Points quantiques CoFe₂O₄ : thérapie photothermique/photodynamique duale pour le CPNPC — Induction de l'apoptose via la modulation PI3K/AKT

Résumé

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est devenu le deuxième cancer malin le plus diagnostiqué dans le monde. Dans le cadre de nos recherches à long terme sur les nanomatériaux pour développer des stratégies de thérapie anticancéreuse, nous avons construit de nouveaux points quantiques (PQ) de CoFe₂O₄ dotés de propriétés photothermiques/photodynamiques synergiques exceptionnelles, supprimant efficacement le CPNPC sans toxicité apparente. Nous montrons que la combinaison CoFe₂O₄-PQ + traitement NIR induit l'apoptose des cellules de CPNPC. De plus, ce traitement favorise la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) pour déclencher la mort cellulaire via la régulation de la voie PI3K/AKT. En outre, le traitement CoFe₂O₄-PQ + NIR élimine avec succès les xénogreffes tumorales in vivo sans effets toxiques apparents. Ensemble, nous rapportons que ces nouveaux nanomatériaux CoFe₂O₄-PQ présentent un effet synergique photothermique/photodynamique accru pour tuer le CPNPC sans toxicité, constituant un photosensibilisateur prometteur pour la thérapie du CPNPC.

Introduction

Le cancer est la principale cause de décès et représente un fardeau énorme pour les familles et la société. Le cancer du poumon se classe au deuxième rang des cancers les plus diagnostiqués et au premier rang des décès par cancer en 2020. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), qui représente environ 85 % de tous les cancers du poumon, se caractérise par une incidence et une mortalité élevées. Récemment, malgré les options chirurgicales, de grands efforts ont été déployés pour développer des chimiothérapies ou immunothérapies. Par exemple, les inhibiteurs de mutants EGFR et KRAS se sont avérés efficaces, et de nouveaux inhibiteurs ALK sont en cours. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires anti-PDL1 et anti-CTLA4 apportent également une efficacité prometteuse et prolongent la survie. Cependant, le taux de réponse varie selon les patients et les effets secondaires, notamment la résistance aux médicaments, ne peuvent être négligés. Il est donc urgent et nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques moins invasives pour la recherche et le traitement clinique du CPNPC.

Basés sur les progrès récents, l'utilisation de nanomatériaux pour la thérapie photothermique (PTT) et photodynamique (PDT) a suscité un intérêt considérable et un grand développement en tant que stratégie anticancéreuse et option alternative en traitement clinique. La PTT et PDT basées sur les nanomatériaux se caractérisent par une faible invasivité et toxicité, avec peu de risque d'induire une résistance aux médicaments. Avec la collaboration de la lumière, principalement NIR, les nanomatériaux localisés peuvent élever la température dans la tumeur et convertir l'oxygène en ROS cytotoxiques, causant la mort cellulaire pour éliminer les tumeurs. Le nanomatériau joue un rôle clé dans l'efficacité et la sécurité. Bien que de tels nanomatériaux incluent des nanostructures métalliques, des matériaux carbonés, des nanoparticules polymères ou des composés semi-conducteurs, ils ont leurs limites. Par exemple, les matériaux carbonés sont coûteux et ont des propriétés de suspension insatisfaisantes, limitant leur application à grande échelle et leur potentiel clinique. D'autres tentatives sont donc nécessaires pour générer des nanomatériaux plus adaptés.

Ces dernières années, les points quantiques (PQ), comme nouveaux nanomatériaux, ont reçu une grande attention dans les applications biomédicales en raison de leur bonne biocompatibilité, solubilité, et surtout de leur photostabilité supérieure et de leur fonctionnalisation de surface aisée. En tirant parti de ces propriétés, plusieurs rapports ont utilisé les PQ comme nouveaux réactifs PDT, pouvant être conçus pour être associés à d'autres biomolécules afin d'améliorer l'efficacité de la PDT dans le traitement du cancer. Par exemple, Meng et al. ont rapporté un GQD@MnO₂ multifonctionnel induit par excitation à deux photons pour améliorer l'efficacité PDT. Kuo et al. ont généré des PQ dopés à l'azote fonctionnalisés avec des molécules amino, améliorant également l'efficacité PDT. Inspirés par ces résultats, nous avons cherché à développer de nouveaux PQ combinés à des nanomatériaux à base de métaux non nobles pour apporter des effets synergiques PTT et PDT dans un seul nanosystème. Par exemple, les nanomatériaux à base de Co sont des nanomatériaux non nobles bien étudiés, connus comme agents PTT pour la thérapie tumorale ou l'imagerie. Nous avons donc suggéré que la conception de PQ à base de Co pourrait apporter des effets synergiques PTT/PDT améliorés.

