Nanocomposites de poly(N-isopropylacrylamide) magnétique :effet de la méthode de préparation sur les propriétés antibactériennes

Contexte

Les nanocomposites polymères thermosensibles magnétiques ont été utilisés pour un large éventail d'applications, y compris le traitement de l'eau et la nanomédecine [1,2,3,4]. Chaque nanocomposite est spécifiquement conçu pour bénéficier de la combinaison de caractéristiques inhérentes aux deux composants, c'est-à-dire des particules magnétiques et des polymères sensibles à la température, créant ainsi un nanocomposite plus spécifique et contrôlable. Magnétite (Fe₃ O₄ ) les nanoparticules confèrent des propriétés magnétiques qui permettent une séparation rapide et facile suite à l'application d'un champ magnétique externe [5]. Le poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) forme un hydrogel tridimensionnel qui subit une transition de phase réversible à température de solution critique inférieure (LCST) d'une seule bobine avec un état hydraté gonflé à un état déshydraté effondré et rétréci [6] lorsqu'il est chauffé dans eau au-dessus de 32 °C. Le coiffage des nanoparticules magnétiques avec une couche de PNIPAAm fournit non seulement une stabilité colloïdale dans l'eau, mais permet également une fonctionnalité de surface en se liant à d'autres molécules, telles que des médicaments, des protéines ou des enzymes [7]. La construction de nanocomposites à double réponse est obtenue en combinant deux propriétés qui répondent simultanément à une combinaison de température et de magnétisme. Les méthodes les plus couramment utilisées pour la synthèse de Fe₃ O₄ -Les nanocomposites PNIPAAm sont par addition physique, précipitation in situ et polymérisation en émulsion. L'addition physique, la méthode la plus simple, nécessite le mélange physique de nanoparticules magnétiques préalablement synthétisées et de particules PNIPAAm. La deuxième méthode, la précipitation in situ, implique la précipitation de nanoparticules magnétiques en présence du nanopolymère PNIPAAm [8]. La troisième voie (et la plus courante), la polymérisation en émulsion, nécessite la polymérisation du monomère (N-isopropylacrylamide) en présence de nanoparticules magnétiques [9,10,11]. Fe₃ O₄ -Les nanocomposites PNIPAAm sont largement utilisés dans les applications biomédicales et biotechnologiques. Des nanoparticules magnétiques hautement stables, contrôlées et bien dispersées seront nécessaires afin d'augmenter l'adéquation de ces nanocomposites pour les applications futures. Une innovation récente implique un champ magnétique externe qui crée une source de chaleur locale pour les particules auto-échauffantes, provoquant le rétrécissement du PNIPAAm et permettant à son tour la libération de médicaments encapsulés [12]. Ce phénomène, couplé à des billes magnétiques ciblées sur les tumeurs, ouvre la voie à d'autres thérapies potentielles contre le cancer telles que l'hyperthermie. L'hyperthermie peut être initiée par des nanoparticules oscillantes dans un champ magnétique oscillant à des fréquences allant du kilohertz au mégahertz. Autre Fe₃ O₄ -Des nanocomposites PNIPAAm ont été récemment synthétisés pour contrôler la libération de molécules bioactives, telles que la myoglobine ou la vitamine B12, et pour l'administration de médicaments [13]. Une étude récente utilisant du Fe₃ superparamagnétique recouvert de PNIPAAm O₄ nanoparticules a pu montrer que l'agrégation induite thermiquement de nanoparticules d'oxyde de fer augmente considérablement le contraste T2 lors de l'imagerie par résonance magnétique [14]. Clairement, Fe₃ O₄ -PNIPAAm est très prometteur pour les développements futurs dans les applications biomédicales et biotechnologiques. Par conséquent, il est important que d'autres études soient entreprises sur la biocompatibilité de ce matériau et son effet antibactérien.

