Micelles de points quantiques de silicium conjuguées au CKAP4 : nouvel agent d'imagerie ciblé pour le cancer du poumon

Résumé

Actuellement, divers nanomatériaux fluorescents ont été conçus et synthétisés comme agents de contraste optique pour la navigation chirurgicale. Cependant, il n'existe aucun rapport sur la préparation d'agents de contraste fluorescents pour la navigation en chirurgie du cancer du poumon utilisant des points quantiques de silicium (Si QDs). Cette étude a amélioré et modifié les micelles Si QD dispersibles dans l'eau rapportées par Pi et al. pour préparer des micelles Si QD-CKAP4. Les données montrent que les micelles Si QD-CKAP4 sont des particules sphériques avec un hydrodiamètre moyen d'environ 78,8 nm. L'absorption UV-visible s'étend de 200 à 500 nm. Avec une longueur d'onde d'excitation de 330 nm, une forte fluorescence à 640 nm est observée dans les spectres d'émission. La microscopie confocale laser et la microscopie à fluorescence montrent que les micelles Si QD-CKAP4 présentent une bonne capacité de ciblage des cellules et tissus de cancer du poumon in vitro. L'essai d'imagerie par fluorescence in vivo montre que les micelles Si QD-CKAP4 sont métabolisées par le foie et excrétées par le rein. De plus, elles ciblent spécifiquement le tissu cancéreux du poumon in vivo par rapport au tissu pulmonaire sain. Les essais de cytotoxicité et de coloration hématoxyline-éosine (H&E) montrent une haute biosécurité in vitro et in vivo. Les micelles Si QD-CKAP4 sont un agent d'imagerie ciblé spécifiquement pour le cancer du poumon et devraient devenir un agent de contraste fluorescent pour la navigation chirurgicale du cancer du poumon à l'avenir.

Introduction

Le cancer est l'une des principales maladies menaçant la santé humaine mondialement. Parmi eux, l'incidence et la mortalité du cancer du poumon sont les plus élevées parmi toutes les tumeurs malignes et montrent une tendance croissante chaque année. La résection chirurgicale est le traitement principal des tumeurs solides. Cependant, les méthodes de différenciation tissu malin/tissu sain sont principalement limitées aux indices tactiles et visuels et à l'expérience du chirurgien.

Ces dernières années, la chirurgie guidée par fluorescence est devenue populaire pour le guidage intraopératoire en temps réel de la résection tumorale. Avec un agent de contraste fluorescent et un système d'imagerie par fluorescence, les chirurgiens peuvent utiliser une guidance d'image en temps réel pour résecter les tumeurs primaires et identifier les tumeurs résiduelles dans la cavité opératoire. Comparée aux méthodes d'imagerie biomédicale traditionnelles, l'imagerie par fluorescence offre plusieurs avantages : absence de rayonnement ionisant et haute résolution spatiale.

Actuellement, divers nanomatériaux fluorescents ont été rapportés pour l'imagerie biologique. Parmi eux, les points quantiques de silicium (Si QDs) sont devenus populaires dans l'imagerie biologique. Cependant, il n'existe aucun rapport sur la préparation d'agents de contraste fluorescents pour la navigation en chirurgie du cancer du poumon utilisant des Si QDs.

En 2014, Pi et al. ont rapporté une méthode de synthèse pour des micelles Si QD dispersibles dans l'eau. Les données montraient que les micelles Si QD présentaient des avantages : taille contrôlable, rendement quantique de fluorescence élevé, excellente stabilité lumineuse. Cette étude vise à améliorer et modifier les micelles Si QD hydrosolubles de Pi et al. pour préparer un nouvel agent de contraste fluorescent, destiné à la navigation en chirurgie du cancer du poumon.

En 2018, Yanagita et al. ont rapporté que CKAP4 est hautement exprimé dans le sérum et les tissus cancéreux des patients atteints de cancer du poumon et pourrait servir de nouveau biomarqueur pour le diagnostic précoce. Par conséquent, des micelles Si QD conjuguées à l'anticorps CKAP4 pourraient être un nouvel agent de contraste fluorescent pour la navigation en chirurgie du cancer du poumon.

Dans cette étude, du DSPE-PEG-COOH a été utilisé pour préparer des micelles Si QD avec groupes carboxyl en surface. L'anticorps CKAP4 a ensuite été conjugué aux micelles Si QD par EDC. Les résultats montrent que les micelles Si QD-CKAP4 se dispersent bien en solution aqueuse et présentent une forte fluorescence rouge sous irradiation UV 365 nm. Grâce à la conjugaison d'anticorps, les micelles Si QD-CKAP4 montrent une bonne capacité de ciblage des cellules et tissus de cancer du poumon in vitro et in vivo. De plus, elles présentent une haute biosécurité in vitro et in vivo. Un agent de contraste fluorescent potentiel pour la navigation en chirurgie du cancer du poumon a ainsi été préparé.