Dans cette étude, nous avons synthétisé de nouveaux nanomatériaux CoFe₂O₄-PQ qui présentent des effets synergiques PTT et PDT améliorés pour tuer le CPNPC sans effets toxiques in vitro et in vivo, pouvant être un photosensibilisateur prometteur pour la thérapie du CPNPC.

Matériaux et méthodes

Synthèse des CoFe₂O₄-PQ

Les CoFe₂O₄-PQ ont été synthétisés par méthode hydrothermale. Typiquement, 0,238 g CoCl₂·6H₂O et 0,808 g Fe(NO₃)₃·9H₂O ont été dissous dans 10 mL H₂O et 10 mL de glycol propylène, puis agités 10 min. Ensuite, 4 mL de dithranol amine ont été ajoutés goutte à goutte, suivis de 30 min d'agitation. La boue obtenue a été transférée dans un autoclave Teflon de 50 mL, maintenu à 160 °C pendant 3 h au four. Les CoFe₂O₄-PQ ont été collectés par centrifugation à 8500 tr/min pendant 10 min, puis rincés successivement à l'eau déionisée et à l'éthanol. Les réactifs et matériaux sont listés au Tableau 1.

Caractérisation des CoFe₂O₄-PQ

La morphologie et la taille ont été déterminées par MET et système EDS. La structure cristalline a été analysée par diffractomètre X (Bruker Allemagne) avec rayonnement Cu Kα (λ = 0,15406 nm). Le spectre d'absorbance a été détecté par spectrophotomètre SHIMADZU UV-2600. Les états de valence des éléments ont été déterminés par spectroscopie de photoémission X (XPS, VG ESCALAB 220I-XL, USA). L'imagerie thermique a été enregistrée avec une caméra thermique IR (FLIR E50, USA).

Culture cellulaire

Les lignées cellulaires de CPNPC NCI-H460 (H460) et A549, et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) ont été obtenues de l'ATCC et testées négatives pour le mycoplasme. H460 et A549 ont été cultivées en RPMI-1640 avec 10 % FBS et 1 % Pénicilline-Streptomycine (Gibco). HUVECs en milieu de croissance endothéliale (Sigma, #211-500). Toutes les cellules étaient maintenues dans un incubateur à 37 °C, 5 % CO₂, humidité, obscurité.

Détection de la cytotoxicité

Diverses concentrations de travail (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/mL) de CoFe₂O₄-PQ ont été ajoutées et cultivées avec HUVECs pendant 24 h. Après incubation, le milieu a été changé et le réactif CCK-8 ajouté à chaque puits suivi d'1 h d'incubation. Les plaques ont été mesurées à 450 nm (EnSpire™ Multimode Plate Reader). La viabilité cellulaire du témoin HUVECs était prise à 100 %.

Analyse de l'apoptose

Les cellules H460 et A549 (2 × 10⁵) ont été cultivées dans des plaques à 6 puits overnight avant traitement avec 1,0 mg/mL CoFe₂O₄-PQ combiné au laser NIR 808 nm pendant 5 min. Les cellules ont été lavées et colorées avec le kit d'apoptose Annexin-V/PI (BD ; #556547) selon les instructions. Pour l'essai d'apoptose des HUVECs, elles ont été incubées avec différentes concentrations de CoFe₂O₄-PQ. Le taux d'apoptose a été déterminé comme décrit.