Dans cette étude, nous avons étudié l'effet de trois méthodes de préparation sur les propriétés physico-chimiques de Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites. Ce faisant, nous visons à évaluer la méthode de préparation la plus pratique pour produire des nanocomposites présentant des propriétés améliorées pour des applications biologiques. Pour la première fois, nous décrivons également les effets antibactériens des trois Fe₃ O₄ -Nanocomposites PNIPAAm utilisant une approche multicritère, le taux de croissance bactérienne, la viabilité, la morphologie cellulaire et le niveau de dommages à l'ADN.

Méthodes

Produits chimiques

Chlorure de fer(III) hexahydraté (FeCl₃ .6H₂ O, ≥ 98%), Chlorure de fer(II) tétrahydraté (FeCl₂ .4H₂ O, ≥ 99%), hydroxyde d'ammonium (26% NH₃ en H₂ O), N-isopropyl-acrylamide (NiPAM, 99%), N,N-méthylènebis(acrylamide) (BIS, ≥ 99%), sulfate de sodium dodécyl (SDS, ≥ 99%) et persulfate d'ammonium (APS, ≥ 98.5 %) ont tous été achetés frais à Sigma-Aldrich, en Allemagne.

Préparation du PNIPAAm par polymérisation en émulsion

NiPAM (4 g), BIS (0,2 g) et SDS (0,3 g) ont été dissous dans 350 ml d'eau déminéralisée (DI) à 70 °C sous azote atmosphérique. L'APS (0,0035 g) a été dissous dans 1 ml de DI et ajouté au récipient de réaction pour démarrer la réaction. Après 4 h, la réaction a été arrêtée et les particules préparées lavées avec de l'eau DI. Enfin, les nanoparticules de PNIPAAm ont été séparées par centrifugation (12 000 tr/min pendant 30 min) et utilisées dans d'autres réactions.

Préparation de magnétite (Fe₃ O₄ ) Nanoparticules

FeCl₂ ·4H₂ O (1,9 g) et FeCl₃ ·6H₂ O (5,4 g) (rapport molaire 1:2) ont été dissous dans du DI (100 ml) et chauffés à 70 °C. Hydroxyde d'ammonium (NH₄ OH; 6 ml) a été rapidement ajouté à la solution, qui a immédiatement produit un précipité magnétique noir profond. Enfin, le Fe₃ O₄ la suspension de nanoparticules a été agitée pendant 30 min à 70 °C. Le produit a été lavé plusieurs fois avec DI, après quoi le Fe₃ O₄ les nanoparticules ont été séchées dans un évaporateur rotatif (25 mbar à 40 °C) jusqu'à formation d'une fine poudre. Ceci a été utilisé dans toutes les autres réactions.

Préparation de nanocomposite magnétique PNIPAAm par polymérisation en émulsion (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1)

NiPAM (0,4 g), Fe₃ fraîchement préparé O₄ des nanoparticules (0,2 g), du BIS (0,2 g) et du SDS (0,3 g) ont été dissous dans 350 ml de DI et chauffés à 70 °C sous atmosphère d'azote. L'APS (0,0035 g) a ensuite été dissous dans 1 ml de DI et ajouté au récipient de réaction pour démarrer la réaction. Après 4 h, la réaction a été arrêtée et le nanocomposite préparé lavé avec DI. Enfin, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 a été séparé par centrifugation (12 000 tr/min pendant 30 min) puis séché à l'aide d'un évaporateur rotatif (25 mbar à 40 °C). Le matériau en poudre a été stocké dans l'obscurité à température ambiante.

Préparation de nanocomposite magnétique PNIPAAm par précipitation in situ (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2)

FeCl₂ (0,148 g), FeCl₃ (0,4 g) et 10 ml de DI ont été bien mélangés et ajoutés à 1 g de PNIPAAm. NH₄ OH (3 ml) a ensuite été rapidement ajouté à la solution, qui a immédiatement produit un précipité magnétique noir profond. La suspension a ensuite été agitée pendant 30 minutes à 70 °C. Le nanocomposite préparé a été lavé avec DI, après quoi le Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 a été séparé par centrifugation (12 000 tr/min pendant 30 min) et séché à l'aide d'un évaporateur rotatif (25 mbar à 40 °C). La poudre résultante a été stockée dans l'obscurité à température ambiante.

