Nanocomposites PNIPAM-pyrrole ciblés sensibles au proche infrarouge pour chimiothérapie-photothermie synergique du cancer du sein

Résumé

La thérapie combinée basée sur des nanocomposites multifonctionnels a été considérée comme une approche prometteuse pour améliorer l'efficacité thérapeutique du cancer. Ici, nous rapportons des nanocomposites multifonctionnels ciblés à base de poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) pour une thérapie chimiothérapie-photothermie synergique envers les cellules de cancer du sein. Pour augmenter la température de transition, de l'acide acrylique (AAc) a été ajouté dans le processus de synthèse du PNIPAM, montrant que la température critique de solution inférieure (TCSI) intrinsèque a été modifiée à 42 °C. Pour générer l'effet photothermique sous irradiation laser proche infrarouge (PIR) (808 nm), des nanoparticules de polypyrrole (ppy) ont été uniformément décorées dans le PNIPAM-AAc. L'acide folique (FA), comme ligand de ciblage du cancer, a été conjugué avec succès sur les groupes carboxylates en surplus dans le réseau PNIPAM. La libération du médicament des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA a été efficacement déclenchée en réponse au changement de température par irradiation laser PIR. Nous avons également confirmé que PNIPAM-ppy-FA était internalisé dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 par endocytose médiée par le récepteur au folate et améliorait significativement l'efficacité thérapeutique anticancéreuse avec un traitement combiné d'effets chimiothérapie et photothermique. Par conséquent, notre travail encourage l'exploration plus approfondie d'agents nanovecteurs multifonctionnels pour des approches thérapeutiques synergiques envers différents types de cellules cancéreuses.

Introduction

Le système d'administration de médicaments (SAM) est l'une des méthodes puissantes pour administrer un composé pharmaceutique afin d'atteindre un effet thérapeutique dans la thérapie du cancer [1]. Bien que l'objectif du SAM soit de délivrer le médicament actif et de l'accumuler dans la zone désirée, le SAM conventionnel est souvent accompagné d'effets secondaires graves et d'une efficacité thérapeutique inefficace [2, 3]. Pour surmonter ces obstacles, une variété de nanovecteurs, qui ont la capacité de répondre à des stimuli internes ou externes spécifiques, y compris la température, la lumière, le pH, le champ électrique, l'oxydation-réduction, l'activité enzymatique et la concentration d'antigènes, ont été développés pour le SAM avancé et utilisés pour induire une libération de médicament soutenue et contrôlée [4-6].

L'un des divers stimuli, le nanovecteur thermosensible est une approche puissante pour améliorer le traitement du cancer, car les médicaments dans les nanoparticules pourraient être libérés à une certaine température [7]. De plus, l'avantage des nanoparticules thermosensibles pourrait être combiné avec d'autres stimuli pour induire l'éradication complète du cancer [8, 9]. En tant que nanoparticule thermosensible, le poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) a reçu le plus d'attention, car il présente une transition de phase à une température critique de solution inférieure (TCSI) d'environ 32 °C [10, 11]. En dessous de la TCSI, tout le réseau polymère dans le PNIPAM existe dans un état gonflé en raison des liaisons hydrogène. D'autre part, le PNIPAM passe à l'état hydrophobe et les liaisons hydrogène sont réduites, entraînant un effondrement du réseau polymère au-dessus de la TCSI [12, 13]. Comparé aux autres nanoparticules, le nanovecteur à base de PNIPAM a l'avantage d'une efficacité d'encapsulation de médicament élevée, d'une capacité de libération contrôlée de médicament et d'une bonne biocompatibilité [14]. Cependant, en raison de la libération spontanée du médicament à la température corporelle, le nanovecteur à base de PNIPAM n'est pas suffisant pour être utilisé dans le SAM avancé. Pour surmonter cela, les études précédentes ont ajouté des acides organiques (par exemple, acide vinyle acétique, acrylique et allyl acétique) dans le processus de synthèse du PNIPAM, résultant en une réduction des effets secondaires par la libération continue du médicament [15].

