques, ainsi qu'à différentes valeurs de pH. Dans tous les cas, le potentiel zêta était inférieur à −30 mV. Ces résultats indiquent que la modification de surface de GoldMag avec PSS-MA améliore significativement sa résistance aux changements de composition et de valeurs de pH des solutions tampon et assure un haut niveau de dispersité.

Pour investiguer l'interaction entre protéine et PSS-MA-GoldMag, des anticorps anti-D-dimère ont été conjugués avec PSS-MA-GoldMag par la réaction entre groupes amino de protéine et groupes carboxyle du polymère médiatisée par EDC. Comme montré Fig. 4a, un décalage vers le rouge du pic SPR a été observé après la réaction de PSS-MA-GoldMag avec les anticorps anti-D-dimère, ce qui indique la conjugaison d'anticorps sur les nanoparticules. L'augmentation du diamètre moyen des particules de 116 à 130 nm confirme l'introduction de l'anticorps anti-D-dimère au PSS-MA-GoldMag (Fig. 4b). L'influence de la masse d'anticorps sur la propriété optique de PSS-MA-GoldMag a été évaluée par spectroscopie SPR après ajout de différentes quantités d'anticorps anti-D-dimère (de 20 à 200 µg) à la suspension PSS-MA-GoldMag. Comme montré Fig. 4c, le pic SPR n'a pas changé et est resté à 548 ± 3,0 nm, indépendant de la quantité d'anticorps ajoutée.

Afin d'évaluer l'activité des anticorps après conjugaison sur le PSS-MA-GoldMag, la sonde A et la sonde B ont été préparées en immobilisant un couple d'anticorps (anticorps 1 et anticorps 2), et anticorps 1 sur PSS-MA-GoldMag, respectivement. L'interaction entre les deux types de sonde et le D-dimère a été analysée par spectroscopie SPR. Le meilleur temps de réaction a été obtenu en observant le changement du maximum du pic SPR pendant 40 min après ajout de trois concentrations de D-dimère (0,6, 2 et 6 µg/mL) à la sonde A. Comme montré Fig. 5a, un décalage significatif dans la bande de plasmon de surface a été observé résultant de l'agrégation de PSS-MA-GoldMag par ponts croisés entre pont sandwich antigène-anticorps au fil du temps. À faible concentration (0,6 µg/mL), il n'y avait pas de changement significatif sur le spectre SPR de 20 à 40 min, indiquant que 20 min est suffisant pour la réaction de 0,6 µg/mL ou concentrations inférieures de D-dimère. Cependant, en utilisant des concentrations moyennes et élevées de D-dimère (2 et 6 µg/mL), la longueur d'onde continuait d'augmenter pendant 30 min. Cela indique que le meilleur temps de réaction est 30 min. Comme montré Fig. 5b, le spectre SPR des particules composites a révélé un décalage vers le rouge distinct dans la résonance plasmonique de surface de λ_max = 550 à 570 nm et une diminution d'intensité du pic caractéristique à mesure que la concentration de D-dimère augmentait de 0,3 à 6 µg/mL. Cela est provoqué par l'agrégation de PSS-MA-GoldMag causée par la connexion croisée de D-dimère avec anticorps 1 et anticorps 2 sur la sonde A. L'agrégation de PSS-MA-GoldMag a résulté en un changement des propriétés optiques de la partie or de PSS-MA-GoldMag. Jiang et al. et Li et al. ont aussi rapporté que l'agrégation de nano-or peut faire décaler le spectre SPR des nanoparticules vers le rouge et l'élargir. Cependant, aucun décalage vers le rouge n'a été observé en Fig. 5d car l'interaction entre D-dimère et anticorps 1 n'était pas capable de mener à l'assemblage des nanoparticules. De plus, un décalage vers le rouge distinct (5 nm) a été observé même quand la quantité de D-dimère ajoutée à la sonde A était aussi basse que 0,3 µg/mL, ce qui indique que la limite de détection est en dessous des valeurs de coupure diagnostiques (0,5 µg/mL) pour ce biomarqueur. Une relation linéaire entre la position du pic spectral SPR et la concentration de D-dimère a été trouvée dans la gamme de 0,3–6 µg/mL (r² = 0,9944) (Fig. 5c).

Comme montré Fig. 6, aucun décalage significatif n'a été trouvé du pic caractéristique SPR de PSS-MA-GoldMag en présence de triglycérides, bilirubine et hémoglobine, respectivement. Ce résultat indique que notre système de détection de protéines n'a pas de réactions interférentes avec les triglycérides, la bilirubine et l'hémoglobine.

Ces résultats montrent que PSS-MA-GoldMag est une nanoparticule magnétique prometteuse pour l'immobilisation de protéines et peut former un pont sandwich sur la surface de la particule via anticorps 1-protéine cible-anticorps 2. Cela fait de PSS-MA-GoldMag un matériau précieux pour l'utilisation dans la détection optique de point-of-care de biomarqueurs basée sur des immunoessais.

Dans cette étude, PSS-MA a été utilisé pour la première fois pour la modification de GoldMag (Schéma 1). L'introduction de PSS-MA à la surface de GoldMag a significativement amélioré sa stabilité en solution tampon. En plus de l'encombrement stérique causé par la longue chaîne polymère de PSS-MA, les groupes carboxyle et sulfo dans PSS-MA causent une répulsion électrostatique entre les nanoparticules. Cela améliore significativement la stabilité de PSS-MA-GoldMag. Le grand nombre de groupes carboxyle sur la surface des particules répond à l'exigence pour la conjugaison avec des biomolécules.

Conclusions

Dans la présente étude, une méthode facile et rapide pour le revêtement de GoldMag avec PSS-MA a été rapportée. Les résultats montrent que la stabilité colloïdale et la dispersité de GoldMag étaient significativement améliorées par l'introduction de PSS-MA. Les particules présentent une bonne stabilité dans la solution tampon avec une large gamme de pH. De plus, la présence de groupe carboxyle offre l'option de conjuguer des protéines aux nanoparticules. En prenant le D-dimère et son anticorps comme modèle, il a été trouvé que la caractéristique optique peut être adaptée par le réticulation entre antigène et anticorps-nanoparticule composite. Les résultats montrent que le GoldMag modifié PSS-MA peut servir de candidat très prometteur pour la détection optique basée sur des immunoessais.

Abréviations

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

GoldMag :

Nanoparticules magnétiques dorées

MUA :

Acide 11-mercaptoundécanoïque

PEI :

Polyéthylèneimine

PSS :

Polystyrènesulfonate

PSS-MA :

Poly(acide 4-styrènesulfonique-co-maleique)

SPR :

Résonance plasmonique de surface

TEM :

Microscope électronique en transmission

TGA :

Analyseur thermogravimétrique