Préparation du nanocomposite magnétique PNIPAAm par addition physique (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3)

PNIPAAm fraîchement préparé (1 g), Fe₃ fraîchement préparé O₄ les nanoparticules (0,5 g) et le DI (5 ml) ont été bien mélangés et la suspension résultante a été agitée pendant 30 min à 70 °C. Le nanocomposite ainsi préparé a été lavé au DI, à la suite de quoi le Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 a été séparé par centrifugation (12 000 tr/min pendant 30 min) et séché à l'aide d'un évaporateur rotatif (25 mbar à 40 °C). Le matériau en poudre a été stocké dans l'obscurité à température ambiante.

Caractérisation des nanocomposites

La taille et le potentiel zêta du Fe₃ O₄ -Les nanocomposites PNIPAAm ont été mesurés après dissolution complète des nanoparticules dans DI (dispersion dans DI suivie d'une sonification pendant 2 min à température ambiante). Les mesures du potentiel Zeta ont été effectuées à l'aide d'un analyseur Zetasizer Nano (Malvern Instruments, États-Unis) à pH 7. Une unité de diffusion dynamique de la lumière (DLS) Zetasizer Nano a été utilisée pour mesurer le diamètre hydrodynamique des agrégats de particules dans DI. Une analyse thermogravimétrique (TGA) a été entreprise afin de quantifier la quantité de revêtement et de déterminer la stabilité thermique du nanocomposite. Des études thermiques ont été entreprises sur 3 à 4 mg d'échantillon sec à des températures allant de 25 à 900 °C, en utilisant un TGA Q500 (TA Instruments, USA) sous atmosphère d'azote (vitesse de chauffage de 10 °C/min). Les propriétés magnétiques du matériau ont été mesurées à l'aide d'un magnétomètre à échantillons vibrants MicroMag™ 2900 (Princeton Measurements Corporation, USA). Des images de microscopie ont été obtenues à l'aide d'un microscope électronique à balayage (MEB), les particules étant d'abord soigneusement dissoutes dans DI et une goutte de la solution déposée sur la grille de cuivre d'un MEB à émission de champ Zeiss ULTRA Plus équipé d'une cathode Schottky. Toutes les images ont été analysées à l'aide du logiciel Smart SEM v 5.05 (Zeiss, Allemagne) pour une imagerie exploitée à 1,5 kV.

Souches et médias bactériens

Escherichia coli à Gram négatif CCM3954 et Staphylococcus aureus Gram positif Le CCM 3953 (Brno, République tchèque) a été utilisé pour toutes les expériences. Des informations détaillées sur les souches sont fournies sur la page Web de la « Czech Collection of Microorganisms » (http://www.sci.muni.cz/ccm/). Chaque culture bactérienne a été fraîchement préparée et maintenue pendant la nuit dans un bouillon nutritif de soja (Sigma-Aldrich) avant de réaliser les expériences biologiques.

Dommages à l'ADN

Les analyses des comètes ont été effectuées selon la méthodologie de Singh et al. [15] et Solanky et al. [16]. Tous les produits chimiques ont été achetés auprès de PENTA (République tchèque), sauf indication contraire. Une culture bactérienne fraîche (ajustée à 10 ⁷ cellules/ml) a été cultivé pendant une nuit puis incubé avec deux concentrations (0,1 et 1 g/l) de PNIPAAm et chacun des Fe₃ O₄ -Nanocomposites PNIPAAm pendant 30 min à 37 °C.