Récemment, un certain nombre d'études se sont concentrées sur de nouvelles approches thérapeutiques intégrant deux ou plusieurs stimuli déclenchant des nanoparticules pour une efficacité thérapeutique anticancéreuse améliorée [16-18]. Par exemple, la thérapie photothermique (TPT) présente plusieurs avantages, tels que le contrôle précis de la lumière sur les tumeurs, la pénétration non invasive et la faible toxicité pour les cellules normales [19, 20]. Pour combiner les nanoparticules avec la TPT, les agents photothermiques (par exemple, nanobâtonnets d'or, nanotubes de carbone, polypyrrole (ppy) et oxyde de graphène) doivent être uniformément encapsulés dans des nanoparticules à base de PNIPAM [21-23]. L'étude précédente a fabriqué des nanobâtonnets d'or recouverts de silice mésoporeuse avec une coquille PNIPAM thermo- et pH-sensible et a exploré davantage les applications de thérapie anticancéreuse in vivo [24]. Cependant, ces nanocomposites à base de PNIPAM nécessitent un processus de synthèse en plusieurs étapes. De plus, comme les nanocomposites n'avaient pas de moiety de ciblage contre des cellules cancéreuses spécifiques, cela pourrait causer de graves effets secondaires sur d'autres organes ou tissus normaux. Dans notre rapport précédent, nous avons développé un système de libération bidirectionnelle contrôlée en utilisant les propriétés thermo- et pH-sensibles du PNIPAM [15]. Les nanogels PNIPAM ont été copolymérisés avec du contenu en acide acrylique (AAc) pour un contrôle efficace de la TCSI. Pour mieux améliorer le ciblage du cancer et l'efficacité thérapeutique, nous avons développé la thérapie combinée de ciblage du cancer en utilisant les effets chimiothérapie et photothermique (Schéma 1). À mesure que la température augmente par irradiation laser PIR, les médicaments des nanocomposites PNIPAM thermosensibles sont libérés et l'effet photothermique est ensuite activé. En raison de l'acide folique (FA) conjugué, les nanocomposites à base de PNIPAM ont affiché une efficacité thérapeutique significativement améliorée envers les cellules de cancer du sein MDA-MB-231.

Matériaux et méthodes

Matériaux

NIPAM, N,N'-méthylènebisacrylamide (MBA), persulfate de potassium (KPS, 99 %), N-(3-Diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide hydrochloride (EDC) et N-Hydroxysuccinimide (NHS) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Polyvinylpyrrolidone (PVP) et pyrrole (98 %) ont été obtenus chez Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). AAc a été acheté chez Dae Jung Chemicals & Materials. Co. Ltd (Corée). FA-PEG-amine (FA-PEG-NH₂, PM : 5 kDa) a été fourni par Nanocs, Inc. (New York, NY, USA). Chlorhydrate de doxorubicine (Dox) a été obtenu chez Tokyo Chemical Industry. Co. Ltd (Tokyo, Japon). Tous les produits chimiques et matériaux ont été utilisés commercialement sans purification supplémentaire.

Synthèse de la nanoparticule PNIPAM-AAc décorée de ppy

La nanoparticule thermosensible PNIPAM copolymérisée avec AAc a été synthétisée selon le rapport précédent [15]. 1,13 g de monomère NIPAM, 0,077 g de MBA et 0,136 g d'AAc ont été dissous dans 100 ml d'eau déionisée et ajoutés dans un ballon à trois cols de 250 ml. Après 30 min, la température de réaction a été augmentée à 80 °C et agitation vigoureuse pendant 1 h. Pour induire la polymérisation, KPS (1,5 mg) a été ajouté au mélange, suivi d'agitation pendant 4 h. Le mélange a été dialysé contre une membrane de dialyse à coupure de poids moléculaire (MWCO) 12-14 kDa dans de l'eau déionisée pendant 7 jours pour éliminer le monomère non réagi, l'initiateur, les ions dispensables et la nanoparticule PNIPAM-AAc a été obtenue par lyophilisation pendant 48 h. Pour fonctionnaliser l'effet photothermique, le ppy a été décoré dans les nanoparticules PNIPAM-AAc [25]. PVP (50 et 100 mg) et monomère pyrrole (50 et 100 μl) ont été ajoutés rapidement dans 10 mg/ml de solution PNIPAM-AAc et ont été agités pendant 12 h à température ambiante. Ensuite, KPS (3,4 mg) a été inséré dans la solution PNIPAM-AAc et a été agité zusätzlich pendant 14 h. Le PNIPAM-AAc décoré de ppy a été centrifugé trois fois avec de l'eau distillée. Les PNIPAM-ppy-5 et PNIPAM-ppy-10 ont été obtenus par lyophilisation pendant 48 h.