Méthodes

Réactifs

Albumine sérique bovine (BSA, ≥98 %, Sigma, USA) ; tétrahydrofurane (THF, 99,9 %, Adamas-beta, Suisse) ; DSPE-PEG-COOH (Aladdin, Chine) ; anticorps CKAP4 (0,55 mg/mL, Abcam, UK) ; milieu DMEM et tampon PBS (Hyclone, USA) ; sérum fœtal bovin (FBS) et trypsine (Gibco, USA) ; paraformaldéhyde (4 %), tampon de perméabilisation pour immunostaining avec Triton X-100 et tampon de blocage (Beyotime, Chine) ; glycérine (≥99 %, Solarbio, Chine) ; trypsine (0,25 %, Kingmorn, Chine).

Instrumentation

MET : JEM-2100F (JEOL, Japon). Hydrodiamètre : Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern, UK). UV-Vis : Cary 50 (Varian, USA). Spectre d'émission fluorescence : F-182 4500 (Hitachi, Japon). XPS : PHI-5000C ESCA (Perkin Elmer, USA). Rendements quantiques photoluminescence (PL QY) : FLS1000 (Edinburgh Instruments, UK). FTIR : Thermo IS50 (Thermo Fisher, USA). XRD : SmartLab (Rigaku, Japon).

Cellules

Lignées A549 et 293 T achetées à l'Institut de Biologie Cellulaire de Shanghai (Chine).

Préparation des micelles Si QD

D'abord, des Si QD dodécyle ont été préparés par réaction d'hydrosilylation et dissous dans THF (15 mg/mL) selon méthode rapportée. Ensuite, 20 mg DSPE-PEG-COOH dissous dans 10 mL eau déionisée (2 mg/mL). La solution de Si QD dodécyle (15 mg/mL, 66 µL) ajoutée goutte à goutte à 10 mL solution DSPE-PEG-COOH. Après agitation ultrasonique 3 min, solution claire obtenue. Placée en hotte, agitée 12 h dans l'obscurité. Dialysée 24 h puis lyophilisée 3 jours pour obtenir les micelles Si QD.

Préparation des micelles Si QD-CKAP4

L'anticorps CKAP4 conjugué aux micelles Si QD par activation du groupe carboxyl par EDC. 4 mg micelles Si QD dispersés dans 900 µL PBS. EDC (10 mg) dans 100 µL PBS. 100 µL solution EDC ajoutée lentement aux 900 µL micelles Si QD, agitation ultrasonique 5 min. 20 µL anticorps CKAP4 ajoutés lentement, mélange agité 2 h à température ambiante dans l'obscurité. Produit ultrafiltré 4000 tr/min 15 min. Après 3 lavages PBS, produit = micelles Si QD-CKAP4.

Test de cytotoxicité

Bleu de trypan pour tester la biosécurité. Cellules A549 et 293 T incubées en plaque 24 puits (1 × 10⁶/puits) à 37 °C 12 h. Après élimination du milieu, séries de concentrations micelles Si QD ou Si QD-CKAP4 (concentration Si : 0–152 µg/mL) ajoutées, incubation 37 °C 2 h. Milieu éliminé, cellules collectées, lavées 2× PBS. Bleu de trypan mélangé à la suspension cellulaire (ratio 1:1). Cellules vivantes/mortes comptées par Countstar. Viabilité (%) = vivantes/(vivantes+mortes) × 100. 3 répétitions biologiques. Analyse statistique : Prism 7.01, ANOVA bilatéral avec test post-hoc Dunnett. Significativité : P < 0,05.

Ciblage des cellules cancéreuses in vitro

Cellules A549 incubées en plats confocaux (3 × 10⁵/plat) 37 °C 12 h. Lavages PBS, fixation paraformaldéhyde 4% (25 °C, 10 min), lavages, perméabilisation Triton X-100 (25 °C, 10 min), lavages, blocage (25 °C, 10 min), lavages. 200 µL micelles Si QD ou Si QD-CKAP4 (Si 150 µg/mL) ajoutés, incubation 37 °C 2 h. Lavages 3× PBS. Photos microscope confocal (Leica) : excitation 405 nm, émission 630 nm.

Cellules 293 T (normales) : même protocole avec centrifugation. 3 expériences indépendantes. Analyse quantitative intensité fluorescence moyenne par ImageJ. Prism 7.01, ANOVA unilatéral avec Dunnett. Significativité P < 0,05.