Un microgel a été préparé en mettant 100 ml d'agarose sur la surface dépolie d'une lame et en la recouvrant d'un verre de couverture de 24 × 50 mm (ThermoFisher Scientific, USA). Les lames ont été laissées à température ambiante pendant 5 min, puis les lamelles ont été retirées et les lames ont été laissées à sécher. Cette couche d'agarose séchée (première couche) a fourni une base solide pour les couches suivantes. Après exposition des bactéries au PNIPAAm et Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites pendant 30 min, 2 μl (contenant environ 10 000 cellules exposées) ont été prélevés et mélangés avec 100 μl d'agarose à 0,5 % fraîchement préparé. Ce mélange a été pipeté sur des lames givrées et immédiatement recouvert d'un verre de couverture (deuxième couche). Les lames ont ensuite été refroidies dans un bac en acier sur de la glace. Les verres de couverture ont été retirés après 1 min, et une troisième couche de 100 μl d'agarose de lyse (dont 0,5 % d'agarose avec 5 μg/ml de RNAse A [Ameresco, USA], 0,25% de N-lauroylsarcosine de sodium et 0,5 mg/ml de lysozyme) a été produit, toujours à l'aide d'un couvercle en verre. Les lames ont ensuite été laissées sur de la glace pendant 10 min puis placées dans une chambre humide pendant 30 min à 37 °C. Après avoir retiré le couvercle en verre, les lames ont été immergées dans une solution de lyse contenant 2,5 M de NaCl, 100 mM de sel tétrasodique EDTA, 10 mM de tampon tris à pH 10, 1 % de lauroyl sarcosine de sodium et 1 % de triton X-100. Après 1 h de lyse à température ambiante, les lames ont été transférées dans une solution de digestion enzymatique contenant 2,5 M de NaCl, 10 mM d'EDTA et 10 mM de tris pH 7. Quatre tampons avec 1 mg/ml de protéinase K. Les lames ont ensuite été incubés à 37 °C pendant 2 h, après quoi ils ont été placés sur la plaque horizontale d'une unité d'électrophorèse (Scie-plas, Royaume-Uni) et équilibrés avec 300 mM d'acétate de sodium et 100 mM de tampon tris pH 9 pendant 20 min puis soumis à une électrophorèse à 12 V (0,4 V/cm, environ 100 mA) pendant 30 min. Après l'électrophorèse, les lames ont été immergées dans de l'acétate d'ammonium 1 M dans de l'éthanol (5 ml d'acétate d'ammonium 10 M et 45 ml d'éthanol absolu) pendant 20 min, de l'éthanol absolu pendant 0,5 h et de l'éthanol à 70 % pendant 10 min, après quoi les lames ont été séchés à l'air à température ambiante. Pour obtenir une coloration uniforme, les lames ont été prétraitées avec 50 ml d'une solution fraîchement préparée de tampon TE à 5 % et 10 mM de NaH₂ Bon de commande₄ . Les lames ont ensuite été colorées avec 50 μl d'une solution 1 mM fraîchement préparée de colorant SYBR (Sigma-Aldrich, USA) dans du tampon TE pendant 30 min. La migration des cassures de brins d'ADN (comètes) a été visualisée à l'aide d'un microscope à fluorescence AxioImager à un grossissement × 400 et du logiciel AxioVision v 4 (Zeiss, Allemagne). En règle générale, une longueur de queue de 50 comètes a été mesurée individuellement pour chaque échantillon.

Taux de croissance bactérienne, viabilité cellulaire et morphologie

Le protocole expérimental a suivi celui décrit dans Darwish et al. [17]. En bref, un Fe₃ O₄ -La suspension mère de nanocomposite PNIPAAm (10 g/l) a été ajoutée à une culture bactérienne fraîche afin d'obtenir des concentrations finales de 0,01, 0,05, 0,5 et 1 g/l. Chaque concentration a été produite en triple dans une plaque à 24 puits. Contrôles négatifs, constitués de cellules bactériennes uniquement dans des milieux de croissance et de Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposite uniquement dans des milieux de croissance, ont été exécutés en parallèle. La plaque a ensuite été incubée à 37 °C, après quoi la densité optique de l'échantillon a été mesurée à 600 nm (DO600) toutes les 2 h pendant 6 h à l'aide d'un lecteur de plaque Synergy™ HTX (Biotek, USA). Le taux de croissance bactérienne a été défini comme la régression linéaire R de la mesure de la DO600 (unités d'absorbance, UA) par rapport au temps d'incubation en heures. Des mesures préliminaires d'échantillons de nanocomposites sans cellules (6 h à 600 nm) ont montré des valeurs d'absorbance constantes qui n'interféraient pas avec les valeurs d'absorbance des nanocomposites mesurées avec des cellules bactériennes.