Synthèse des nanocomposites PNIPAM-ppy ciblant le cancer

Pour obtenir des nanocomposites PNIPAM-ppy ciblant le cancer (PNIPAM-ppy-FA), 10 mg de PNIPAM-ppy ont été dissous dans du tampon phosphate salin (PBS, 10 ml, pH 5,5) et ont été ultrasoniqués pendant 5 min. EDC (15 mg, 0,078 mmol) et NHS (15 mg, 0,13 mmol) ont été ajoutés dans la solution PNIPAM-ppy. Après 1 h, FA-PEG-NH₂ (5 mg) a été ajouté et a été agité additionally pendant la nuit. Le FA-PEG-NH₂ non réagi, EDC et NHS dans la solution PNIPAM-ppy ont été éliminés par une membrane de dialyse (MWCO 6-8 kDa) et les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ont été lyophilisées pendant 48 h.

Synthèse des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA chargés en médicament anticancéreux

10 mg de PNIPAM-ppy-FA ont été dissous dans de l'eau déionisée et ont été ultrasoniqués pendant 5 min. 0,5 mg/ml de Dox a été ajouté goutte à goutte dans la solution PNIPAM-ppy-FA, en agitant vigoureusement à température ambiante. Le Dox non chargé a été éliminé par centrifugation (14 000 tr/min, 10 min) et a été purifié avec de l'eau déionisée. Le Dox chargé PNIPAM-ppy-FA (Dox@PNIPAM-ppy-FA) a été obtenu par lyophilisation pendant 48 h.

Caractérisation des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA sensibles au PIR et thermosensibles

La microscopie électronique à transmission (MET, JEOL-2100F, JEOL, Japon) a été utilisée pour caractériser la taille, la morphologie et la distribution des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA. Pour la mesure MET, les échantillons ont été préparés en déposant une goutte de la solution d'échantillon dans l'eau déionisée (concentration : 1 g/L) sur une grille de cuivre à 200 mailles revêtue de carbone. La distribution de taille et la charge de surface des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA, dissous dans l'eau déionisée et ultrasoniqués pendant 5 min, ont été mesurées en utilisant un Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, UK). La modification de surface et la liaison chimique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ont été confirmées par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR). Les spectres FT-IR ont été enregistrés sur des pastilles KBr en utilisant un instrument Nicolet iS50 (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA) dans la gamme de 400 à 4000 cm⁻¹ à une résolution de 4 cm⁻¹. La propriété optique et la capacité de chargement de Dox dans les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ont été observées par spectroscopie UV-Vis (UV 1800, Shimazu, Japon).

Propriété photothermique et photostabilité des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA sensibles au PIR et thermosensibles

La propriété photothermique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA chargés en Dox (Dox@PNIPAM-ppy-FA) a été évaluée en détectant en temps réel les changements de température. Dox@PNIPAM-ppy-FA a été dissous dans une solution aqueuse avec différentes concentrations de 0,05, 0,1 et 0,2 mg/ml et a été irradié pendant 20 min en utilisant un laser PIR à 808 nm (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., Chine) à une densité de puissance de 2 W/cm². L'influence de la densité de puissance du laser PIR a été étudiée par irradiation du laser PIR pendant 20 min avec une densité de puissance de 1, 2 et 3 W/cm², respectivement. De plus, pour étudier la stabilité photothermique contre le laser PIR, la solution Dox@PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg/ml) a été exposée pendant 15 min et suivant un processus de refroidissement naturel pendant cinq fois. Pendant l'irradiation laser PIR, la température de la solution Dox@PNIPAM-ppy-FA a été mesurée par un thermocouple lié à un thermomètre numérique (DTM-318, Tecpel Co., Taïwan) toutes les 60 s pendant 15 min.