Modèle souris porteuses de tumeurs

10 souris mâles nues (5–6 semaines) de Shanghai SLAC (Chine). Logées SPF au Centre Animal Expérimental Université Tongji (Shanghai). Modèle tumeur : injection sous-cutanée 1 × 10⁶ cellules A549. Souris utilisées quand diamètre tumeur 6 mm. Expériences selon directives institutionnelles, approuvées par Comité Soins Animaux Université Tongji.

Ciblage tissus cancéreux in vitro

Souris porteuses tumeurs sacrifiées sous anesthésie. Tumeur et tissu pulmonaire normal collectés pour sections paraffine. Après déshydratation, récupération antigène, blocage sérique, incubation micelles Si QD ou Si QD-CKAP4 (Si 150 µg/mL) 37 °C 2 h. Lavages PBS. Coloration DAPI 10 min. Lavages, milieu antifade 25 °C 5 min. Lavages. Photos microscope fluorescence (Nikon) : excitation 405 nm, émission 630 nm. 3 expériences. Analyse quantitative intensité rouge moyenne par ImageJ. Prism 7.01, ANOVA unilatéral Dunnett. P < 0,05.

Imagerie par fluorescence in vivo

9 souris porteuses tumeurs divisées en 3 groupes (injection micelles Si QD-CKAP4, micelles Si QD, sérum physiologique). Groupe Si QD-CKAP4 : injection IV 200 µL (Si 4 mg/kg). Groupe Si QD : 200 µL (Si 4 mg/kg). Groupe sérum : 200 µL sérum. Images fluorescence à différents temps (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 h). Souris groupe Si QD-CKAP4 anesthésiées et euthanasiées à 4 h pour détecter fluorescence cœur, foie, rate, poumon, rein, tumeur. Imagerie : VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Corée) avec filtre PE (λ_ex 450–500 nm, λ_em 600–650 nm). Prism 7.01, ANOVA unilatéral Dunnett. P < 0,05.

Coloration Hématoxyline-Éosine (H&E)

12 souris porteuses tumeurs injectées IV : sérum (200 µL), micelles Si QD (Si 4 mg/kg, 200 µL), ou micelles Si QD-CKAP4 (Si 4 mg/kg, 200 µL). Après 24 h, euthanasie. Coloration H&E sur cœur, foie, rate, poumons, reins. Observation modifications pathologiques par microscopie optique.

Résultats

Préparation et caractérisation des micelles Si QD

Si QD dodécyle préparés par hydrosilylation (Schéma 1, Étape 1). Similaire aux données rapportées, dispersion bonne dans méthylbenzène. MET : sphériques, tailles uniformes. Diamètre 4,1–5,3 nm, moyenne ~4,7 nm (Fig. 1a). Franges de réseau évidentes en image agrandie. Distance interréticulaire moyenne ~0,35 nm (proche 0,34 nm rapporté), bonne cristallinité. DLS : diamètres hydrodynamiques 4,8–13,5 nm, moyenne 6,5 nm (Fig. 1b).

Pour micelles Si QD hydrosolubles, Si QD dodécyle modifiés par auto-assemblage DSPE-PEG-COOH (Schéma 1, Étape 2). DSPE-PEG-COOH utilisé au lieu de F127 pour avoir groupes carboxyl en surface. Résultats : micelles Si QD bien dispersées dans l'eau. MET : particules sphériques avec Si QD insérés. Diamètre 22,7–54,6 nm, moyenne ~34,3 nm (Fig. 1c). DLS : diamètres hydrodynamiques 43,8–615,9 nm, moyenne 58,7 nm (Fig. 1d). Zêta potentiel moyen ~–20,7 mV. FTIR (Suppl. Fig. S1A) : pics vibration étirement N–H (3430), C–H (2920, 2850), O–H (3430), C=O (1640) cm⁻¹ ; vibration flexion C–H (1460), O–H (1400) ; étirement Si–C (1250), C–O (1100), P–O–C (951) ; flexion Si–H (850), O=C–N (526). Groupes caractéristiques DSPE-PEG-COOH et dodécyle-Si QD trouvés, confirmant encapsulation réussie. XRD (Suppl. Fig. S1B) : pic de diffraction net, bonne cristallinité. Pics à 2θ 27,073, 28,451, 56,598, 73,145 correspondent aux plans (100), (002), (112), (203) Si (PDF #80-0005). Pics à 31,692, 45,431, 66,200, 75,260, 83,955 correspondent aux plans NaCl (PDF #77-2064), probablement dus à la dissolution des micelles dans PBS.