La concentration efficace de nanocomposite à 10% d'inhibition (EC10) sur le taux de croissance bactérienne (µ ) a été calculé pour chaque forme de Fe₃ O₄ -PNIPAAm basé sur l'équation :I (%) =(µ _C −µ _T )/µ _C ×100, où I est l'inhibition, µ _C est la valeur moyenne du taux de croissance du témoin et µ _T est le taux de croissance de la culture affectée par le nanocomposite [18].

Après 24 heures d'incubation, des aliquotes de 100 μl de chaque échantillon ont été colorées à l'aide du kit de viabilité bactérienne L7007 (Molecular Probes, Invitrogen, États-Unis) dans l'obscurité pendant 15 min. La détermination de la proportion de cellules vivantes (Ex/Em 485/528 nm) et mortes (Ex/Em 485/645 nm) a été effectuée à l'aide d'un lecteur de plaques Synergy™ HTX (Biotek, USA). Le pourcentage de cellules mortes a été calculé comme le rapport des cellules mortes aux cellules vivantes. Dans le même temps, des images de E. coli et S. aureus ont été obtenus à l'aide d'un microscope à fluorescence AxioImager (Zeiss, Allemagne) avec Ex/Em 470/490-700 nm. La longueur de E. coli cellules et zone de S. aureus les amas de cellules ont été déterminés à un grossissement × 600 à l'aide du logiciel AxioVision v 4 (Zeiss, Allemagne).

Analyse statistique

Différences entre les souches bactériennes incubées dans le PNIPAM, différentes Fe₃ O₄ -Les nanocomposites PNIPAAm et les échantillons de contrôle sans nanocomposites ont été testés à l'aide de l'ANOVA et du test de Dunnett (GraphPad PRISM, USA).

Résultats

Dans cette étude, nous avons synthétisé Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposite employant trois protocoles différents :polymérisation en émulsion (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1), précipitation in situ (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2) et addition physique (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3). L'imagerie SEM a montré que le type de protocole utilisé avait un effet clair sur la morphologie de l'échantillon et la taille des particules, avec Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 montrant une large distribution de taille, une agglomération due à une énergie de surface élevée entre les nanoparticules et la présence d'interactions magnétiques dipolaires ( Figure 1 ) .

Images au microscope électronique à balayage et histogrammes de PNIPAAm (a ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (b ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (c ) et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (d ). Barre d'échelle = 200 nm

TGA a indiqué que le Fe₃ O₄ -Les échantillons de PNIPAAm sont devenus relativement stables à des températures supérieures à 400 °C (Fig. 2). Dans l'ensemble, les nanoparticules de PNIPAAm ont montré une teneur résiduelle inférieure à celle du Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites. Les valeurs de potentiel zêta pour la charge de surface étaient de − 1,58 mV pour PNIPAAm, − 15,6 mV pour Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, − 16,4 mV pour Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 et − 1,8 mV pour Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. Les valeurs du magnétomètre d'échantillon vibrant pour la saturation de la magnétisation étaient de 50,4 emu/g pour Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, 53,7 emu/g pour Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 et 21,0 emu/g pour Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. La diffusion dynamique de la lumière au-dessus de (45 °C) et en dessous de (25 °C) LCST a indiqué une taille hydrodynamique pour le PNIPAAm de 50 nm à 25 °C et de 27 nm à 45 °C ; 412 nm à 25 °C et 197 nm à 45 °C pour Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 ; 212 nm à 25 °C et 130 nm à 45 °C pour Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 et 122 nm à 25 °C et 60 nm à 45 °C pour Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (Fig. 3).