Détection des ROS cellulaires

Les cellules H460 et A549 ont été cultivées overnight dans des plaques à 6 puits. Les cellules ont été incubées avec ou sans 1,0 mg/mL pendant 1 h et traitées au laser NIR 808 nm pendant 5 min. Après traitements, DCFH-DA a été ajouté et incubé 30 min suivi de détection FACS (excitation/émission 485/535 nm). Pour l'essai d'inhibition des ROS, l'inhibiteur NAC (Sigma ; A7250) a été ajouté selon les instructions. Les données ont été quantifiées avec le logiciel Flow-jo.

Analyse par Western Blot

Les cellules H460 et A549 ont été traitées comme pour l'essai d'apoptose, et la protéine totale a été extraite avec tampon de lyse RIPA. La détection Western blot a été réalisée comme décrit précédemment. Les anticorps utilisés : anti-Bcl-2 polyclonal lapin (abcam ; ab59348), anti-Bax monoclonal lapin (abcam ; ab32503), anti-P-PI3K polyclonal lapin (Bio-Vision ; 3152-100), anti-P-AKT-S473 monoclonal lapin (CST ; 4060S), anti-β-Actine monoclonale lapin (CST ; 4970S), anticorps anti-lapin IgG HRP-lié (CST ; 7074S). La quantification a été déterminée par le logiciel Image-J.

Étude in vivo de l'effet anti-CPNPC de la combinaison CoFe₂O₄ et traitement NIR

Pour déterminer la capacité de destruction tumorale des CoFe₂O₄-PQ, des cellules H460 ont été implantées sous-cutanément avec 50 % MatriGel chez des souris NSG (N = 8 par groupe). Des souris M-NSG mâles de 4-6 semaines (Shanghai Model Organisms, #NM-NSG-001) ont été utilisées. Lorsque la tumeur était visible et le volume atteignait ~5 mm × 5 mm, les souris ont été divisées aléatoirement en quatre groupes : Témoin, NIR seul, CoFe₂O₄-PQ seul, CoFe₂O₄-PQ + NIR. Les souris des groupes CoFe₂O₄-PQ seul et CoFe₂O₄-PQ + NIR ont reçu une injection intratumorale de 50 μL CoFe₂O₄ (5,0 mg/kg) basée sur un travail antérieur, tandis que Témoin et NIR ont reçu 50 μL PBS. Après injection, le laser NIR 808 nm (1 W/cm²) a été appliqué aux groupes NIR et CoFe₂O₄-PQ + NIR pendant 10 min, monitoré par imagerie thermique infrarouge. Le volume tumoral était enregistré quotidiennement et calculé par V = longueur × largeur²/2. Une fois le diamètre des xénogreffes atteignant ~15 mm, les souris étaient sacrifiées et les tumeurs photographiées et stockées. Tous les protocoles animaux étaient approuvés par le comité IACUC et le comité de bien-être animal de l'Hôpital de l'Université de Pékin à Shenzhen.

Analyse de coloration H&E et immunohistopathologique

Pour l'évaluation pathologique, les xénogreffes tumorales (N = 3) étaient récoltées un jour après traitement dans chaque groupe, fixées dans le formol tamponné 10 %, incluses dans la paraffine pour coloration H&E et détection IHC. Pour l'évaluation de la toxicité in vivo, rein, foie, poumon, cœur et rate étaient extraits et fixés pour évaluation pathologique. Pour la coloration IHC, l'anticorps anti-Ki67 (Abcam ; ab15580) a été utilisé. La quantification de la zone positive IHC a été réalisée par le logiciel Fiji.

Analyse statistique

Pour toutes les expériences, « N » représente le nombre de répétitions ou de souris comme indiqué dans les légendes. Le test t de Student ou l'ANOVA à un facteur a été utilisé pour les comparaisons statistiques. P < 0,05 est considéré significatif, « ns » non significatif. P < 0,05, 0,01, 0,001 indiqués par *, **, ***. Les données ont été analysées avec GraphPad Prism 5.