UV-Vis : absorption 200–500 nm (Fig. 2a). Excitation 330 nm → forte fluorescence 650 nm (Fig. 2b). Solution aqueuse (Si 80 µg/mL) transparente en lumière naturelle, forte fluorescence rouge sous UV 365 nm (Fig. 2c). Rendement quantique PL absolu (FLS1000, excitation 365 nm) : ~14,49 %.

Préparation et caractérisation des micelles Si QD-CKAP4

Conjugaison anticorps CKAP4 par EDC (Schéma 1, Étape 3). MET : particules sphériques avec Si QD insérés. Diamètre 24,4–67,7 nm, moyenne ~35,5 nm (Fig. 1e). DLS : diamètres hydrodynamiques 58,7–824,9 nm, moyenne 78,8 nm (Fig. 1f), légèrement plus grand que micelles Si QD (augmentation due à conjugaison anticorps). XPS C1s : six types atomes carbone : C(O)O (288,81 eV), C=O (286,5), C–O (285,76), C–N (285,25), C–C (284,88), C–H (284,34) (Fig. 1g). Pic C(O)O quasi disparu dans micelles Si QD-CKAP4 (Fig. 1h), confirmant conjugaison réussie groupes carboxyl/amines primaires. Zêta potentiel moyen ~–10,7 mV (plus élevé que –20,7 mV) : diminution groupes carboxyl en surface par couplage anticorps.

UV-Vis : absorption 200–500 nm (similaire micelles Si QD, Fig. 2a). Excitation 330 nm → fluorescence 640 nm (Fig. 2b). Propriétés fluorescence inchangées par conjugaison anticorps. Solution aqueuse transparente, forte fluorescence rouge sous UV 365 nm (Fig. 2c). PL QY absolu : ~16,96 %.

Test cytotoxicité micelles Si QD-CKAP4 in vitro

Lignées A549 (cancer poumon) et 293 T (épithélial rein) pour biosécurité. Concentrations Si QD et Si QD-CKAP4 (Si 0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76, 152 µg/mL) incubées avec A549 ou 293 T à 37 °C 2 h. Viabilité par bleu de trypan (Fig. 3). ID50 par GraphPad. ID50 micelles Si QD > 152 µg/mL (A549 et 293 T). ID50 micelles Si QD-CKAP4 : 25,94 µg/mL (A549) et 72,69 µg/mL (293 T). Cytotoxicité Si QD-CKAP4 significativement plus élevée que Si QD, et plus élevée sur A549 que 293 T. Phénomène possiblement dû à cytotoxicité dépendante du complément. Si QD-CKAP4 montre sécurité biologique plus élevée sur cellules normales que cancéreuses, base pour application in vivo.

Ciblage cellules cancéreuses in vitro

Cellules A549 et 293 T pour investiguer fonction ciblage micelles Si QD-CKAP4. Incubation 37 °C 2 h. Détection microscopie confocale laser (Fig. 4). Fluorescence rouge micelles Si QD-CKAP4 + A549 significativement > micelles Si QD-CKAP4 + 293 T, micelles Si QD + A549, micelles Si QD + 293 T. Micelles Si QD-CKAP4 ciblent spécifiquement A549 in vitro.

Ciblage tissus cancéreux in vitro

Cellules A549 inoculées sous-cutanément souris. Après formation tumeur, tissus tumeur A549 et poumon normal collectés, incubés micelles Si QD et Si QD-CKAP4 (Si 150 µg/mL) 37 °C 2 h. Détection microscopie confocale (Fig. 5). Tissu A549 + micelles Si QD-CKAP4 : forte fluorescence rouge (excitation 405 nm). Fluorescence faible pour : tissu A549 + micelles Si QD, poumon normal + micelles Si QD-CKAP4, poumon normal + micelles Si QD. Fluorescence rouge significativement plus élevée pour micelles Si QD-CKAP4 + tissu A549 vs autres groupes. Micelles Si QD-CKAPD ciblent efficacement tissus cancer poumon in vitro, agent de contraste fluorescent potentiel.

Imagerie par fluorescence in vivo

9 souris porteuses tumeurs, 3 groupes. Signaux fluorescence significatifs non observés dans tissus cancer poumon chez toutes souris (données non montrées). Possiblement dû à faible pénétration fluorescence micelles Si QD-CKAP4/Si QD.

Souris groupe Si QD-CKAP4 euthanasiées à 4 h pour détection fluorescence cœur, foie, rate, poumon, rein, tumeur. Signal significatif observé dans foie, rein, tumeur. Pas de signal significatif cœur, rate, poumon sain (Fig. 6). Signal foie/rein = métabolisation hépatique, excrétion rénale. Signal tumeur A549 >> poumon sain = capacité ciblage micelles Si QD-CKAP4 tissus cancer poumon. Agent de contraste fluorescent pour navigation chirurgicale cancer poumon futur.