Analyse thermogravimétrique du PNIPAAm (a), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (b), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (c) et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (d)

Diffusion dynamique de la lumière en dessous de (25 °C) et au-dessus (45 °C) de la transition de phase de température de solution critique inférieure pour PNIPAAm (a ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (b ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (c ) et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (d )

Fe₃ O₄ - Effet nanocomposite du PNIPAAm sur l'ADN bactérien

Après une courte exposition de 30 min, des cassures de brins d'ADN ont été déterminées pour E. coli et S. aureus dans les cellules traitées avec le Fe₃ O₄ -Nanocomposites PNIPAAm, 40% EtOH (contrôle positif) et cellules non traitées (contrôle négatif). Tous les Fe₃ O₄ -Les nanocomposites PNIPAAm ont montré un effet tout aussi significatif (P < 0,001) sur la moyenne E. coli et S. aureus longueur de la queue de la comète à toutes les concentrations (Fig. 4), par rapport aux cellules témoins incubées sans nanocomposites.

Un exemple d'Escherichia coli queue de comète, après traitement avec Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (a ). Résultats des cassures de brins d'ADN (longueur de la queue de la comète) pour Escherichia coli (b ) et Staphylococcus aureus (c ) incubé pendant 30 min avec 40 % EtOH (contrôle positif), sans nanocomposites (contrôle négatif), PNIPAAm (0,1 et 1 g/l) et (1) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 et (3) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (les barres d'erreur représentent SD pour une longueur de comète de 50 cellules). Niveau de signification ***P < 0.001

Fe₃ O₄ - Effet antibactérien nanocomposite PNIPAAm

Les taux de croissance ont indiqué que le S. aureus était moins résistant que Gram-négatif E. coli à tous les nanocomposites après 6 h d'exposition. Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 a tous deux fortement inhibé la croissance bactérienne, par rapport au PNIPAAm et au Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, avec E. coli taux de croissance considérablement réduit de 0,08 à 0,028 (P < 0.001) avec Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 et 0,005 (P < 0.001) avec Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (1 g/l). Aucun effet n'a été observé sur E. coli taux de croissance par PNIPAAm ou Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (Fig. 5a). En comparaison, le taux de croissance de S. aureus a été affecté par tous les Fe₃ O₄ -les nanocomposites PNIPAAm et par les nanoparticules PNIPAAm. À des concentrations plus faibles (0,01 g/l et 0,05 g/l), le taux de croissance n'a été que légèrement réduit de 0,07 à 0,06 (P < 0,05). À des concentrations plus élevées (0,5 et 1 g/l), cependant, il y avait une réduction significative de 0,07 à 0,001 avec PNIPAAm, 0,0 avec Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, 0,01 avec Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 et 0,009 avec Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (tous les P < 0,001 ; Fig. 5b). De plus, l'EC10 pour tous les Fe₃ O₄ -Les nanocomposites PNIPAAm et le contrôle des nanoparticules PNIPAAm étaient plus faibles pour S. aureus que celui de E. coli (Tableau 1).

Taux de croissance relatif de Escherichia coli (un ) et Staphylococcus aureus (b ) après 6 h d'incubation dans différentes concentrations (0,01, 0,05, 0,5 et 1 g/l) de PNIPAAm (cercles rouges), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (losanges orange [1]), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (triangles verts [2]) et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (triangles bleus [3]). Les barres d'erreur montrent SD calculé à partir de n = 3. Niveau de signification ***P < 0.001