Résultats

Caractéristiques des nouveaux CoFe₂O₄-PQ

Nous avons construit les CoFe₂O₄-PQ par approche hydrothermale, peu coûteuse et simple. L'image MET (Fig. 1a) montre un motif uniforme et stable avec un diamètre d'environ 3,4 nm (Fig. 1b). Les PQ préparés sont brun foncé (Fig. 1b) avec une excellente solubilité dans l'eau. L'image MET à haute résolution (Fig. 1c) révèle un espacement de réseau de (222) d'environ 0,242 nm, cohérent avec les paramètres cristallins des CoFe₂O₄-PQ. Le spectre élémentaire (Fig. 1d) confirme la composition en Co et Fe, avec un rapport atomique Co/Fe d'environ 1:2. Ces données confirment la construction réussie des CoFe₂O₄-PQ.

Détection des propriétés physiques des CoFe₂O₄-PQ

Pour déterminer les propriétés physiques, plusieurs détections ont été effectuées. Le test d'absorbance NIR montre une conversion photothermique dépendante de la concentration avec des incréments de température (ΔT) ajustables de 0,3 à 18,9 °C (Fig. 2a). À 1,0 mg/mL, en augmentant la puissance NIR de 0,5 à 2,0 W/cm², ΔT varie de 0,8 à 24,3 °C (Fig. 2b). La performance de conversion photothermique dépend donc de la concentration et de la puissance d'irradiation. La stabilité de la conversion photothermique déclenchée par CoFe₂O₄-PQ a été déterminée par irradiation périodique (Fig. 2b). Bien que l'efficacité de conversion lumière-chaleur calculée soit de 7,18 % (Fig. 2d), elle suffit à améliorer l'effet PDT. De plus, la longueur d'onde maximale d'absorption est d'environ 808 nm (Fig. 2e, f). Ensemble, ces données suggèrent que les CoFe₂O₄-PQ pourraient être développés en agent synergique PTT/PDT prometteur pour thérapie antitumorale alternative.

Évaluation de la cytotoxicité des CoFe₂O₄-PQ sur cellules normales

Puisque les nanoparticules sont largement utilisées comme vecteurs de médicaments ou intermédiaires pour thérapies tumorales, la cytotoxicité des CoFe₂O₄-PQ sur cellules normales, surtout cellules épithéliales vasculaires humaines, doit être confirmée. Nous avons testé différentes concentrations (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/mL). Après co-culture avec HUVECs, le réactif CCK-8 a été ajouté pour la viabilité cellulaire. Aucune cytotoxicité évidente n'a été observée vs témoin (Fig. 3a). Un essai d'apoptose a été réalisé dans les mêmes conditions (Fig. 3b). La quantification du taux d'apoptose n'a montré aucune différence significative vs témoin (Fig. 3c). Ces données montrent que les CoFe₂O₄-PQ n'ont pas d'effet toxique apparent sur cellules normales, indiquant leur potentiel comme intermédiaires pour la délivrance de médicaments.

Combinaison NIR et CoFe₂O₄-PQ induit l'apoptose du CPNPC

Pour déterminer la capacité de destruction du CPNPC par CoFe₂O₄-PQ, l'irradiation laser NIR (808 nm) a été combinée à l'incubation de CoFe₂O₄-PQ in vitro. L'essai d'apoptose après traitements a révélé un taux d'apoptose agressif pour H460 et A549 avec la combinaison (Fig. 4a, b). La quantification montre une différence significative vs témoin, tandis que CoFe₂O₄-PQ seul ou NIR seul ne montraient pas de différence, indiquant que CoFe₂O₄-PQ + NIR induit un effet anti-CPNPC (Fig. 4a, b). L'altération du niveau de protéine Bcl-2/Bax est importante pour déterminer l'apoptose. Conformément, les niveaux de Bcl-2 et Bax ont été déterminés dans H460 et A549 après traitements (Fig. 4c, d). Le ratio Bcl-2/Bax a diminué, marqueur de l'apoptose médiée par les mitochondries. Ainsi, CoFe₂O₄-PQ + NIR induit un effet anti-CPNPC en activant la voie d'apoptose médiée par les mitochondries.