Évaluation biosécurité in vivo

Toxicité aiguë micelles Si QD-CKAP4 in vivo. 12 souris porteuses tumeurs injectées IV : sérum, micelles Si QD (Si 4 mg/kg), ou micelles Si QD-CKAP4 (Si 4 mg/kg). Euthanasie 24 h plus tard. Images H&E cœur, foie, rate, poumons, reins (Fig. 7). Comparé souris sérum : pas de modifications pathologiques évidentes organes majeurs souris micelles Si QD et Si QD-CKAP4. Micelles Si QD (4 mg/kg) et Si QD-CKAP4 (4 mg/kg) : pas de toxicité significative in vivo.

Discussion

Divers nanomatériaux fluorescents conçus comme agents de contraste optique pour navigation chirurgicale. En 2020, On et al. ont préparé nanoparticules de chitosane glycol conjuguées fluorophore (ICG ou Cy5.5) comme agent de contraste pour navigation chirurgie cancer poumon. Mais aucun rapport sur agents utilisant Si QDs.

Cette étude a synthétisé avec succès micelles Si QD-CKAP4 ciblant l'imagerie tissus cancer poumon. Attendu comme agent de contraste optique pour navigation chirurgie cancer poumon. Avantages : (1) Premier agent de contraste pour navigation chirurgie cancer poumon utilisant Si QDs, élargissant la boîte à outils. (2) Optimisation micelles Si QD hydrosolubles de Pi et al. pour ajouter capacité ciblage, nouvelle possibilité application Si QDs biomédical. (3) Ciblage basé sur surexpression protéine CKAP4 dans tissu cancer poumon. Par conjugaison anticorps CKAP4, ciblage actif vs ciblage passif effet EPR des nanomatériaux classiques → spécificité plus forte. (4) Toxicité sélective cellules tumorales dans gamme concentrations spécifique. Haute biosécurité dans gamme concentrations rationnelles, potentiel application clinique.

Tests PL QY : micelles Si QD ~14,49 %, micelles Si QD-CKAP4 ~16,96 %. Pi et al. : PL QY dodécyle-Si QD ~26 % (très élevé pour Si QDs émission rouge pic < 700 nm). PL QY micelles Si QD plus faible que dodécyle-Si QD : possiblement défauts surface introduits pendant émulsion, cohérent avec diminution PL QY micelles Si-QD (dodécyle-Si QD encapsulés dans micelles auto-assemblées F127) chez Pi et al. PL QY micelles Si QD-CKAP4 légèrement > micelles Si QD (16,96 % vs 14,49 %) : couplage anticorps CKAP4 répare certains défauts surface micelles Si QD, légère amélioration PL QY.

Défi connu Si QDs imagerie biologique : Si peu cytotoxique, mais particules Si peuvent devenir cytotoxiques si taille diminue. Ici, tests cytotoxicité : micelles Si QD-CKAP4 cytotoxicité sélective cellules cancer poumon à 9,5–19 µg/mL. Par conjugaison anticorps CKAP4, cytotoxicité sur cellules normales significativement < cellules cancéreuses, condition puissante pour application biologique.

Lignées A549 (p53 wild-type) et 293 T (adhérentes/semi-adhérentes) utilisées. Nombre cellules 293 T diminué par centrifugations/lavages répétés → moins de cellules 293 T visibles Fig. 4. A549 = p53 wild-type → ne reflète pas pleinement capacité ciblage micelles Si QD-CKAP4 sur tous cancers poumon. Études futures sur lignées p53-négatives (ex: H1299) pour base expérimentale solide application clinique.

Conclusions

Cette étude a amélioré et modifié les micelles Si QD de Pi et al. pour préparer des micelles Si QD-CKAP4 hydrosolubles. Particules sphériques, hydrodiamètre moyen ~78,8 nm. Absorption UV-Vis 200–500 nm. Excitation 330 nm → fluorescence forte 640 nm. Bon ciblage cellules et tissus cancer poumon in vitro et in vivo. Imagerie in vivo : métabolisées par foie, excrétées par rein. Ciblent spécifiquement tissu cancer poumon in vivo vs poumon sain. Cytotoxicité et coloration H&E : haute biosécurité in vitro et in vivo. Micelles Si QD-CKAP4 = agent d'imagerie ciblé spécifiquement cancer poumon, attendu comme agent de contraste fluorescent pour navigation chirurgicale cancer poumon futur.