Le pourcentage de morts E. coli cellules augmentées avec l'augmentation de la concentration de Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposite après 24 h. Le PNIPAAm (0,5 et 1 g/l), par exemple, a provoqué une augmentation significative de E. coli cellules mortes (20 %) par rapport aux cultures sans Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposite (12%). Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (0,5 g/l) a entraîné jusqu'à 28 % de décès E. coli cellules et 32 % à 1 g/l (P < 0.001). L'effet de Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 était inférieur à celui de Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, le pourcentage de cellules mortes passant de 13 à 25 % lorsqu'ils sont exposés à des concentrations de 0,01 et 1 g/l, respectivement (P < 0.001). À 0,5 et 1 g/l, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 a entraîné environ 25 % de cellules mortes (P < 0,001 ; Fig. 6a). Le pourcentage de morts S. aureus les cellules n'ont été significativement affectées que par 1 g/l de Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, avec des cellules mortes atteignant jusqu'à 50 et 48%, respectivement (P < 0.001). Le contrôle sans nanocomposites contenait environ 18% de cellules mortes tandis qu'à des concentrations plus faibles de PNIPAAm, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, la proportion de cellules mortes était encore plus faible. Le PNIPAAm à des concentrations de 0,5 et 1 g/l a donné 25 et 30 % (P < 0,005) cellules mortes, respectivement. Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 n'a eu aucun effet sur S. aureus cultures (Fig. 6b).

Pourcentage d'Escherichia coli morts (un ) et Staphylococcus aureus (b ) cellules après 24 h d'exposition au PNIPAAm et (1) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 et (3) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. Les barres d'erreur affichent SD de n = 3. Niveaux de signification *P < 0,05, **P < 0.005, ****P < 0.001

Il n'y avait pas de différence dans la moyenne E. coli longueur de cellule (5 μm) et moyenne S. aureus zone d'amas de cellules (200 μm ² ) pour tout nanocomposite ou le contrôle PNIPAAm aux concentrations les plus faibles (0,1 g/l ; Fig. 7). À des concentrations plus élevées, E. coli la longueur n'a pas changé en présence de Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2, et S. aureus zone de groupe cellulaire en présence de Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1. Cependant, E. coli la longueur était significativement augmentée en présence de 1 g/l de PNIPAAm (5,4 μm, P < 0.005), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (6 μm, P < 0.001) et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (10 μm, P < 0.001) (Fig. 7a), tandis que S. aureus forment des amas plus importants lorsqu'ils sont exposés au PNIPAAm (1937 μm ² , P < 0.001), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (924 μm ² , P < 0.001) et Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (1722 μm ² , P < 0.001) (Fig. 7b).

Longueur de Escherichia coli cellules (a ) et zone d'amas de Staphylococcus aureus cellules (b ) après 24 h d'incubation avec PNIPAAm et (1) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 et (3) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. Les barres d'erreur montrent SD déterminé à partir de n = 50. Niveaux de signification **P < 0,05 et ***P < 0.001

Discussion

La méthode de synthèse et les moyens par lesquels les nanoparticules magnétiques ont été ajoutées à la matrice polymère ont eu un effet clair sur les propriétés physico-chimiques intrinsèques du Fe₃ magnétique. O₄ -PNIPAAm nanocomposites. La synthèse par étapes a eu un fort impact sur les propriétés des nanocomposites, entraînant des modifications de la forme des particules, de la distribution de la taille, de la taille et de la chimie de surface, ainsi que des modifications ultérieures des propriétés magnétiques [19, 20]. Polymérisation en émulsion (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1), une méthode simple et précise, a produit des nanocomposites stables avec une distribution granulométrique étroite et une tendance à l'agrégation la plus faible, qualités particulièrement importantes dans les applications biomédicales [17]. Produites par répulsion à la fois stérique et coulombique, les dimensions des particules étaient suffisamment petites pour éviter la précipitation [21]. La méthode la moins efficace était l'addition physique (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3). Non seulement il a été produit en trois étapes distinctes et a donc pris plus de temps à préparer, mais le nanocomposite résultant a montré une agrégation plus élevée que l'une ou l'autre des deux autres méthodes de production. De plus, nos résultats ont indiqué que Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 produit de cette manière peut avoir contenu PNIPAAm et Fe₃ indésirables O₄ résidus de nanoparticules.