Combinaison CoFe₂O₄-PQ et NIR induit la génération de ROS via la voie PI3K/AKT

La dysfonction mitochondriale entraîne une augmentation de la génération ROS, causant la mort cellulaire dans le CPNPC. Nous avons effectué la détection ROS après traitement CoFe₂O₄-PQ + NIR dans H460 et A549. Les résultats montrent une libération massive de ROS dans le groupe combinaison, indiquant un effet PDT accru même avec une faible efficacité de transmission photothermique (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1A, B). De plus, le niveau de protéines de la voie de signalisation PI3K/AKT a également diminué, suggérant que l'altération des ROS est régulée par PI3K/AKT, entraînant l'altération de l'expression Bcl-2/Bax (Fig. 4c, d, Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1C, D). Pour confirmer, l'inhibiteur ROS NAC a été ajouté pour inverser le phénomène (Fig. 5a, b). L'expression de PI3K/AKT a été restaurée après traitement NAC, confirmant que la libération ROS après traitement CoFe₂O₄-PQ + NIR est régulée par PI3K/AKT (Fig. 5c, d). Ces résultats soutiennent fortement l'idée que la combinaison CoFe₂O₄-PQ + NIR mène à un effet synergique PTT/PDT tuant les cellules CPNPC par apoptose dépendante de la dysfonction mitochondriale (ROS).

Évaluation in vivo de l'effet anti-CPNPC de la combinaison CoFe₂O₄-PQ et NIR

Basés sur les résultats in vitro, nous avons étudié l'effet anti-CPNPC de la combinaison CoFe₂O₄-PQ + NIR sur modèle murin xénogreffe. Des souris M-NSG ont été implantées sous-cutanément avec cellules H460. Après injection intratumorale de CoFe₂O₄-PQ, l'irradiation NIR a causé une élévation rapide de température à ~56 °C sous monitorage thermique (Fig. 6a, b). La coloration histopathologique a montré une zone de nécrose extensive dans le groupe combinaison, indiquant la mort cellulaire tumorale par élimination tumorale (Fig. 6c, d). La coloration IHC a montré que la zone positive Ki-67 était agressivement réduite vs autres groupes après traitement combiné, indiquant que les xénogreffes traitées ne proliféraient plus (Fichier supplémentaire 2 : Fig. S2A, B). Nous avons suivi pendant 12 jours après traitement. Comme prévu, la taille et le poids des xénogreffes dans les autres groupes augmentaient remarquablement, mais pas dans le groupe CoFe₂O₄-PQ + NIR (Fig. 6e, f), soutenant que le traitement combiné élimine complètement les xénogreffes in vivo. Quant à l'effet cytotoxique, aucune toxicité évidente n'a été détectée dans les organes majeurs (Fichier supplémentaire 2 : Fig. S2C). Ces données fournissent des preuves solides que les CoFe₂O₄-PQ peuvent être développés comme nouveau réactif PTT/PDT pour le traitement du CPNPC.

Discussion

Ces dernières années, la recherche sur les stratégies anti-CPNPC a réalisé d'énormes progrès. La médecine de précision ciblant les oncogènes mutants addictifs et les thérapies de blocage des points de contrôle immunitaires apportent un avenir prometteur en traitement clinique. Cependant, compte tenu de la complexité et de l'hétérogénéité du microenvironnement tumoral et du risque sous-jacent de perte d'antigène tumoral, il reste un goulot d'étranglement pour réduire le taux de résistance aux médicaments suite au statut d'évasion immunitaire, entraînant une rechute tumorale rapide. Chercher de nouveaux traitements ou intermédiaires pour les thérapies CPNPC est donc urgent. Parmi les approches émergentes, les nanomatériaux sont valorisés comme agents efficaces de destruction cancéreuse. Tirant parti de leur petite taille, bonnes biocompatibilités et capacités de transmission thermique, plusieurs nanomatériaux exercent d'excellentes capacités de destruction cancéreuse.