Libération de médicament sensible au PIR et thermosensible des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

Pour étudier les profils de libération de Dox par thermo-réponse, des solutions Dox@PNIPAM-ppy-FA (1 mg/ml) ont été préparées dans un flacon de 5 ml et ont ensuite été agitées à 25, 37 et 50 °C. À un temps de libération défini (0-72 h), le surnageant de chaque échantillon a été collecté par centrifugation et a été remplacé par un volume égal de milieu frais. La quantité de Dox libérée des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA a été estimée par mesure de spectroscopie UV-Vis à 480 nm. De plus, le comportement de libération de Dox via la solution Dox@PNIPAM-ppy-FA (1 mg/ml) stimulée par laser PIR a été vigoureusement agité à 37 °C et irradié pendant 10 min à des points de temps prédéterminés (1, 2, 3, 4 et 5 h). Comme contrôle, la solution Dox@PNIPAM-ppy-FA sans irradiation laser PIR a été utilisée. Le Dox libéré a été déterminé par la méthode susmentionnée.

Analyse de cytotoxicité des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

La cytotoxicité des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA incluant PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA a été vérifiée en utilisant le test MTT. Les cellules A549 et MDA-MB-231 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 × 10⁴ cellules par puits dans 200 μl de milieu RPMI 1640 contenant 10 % FBS et 1 % pénicilline-streptomycine et ont été incubées à 37 °C sous une atmosphère humidifiée avec 5 % CO₂. Après 1 jour, 200 μl de nanocomposites PNIPAM-ppy-FA avec diverses concentrations (20-100 μl) ont été traités sur chaque cellule et la plaque a été incubée pendant 24 h. Les cellules ont été lavées avec DPBS et le milieu a ensuite été remplacé par un milieu frais avec l'agent MTT (0,5 mg/ml). Après une autre incubation de 4 h, le milieu a été soigneusement retiré et 200 μl de DMSO ont été ajoutés à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan pourpre internalisés. L'absorption a été mesurée à 595 nm en utilisant un lecteur de microplaques iMark™ (Bio-rad, Hercules, CA, USA).

Analyse de l'internalisation cellulaire des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

Pour évaluer la capacité de ciblage vers des cellules cancéreuses spécifiques des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA, les cellules A549 et MDA-MB-231 ont été ensemencées dans une plaque à 8 puits (ibidi, Munich, Allemagne) à une densité de 2 × 10⁴ cellules/ml et ont été incubées pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été incubées avec les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA (60 μg/ml) pendant 6 h. Par la suite, les cellules ont été lavées deux fois avec DPBS pour éliminer les nanocomposites restants et ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 min. Après traitement de 0,1 % Triton-X pendant 15 min à température ambiante, les cellules ont été finalement colorées par Alexa Fluor 488 phalloïdine (1:200, Invitrogen, USA) pendant 1 jour à 4 °C et 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, Thermo Fisher Scientific, USA) pendant 10 min, respectivement. Les images d'internalisation cellulaire ont été observées en utilisant une microscopie confocale à balayage laser (MCL, LSM 710, Carl Zeiss, Allemagne).

Effets anticancéreux améliorés des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA via irradiation laser PIR

L'efficacité thérapeutique améliorée en utilisant les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA sensibles au PIR et thermosensibles sur les cellules de cancer du sein a été étudiée par test MTT. MDA-MB-231 (1 × 10⁴ cellules/ml) ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits et ont été incubées pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été lavées avec DPBS et les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA à diverses concentrations (20, 40, 60, 80 et 100 μg/ml) ont été ajoutés dans chaque puits de manière dépendante de la concentration. Après incubation pendant la nuit, le milieu a été retiré, suivi de l'ajout de milieu frais. Pour les groupes d'irradiation laser PIR, les cellules ont été traitées avec 5 W/cm² pendant 5 min. Ensuite, MDA-MB-231 ont été lavées avec DPBS et le milieu frais incluant la solution MTT a été ajouté. Après 4 h, le milieu a été soigneusement retiré et 200 μl de DMSO ont été ajoutés dans chaque puits. Finalement, l'absorption à 595 nm a été mesurée par un lecteur de microplaques iMark™ pour déterminer la viabilité cellulaire. Comme une autre méthode pour l'observation des effets thérapeutiques anticancéreux, le test vivant/mort a été réalisé. PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 μg/ml) ont été traités dans MDA-MB-231. Après 24 h, MDA-MB-231 ont été exposées avec ou sans irradiation laser PIR (5 W/cm², 5 min) et ont été colorées avec calcein AM et éthidium homodimère-1. Après 30 min, les cellules ont été lavées plusieurs fois avec DPBS. Les images vivant/mort ont été obtenues en utilisant une microscopie à fluorescence inversée (Olympus Ix73, Japon).