Les polymères peuvent se lier aux nanoparticules magnétiques par des liaisons physiques (non covalentes) ou covalentes, le matériau hybride résultant présentant des propriétés spécifiques selon la voie de synthèse empruntée. Une remise en suspension significative des nanoparticules magnétiques a lieu lorsque la préparation se déroule dans le solvant dans lequel se produit la formation de nanoparticules hybrides, après quoi l'agrégation et la ségrégation peuvent devenir un problème. Dans ce cas, la formation in situ de nanoparticules magnétiques peut être une meilleure alternative dans de nombreux cas. De plus, si la concentration en tensioactif est trop faible, la coalescence va modifier la taille des gouttelettes, alors que des micelles peuvent se former si la concentration est trop élevée, conduisant à une nucléation micellaire. À cet égard, il est important que la concentration en tensioactif soit choisie avec soin sur la base d'une caractérisation précise des propriétés de surface et de l'étendue de la modification des particules, afin de garantir que la surface des particules inorganiques est compatible avec la matrice polymère.

Afin d'évaluer les propriétés magnétiques de Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites, il est important de connaître le contenu des MNPs dans le nanocomposite. Le TGA a été utilisé pour quantifier la quantité de MNP et pour étudier la stabilité thermique de Fe₃ O₄ -Nanocomposites PNIPAAm comparés aux nanoparticules PNIPAAm seules. Les trois Fe₃ O₄ -Les nanocomposites PNIPAAm ont affiché une stabilité thermique plus élevée que les nanoparticules PNIPAAm, probablement en raison de la présence de Fe₃ O₄ particules dans la matrice (Fig. 2). Des résidus plus élevés dans les nanocomposites magnétiques pourraient être attribués à la présence de Fe₃ inorganique O₄ composés dans les échantillons, qui ont été maintenus même à des températures plus élevées.

Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 a montré la stabilité thermique la plus élevée des nanocomposites, ainsi que la perte de poids la plus faible. Jusqu'à 200 °C, la principale source de perte de poids était due à la perte d'eau et à l'adsorption physique de la couche de polymère [22] ; au-dessus de 200 °C, cependant, les pertes étaient principalement dues à la décomposition de la couche chimique liant le PNIPAAm. Le résidu de l'échantillon, qui est devenu stable au-dessus de 400 °C, représentait 87 % du poids d'origine, ce qui correspond à la quantité de nanoparticules magnétiques dans le nanocomposite. One aim of this preparation process was to produce a nanocomposite with magnetic properties preventing aggregation and enabling it to re-disperse rapidly as soon as the magnetic field is turned off. Such properties would allow its use in a range of different fields, including hyperthermic treatment of tumours, as contrasting agents in magnetic resonance imaging, in tissue repair, biomedical device coating, immunoassay, cell separation and biomagnetic separation of biomolecules [18, 23,24,25,26]. We tested our nanomaterials through magnetisation saturation, which assesses the maximum possible magnetisation of the substance beyond which no further change takes place despite an increase in the magnetic field. Our results showed Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 to have the highest magnetisation saturation level of the three nanocomposites tested. Our values were lower (53.7 emu/g) than those previously reported for uncoated Fe₃ O₄ nanoparticles (92 emu/g) [27], however, presumably due to surface order/disorder interactions in the magnetic spin moment and an increase in nanocomposite weight and volume due to the presence of the PNIPAAm polymer layer.

Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe₃ O₄ magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe₃ O₄ -PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].

SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe₃ O₄ nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].

All Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E. coli growth rate in the order Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S. aureus growth rate as Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].

In comparison with the modified Fe₃ O₄ nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E. coli et S. aureus , with S. aureus EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe₃ O₄ (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S. aureus was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E. coli et S. aureus corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.

Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E. coli cell length caused by Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2, and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 for S. aureus clustering. This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E. coli cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S. aureus , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S. aureus biofilm was produced when in contact with Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S. aureus usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].

S. aureus cell culture without nanocomposites (a ) and the cells embedded in biofilm after incubation with nanocomposites for 24 h (b ). The scale bar is 10 μm

Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E. coli et S. aureus DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe₃ O₄ ) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.

Conclusions

Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2) and physical addition (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3). Both Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E. coli et S. aureus DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E. coli and Gram-positive S. aureus .

Abréviations

Fe₃ O₄ -PNIPAAm:

Magnetic poly(N-isopropylacrylamide)

MNPs:

Magnetite nanoparticles