Dans notre étude, nous avons développé de nouveaux CoFe₂O₄-PQ applicables comme intermédiaires pour traitements CPNPC via induction d'apoptose des cellules tumorales avec effets synergiques PTT/PDT. Comme d'autres nanomatériaux, CoFe₂O₄-PQ a montré d'excellentes biocompatibilités sans toxicité évidente sur cellules normales et organes majeurs. Bien que le taux de transmission thermique ne soit pas aussi élevé que d'autres nanomatériaux, il suffit pour induire l'apoptose des cellules cancéreuses sous activation laser NIR. CoFe₂O₄-PQ montre une bonne relation linéaire avec l'absorbance lumineuse et génère potentiellement des ROS avec le laser NIR, prouvant qu'il peut agir comme photosensibilisateur avantageux. Nous pourrons optimiser la structure ou ajouter des éléments thermosensibles pour atteindre un taux de transmission thermique plus élevé pour de meilleurs effets synergiques PTT/PDT. De plus, l'application de médicaments chimiques ou d'anticorps à la surface des CoFe₂O₄-PQ est faisable, pouvant apporter une efficacité de destruction supérieure. Par exemple, lier des anticorps anti-PDL1 ou anti-CTLA4 aux CoFe₂O₄-PQ pourrait être une thérapie combinatoire prometteuse pour briser le microenvironnement immunosuppresseur intratumoral, notre prochain intérêt pour une utilisation complète des CoFe₂O₄-PQ.

Par ailleurs, le mécanisme de destruction du CPNPC par CoFe₂O₄-PQ a été élucidé. Nous avons confirmé que CoFe₂O₄-PQ induit l'apoptose du CPNPC principalement par sécrétion ROS après activation laser NIR des effets synergiques PDT/PTT. L'excès de ROS cause un stress oxydatif des cellules tumorales et des dommages directs à l'ADN, activant les voies de signalisation en aval, induisant la mort des cellules tumorales. Parmi celles-ci, des preuves croissantes montrent que la voie PI3K/AKT peut être régulée par les ROS cellulaires et mener à la dysfonction mitochondriale. Il est bien admis qu'après activation, AKT est phosphorylé par PI3K et inactiver la protéine pro-apoptotique Bax, protégeant les cellules de l'apoptose. De plus, AKT phosphorylé stabilise le complexe MDM2/p53, régulant la survie cellulaire. Dans ce contexte, le rôle de cette voie dans la sécrétion ROS induite par CoFe₂O₄-PQ a été étudié. Comme prévu, l'excès de ROS causé par CoFe₂O₄-PQ a significativement diminué l'expression des voies PI3K/AKT, causant l'apoptose via activation de Bax et inactivation de Bcl-2. Cette découverte a été confirmée par l'ajout d'inhibiteur ROS, qui a inversé l'expression PI3K/AKT et diminué la production ROS. Comme la voie PI3K/AKT régule la survie et la mort cellulaire, surtout dans les cellules cancéreuses, comprendre ce mécanisme aidera à développer plus d'options pour thérapies combinatoires.

En résumé, pour développer de nouveaux photosensibilisateurs pour thérapie antitumorale alternative, nous avons construit avec succès des CoFe₂O₄-PQ par approche hydrothermale, peu coûteuse et facile. Les CoFe₂O₄-PQ ont une large absorbance NIR, bonne biocompatibilité et capacité de conversion photothermique. De plus, comparés aux PQ précédemment rapportés, CoFe₂O₄-PQ présentent un effet synergique PTT/PDT dans la destruction des tumeurs CPNPC, représentant un agent multifonctionnel prometteur pour les photothérapies futures du CPNPC. De plus, avec l'irradiation NIR, CoFe₂O₄-PQ tue le CPNPC principalement par induction de génération ROS via régulation de l'expression Bcl-2/Bax par la voie de signalisation PI3K/AKT en amont. Quant à la capacité de destruction tumorale in vivo, CoFe₂O₄-PQ combiné au NIR élimine complètement les xénogreffes CPNPC sans effets toxiques évidents. Ces résultats prouvent que CoFe₂O₄-PQ possède des applications prometteuses comme nouveau réactif de destruction du CPNPC.

Conclusion

En somme, les CoFe₂O₄-PQ que nous avons synthétisés présentent des effets synergiques PTT/PDT supérieurs pour supprimer le CPNPC en induisant la génération ROS via la régulation de la voie PI3K/AKT, éclairant la recherche mécanistique et les applications de nouveaux photosensibilisateurs.

Disponibilité des données et matériaux

Les données soutenant les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.