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des nanocomposites PNIPAM-ppy ciblant le cancer sensibles au PIR et thermosensibles

Pour la génération de nanocomposites à base de PNIPAM thermosensibles, des nanoparticules PNIPAM-AAc ont été fabriquées par une méthode de polymérisation radicalaire [15]. Pour contrôler la TCSI via irradiation laser PIR, le ppy a été recouvert par réaction de polymérisation dans le PNIPAM-AAc préparé. Le PNIPAM-ppy-FA ciblant le cancer a été synthétisé en conjuguant chimiquement FA-PEG-NH₂ au groupe carboxyle dans PNIPAM-AAc. Selon les images MET de la Fig. 1a, la morphologie, la taille et la dispersité de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA ont été observées. Le PNIPAM-AAc préparé présentait une forme homogène avec un diamètre moyen de 274,32 ± 11,62 nm. Après décoration du ppy, PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA montraient des tailles similaires avec 275,99 ± 11,41 et 285,77 ± 17,92 nm. La taille du Dox chargé PNIPAM-ppy-FA a légèrement augmenté de 285,77 ± 17,92 à 290,73 ± 12,28 nm, indiquant que les médicaments anticancéreux étaient chargés dans les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA [26]. Intéressant, comparé au PNIPAM-AAc, la présence du ppy dans les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA était clairement exhibée par de petites taches noires. De plus, en raison de la chaîne PEG, les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA étaient bien dispersés en solution aqueuse sans agrégation [27]. Les diamètres hydrodynamiques moyens de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont été mesurés par analyse DLS (Fichier additionnel 1 : Fig. S1). Les diamètres de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA étaient de 432, 450,7, 468,6 et 486,7 nm, respectivement. En raison de différentes méthodes analytiques, le diamètre de chaque nanocomposite était plus grand que celui de MET, mais la taille des particules et la distribution des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA présentaient une tendance similaire.

Pour étudier l'influence du ppy polymérisé dans PNIPAM-AAc, les valeurs TCSI de PNIPAM-AAc et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont été mesurées à différentes températures (Fig. 1b). Comparé à notre travail précédent [15], la TCSI de Dox@PNIPAM-ppy-FA était légèrement diminuée par rapport à celle de PNIPAM-AAc (42 °C). Cette différence pourrait être causée par la réduction des groupes carboxylates dans PNIPAM-AAc due au ppy polymérisé et au ligand de ciblage du cancer conjugué [28]. Par la suite, nous avons surveillé le changement de taille des particules en fonction de la température à la Fig. 1c. Pour cela, les diamètres de PNIPAM-AAc et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont été mesurés dans la plage de température de 25 à 50 °C. À mesure que la température augmentait, PNIPAM-AAc diminuait de 436 à 177 nm. De plus, la taille de Dox@PNIPAM-ppy-FA était grandement réduite de 630 à 420 nm, indiquant que le ppy décoré dans les nanocomposites PNIPAM n'affectait pas fortement les applications de SAM contrôlé et thermosensible [27].

Les valeurs de potentiel zêta de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA affichaient le changement de surface des nanocomposites avant et après modification (Fig. 2a). Le potentiel zêta de PNIPAM-AAc était de -37,1 ± 1,61 mV en raison des groupes carboxylates dans AAc [29]. Les valeurs de PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA augmentaient à -29,6 ± 0,96 et -15,6 ± 0,26 mV, indiquant que le polypyrrole chargé positivement et FA-PEG-NH₂ étaient introduits avec succès dans les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA [27]. En raison du Dox chargé négativement, le potentiel zêta de Dox@PNIPAM-ppy-FA changeait en charges plus négatives (-28,6 ± 0,23 mV). Comme montré à la Fig. 2b, la synthèse réussie de PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA a été confirmée par spectroscopie FT-IR. Le spectre de PNIPAM-AAc montrait les pics de vibration d'étirement de C-N et CH₂ entre 1100 et 1200 cm⁻¹ et les pics de C=O, N-H et COOH étaient observés à 1545, 1645 et 1750 cm⁻¹, qui appartenaient à PNIPAM-AAc [15]. Le polypyrrole dans PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA démontrait les pics additionnels à 935 et 1050 cm⁻¹ observés [30]. Dans les spectres de PNIPAM-ppy-FA, de nouveaux pics de vibration apparaissaient à 1107 et 2880 cm⁻¹, qui étaient attribués à C-O-C de la chaîne PEG. Ce résultat indiquait la conjugaison chimique réussie de FA-PEG-NH₂ [31]. Cependant, le ligand de ciblage FA n'était pas détecté par FT-IR, car sa structure était similaire à PEG. Pour confirmer la présence de FA dans les nanocomposites PNIPAM, PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy et PNIPAM-ppy-FA ont été réalisés par spectroscopie UV-Vis (Fig. 2c). Alors que les spectres de PNIPAM-AAc et PNIPAM-ppy (sans FA) ne montraient aucun pic d'absorption, PNIPAM-ppy-FA montrait le pic additionnel à 280 nm, qui était distinctif dans FA [32]. Ce résultat soutenait que les molécules FA étaient greffées sur les nanocomposites à base de PNIPAM.

Propriété photothermique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA via irradiation laser PIR

Pour utiliser les nanocomposites à base de PNIPAM pour la thérapie photothermique, la propriété optique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA a été examinée par spectroscopie UV-Vis. Comme montré à la Fig. 2c, PNIPAM-AAc ne montrait aucune absorbance dans la région PIR (λ = 700-1000 nm). Cependant, les spectres de PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA montraient évidemment une forte absorbance dans la même plage en raison des nanoparticules de ppy polymérisées. Ces résultats d'absorbance démontraient que les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA pouvaient convertir la lumière PIR en chaleur [26]. Ensuite, nous avons évalué la propriété photothermique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA par irradiation laser PIR (Fig. 3). Pour optimiser l'effet photothermique, PNIPAM-FA (sans pyrrole), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 μl) et PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 μl) ont été préparés à la même concentration (0,1 mg/ml) et ont ensuite été exposés à l'irradiation laser PIR à 808 nm à une densité de 2 W/cm² pendant 20 min (Fig. 3a). La température de PNIPAM-ppy-10-FA a augmenté de 14,5 °C, ce qui était 2 fois plus élevé que celui de PNIPAM-ppy-5-FA. Comme contrôle, PNIPAM-FA sans ppy a été irradié, mais la température a augmenté négligemment (2,4 °C). Par conséquent, nous avons choisi PNIPAM-ppy-10-FA pour enquêter sur des expériences photothermiques supplémentaires. Pour observer les changements de température par concentrations, le laser PIR a été irradié sur PNIPAM-ppy-FA à différentes concentrations (0,05, 0,1 et 0,2 mg/ml). À la Fig. 3b, selon la concentration, la température a augmenté de 10, 14,5 et 18 °C, respectivement. De plus, la solution PNIPAM-ppy-FA (0,1 mg/ml) a été irradiée avec diverses densités de puissance laser (1-3 W/cm²) à la Fig. 3c. Comme prévu, l'augmentation de température du nanocomposite était fortement dépendante de la puissance du laser. Par la suite, nous avons observé la stabilité photothermique des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA à la Fig. 3d. Bien que l'irradiation laser PIR ait été réalisée de manière répétitive au moins 5 fois, la température augmentait régulièrement à 33 °C, montrant que le nanocomposite PNIPAM-ppy-FA était un nanovecteur approprié pour la thérapie photothermique.

Libération de médicament sensible au PIR et thermosensible depuis les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

Pour évaluer les profils de libération de médicament via PIR et thermo-réponse, nous avons analysé les propriétés d'encapsulation et de libération des nanocomposites Dox@PNIPAM-ppy-FA. Initialement, nous avons mesuré les spectres d'absorption UV-Vis du PNIPAM-ppy-FA chargé en médicament et un pic d'absorption fort a été observé près de 480 nm (Fig. 2c). Ce résultat indiquait que Dox s'était chargé avec succès dans les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA. L'efficacité de chargement de Dox des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA a été calculée à 15 % en utilisant la courbe d'étalonnage de Dox (données non montrées). À la Fig. 4a, le profil de libération de Dox depuis PNIPAM-ppy-FA a été étudié à différentes températures. Nous avons observé le comportement de libération de Dox pendant 72 h à 25 °C, 37 °C et 50 °C et la libération cumulative de Dox depuis PNIPAM-ppy-FA était de 15 %, 42 % et 67 %, respectivement. Puisque la TCSI de PNIPAM-ppy-FA diminuait légèrement à 42 °C, la libération cumulative à la température corporelle s'est avérée relativement plus élevée qu'à température ambiante. Une grande quantité de Dox a été libérée, cependant, le Dox libéré n'affectait pas l'efficacité thérapeutique, car les nanocomposites Dox@PNIPAM-ppy-FA pouvaient être internalisés uniquement dans les cellules positives au récepteur au folate, comme décrit précédemment [26, 32]. Au-dessus de la TCSI (50 °C), la quantité de Dox depuis les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA était libérée quatre fois plus qu'à température ambiante, suggérant que les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA pouvaient être utilisés dans un système de libération contrôlée de médicament par réponse thermique. En outre, nous avons étudié le comportement de libération déclenchée par lumière PIR des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA à la Fig. 4b. La solution Dox@PNIPAM-ppy-FA (1 mg/ml) a été exposée à l'irradiation laser PIR (3 W/cm²) pendant 10 min et cette opération a été répétée toutes les 1 h. Pendant 6 h, la quantité totale de Dox via irradiation laser PIR a atteint 35 %, alors que le profil de libération de Dox sans irradiation laser PIR montrait environ 5 % et 15 % (25 °C et 37 °C). Ce résultat montrait que l'irradiation laser PIR résultait en une température plus élevée que la TCSI des nanocomposites et induisait la libération de Dox depuis les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA.

Analyse de cytotoxicité et d'internalisation cellulaire des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA

Selon la littérature, la cytotoxicité des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA a été étudiée envers les cellules de cancer du poumon et du sein (Fichier additionnel 1 : Fig. S2) [33, 34]. Indépendamment des concentrations d'échantillons, après incubation avec PNIPAM-ppy-FA pendant 24 h, les deux viabilités cellulaires étaient observées (> 85 %). Par conséquent, nos nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ne montraient pas de cytotoxicité en tant que nanovecteur pour les applications d'administration de médicaments [35, 36]. Pour étudier si PNIPAM-ppy-FA pouvait livrer sélectivement aux cellules cancéreuses, nous avons examiné les signaux fluorescents des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA intracellulaires en utilisant la microscopie confocale à balayage laser (Fichier additionnel 1 : Fig. S3). Les comportements d'internalisation cellulaire des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA ont été évalués dans les lignées cellulaires négatives (A549) et positives (MDA-MB-231) pour le récepteur au folate [37]. Après incubation des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 avec Dox@PNIPAM-ppy-FA, une forte fluorescence rouge a été observée, montrant que Dox@PNIPAM-ppy-FA étaient internalisés dans les lysosomes des cellules MDA-MB-231. En contraste, lorsque PNIPAM-ppy-FA et Dox@PNIPAM-ppy-FA étaient traités avec des cellules A549, les signaux Dox n'étaient pas observés. Ces images confocales démontraient que les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA pouvaient être sélectivement internalisés dans les cellules cancéreuses surexprimant le récepteur au folate via la voie d'endocytose médiée par le récepteur comme décrit précédemment [38, 39].

Effets anticancéreux chimiothérapie-photothermie des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA sensibles au PIR et thermosensibles

Pour confirmer l'efficacité thérapeutique combinée in vitro des nanocomposites PNIPAM-ppy-FA, les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA ont été évalués sur les cellules MDA-MB-231 avec ou sans irradiation laser PIR et les viabilités cellulaires ont été évaluées par test MTT à la Fig. 5a. Pour la thérapie photothermique, les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 avec PNIPAM-ppy-FA ont été incubées pendant 12 h et ont été ensuite exposées au laser PIR (5 W/cm², 5 min). La viabilité cellulaire des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 a diminué à 70-90 % selon les concentrations de PNIPAM-ppy-FA. Pour confirmer l'effet chimiothérapeutique seul, les nanocomposites Dox chargés PNIPAM-ppy-FA ont été traités. Nous avons observé que les viabilités diminuaient à 50 % en raison de la libération de Dox depuis les nanocomposites, correspondant au profil de libération à la Fig. 4. Intéressant, après irradiation laser PIR dans les cellules MDA-MB-231 avec les nanocomposites Dox@PNIPAM-ppy-FA, la viabilité cellulaire diminuait dramatiquement jusqu'à 24 %, ce qui était plus élevé que ceux des groupes de contrôle (PNIPAM-ppy-FA avec irradiation laser PIR, Dox@PNIPAM-ppy-FA sans irradiation laser PIR). Ce résultat indiquait un effet synergique optimal de la thérapie combinée chimiothérapie-photothermie médiée par irradiation laser PIR. De plus, pour observer directement l'efficacité thérapeutique dans les cellules cancéreuses, le test vivant/mort a été réalisé à la Fig. 5b. Comme groupe de contrôle, nous avons observé la viabilité des seules cellules MDA-MB-231 avec ou sans irradiation laser PIR (5 W/cm², 5 min) et la plupart des cellules montraient une fluorescence verte (cellules vivantes). Cela démontrait que l'irradiation laser PIR n'affectait pas manifestement la viabilité cellulaire. De plus, les cellules MDA-MB-231 avec PNIPAM-ppy-FA sous irradiation laser PIR montraient quelques fluorescences rouges (cellules mortes), indiquant l'effet thérapeutique photothermique causé par les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA. Malgré l'absence d'irradiation laser PIR dans les cellules MDA-MB-231 avec Dox@PNIPAM-ppy-FA, quelques fluorescences rouges sporadiques étaient observées, indiquant la chimiothérapie. De plus, lorsque les cellules MDA-MB-231 étaient traitées avec les nanocomposites et l'irradiation laser PIR, la plupart des cellules cancéreuses présentaient quelques fluorescences rouges [39, 40]. Ces résultats soutenaient les effets thérapeutiques synergiques de la thérapie combinée chimiothérapie-photothermie via irradiation laser PIR et nanocomposites Dox@PNIPAM-ppy-FA thermosensibles.

Conclusion

Nous avons construit avec succès un nanocomposite PNIPAM-ppy-FA ciblant le cancer, sensible au PIR et thermosensible, pour une thérapie combinée chimiothérapie-photothermie. Pour induire la libération contrôlée et l'effet photothermique via irradiation laser PIR à 808 nm, des nanoparticules ppy ont été uniformément décorées sur PNIPAM-AAc par méthode de polymérisation. Dox@PNIPAM-ppy-FA a montré un effet photothermique significatif et une photostabilité. De plus, Dox@PNIPAM-ppy-FA a montré des propriétés favorables de transition thermosensible à différentes conditions et la libération de médicament depuis les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA pouvait être contrôlée par lumière PIR et thermo-réponse. Les études in vitro ont vérifié que les nanocomposites PNIPAM-ppy-FA montraient une excellente biocompatibilité et une efficacité thérapeutique améliorée envers les cellules de cancer du sein. Cette efficacité anticancéreuse améliorée via les nanocomposites était contribuée aux raisons suivantes : (1) internalisation cellulaire spécifique des nanocomposites dans l'endocytose médiée par le récepteur au folate, (2) libération accumulée de Dox depuis PNIPAM-ppy-FA via PIR et thermo-réponse, et (3) effet thérapeutique synergique par combinaison chimiothérapie-photothermie. Par conséquent, notre nanocomposite PNIPAM-ppy-FA pourrait être potentiellement utilisé comme nanovecteur multifonctionnel pour des approches thérapeutiques synergiques envers différents types de cancers avec des effets secondaires réduits.

Disponibilité des données et matériaux

Les données et l'analyse dans le travail actuel sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

Abréviations

TPT :

Thérapie photothermique

PIR :

Proche infrarouge

FA :

Acide folique

FA-PEG-NH₂ :

FA-PEG amine

TCSI :

Température critique de solution inférieure

PNIPAM :

Poly(N-isopropylacrylamide)

ppy :

Polypyrrole

MET :

Microscopie électronique à transmission

UV-Vis :

Spectroscopie ultraviolette-visible