Micelles Si Quantum Dot conjuguées à l'anticorps CKAP4 pour l'imagerie ciblée du cancer du poumon

Introduction

Le cancer est l'une des principales maladies qui menacent la santé humaine dans le monde [1]. Parmi elles, l'incidence et la mortalité du cancer du poumon sont les plus élevées parmi toutes les tumeurs malignes et montrent une tendance à la hausse chaque année [2]. La résection chirurgicale est le traitement principal des tumeurs solides. Cependant, les méthodes de différenciation des tissus malins des tissus sains se limitent principalement aux indices tactiles et visuels et à l'expérience du chirurgien [3].

Ces dernières années, la chirurgie guidée par fluorescence est devenue populaire dans le domaine de la recherche pour le guidage peropératoire en temps réel de la résection tumorale [4]. À l'aide d'un agent de contraste de fluorescence et d'un système d'imagerie par fluorescence, les chirurgiens peuvent utiliser le guidage par image en temps réel pour réséquer les tumeurs primaires et identifier les tumeurs résiduelles dans la cavité opératoire. Par rapport aux méthodes d'imagerie biomédicale traditionnelles, le système d'imagerie par fluorescence offre plusieurs avantages, tels que l'absence de rayonnement ionisant et une haute résolution spatiale [3, 5, 6].

À l'heure actuelle, les chercheurs ont signalé divers nanomatériaux fluorescents pour l'imagerie biologique [7, 8]. Parmi eux, les boîtes quantiques au silicium (Si QD) sont devenues populaires dans le domaine de l'imagerie biologique [9,10,11]. Cependant, il n'existe aucun rapport sur la préparation d'agents de contraste fluorescents pour la navigation chirurgicale du cancer du poumon à l'aide de Si QD.

En 2014, Pi et al. ont rapporté une méthode de synthèse pour de nouvelles micelles Si QD dispersibles dans l'eau [12]. Les données de l'étude ont montré que les micelles Si QD présentaient des avantages, notamment une taille contrôlable, une efficacité quantique de fluorescence élevée et une excellente stabilité à la lumière [12]. Cette étude vise à améliorer et à modifier les micelles Si QD hydrosolubles rapportées par Pi et al. pour préparer un nouvel agent de contraste fluorescent, qui devrait être utilisé comme agent de contraste fluorescent pour la navigation dans la chirurgie du cancer du poumon à l'avenir.

En 2018, Yanagita et al. ont rapporté que CKAP4 est fortement exprimé dans le sérum et les tissus cancéreux des patients atteints de cancer du poumon et qu'il pourrait être utilisé comme nouveau biomarqueur pour le diagnostic précoce du cancer du poumon [13]. Par conséquent, les micelles Si QD conjuguées à l'anticorps CKAP4 pourraient être un nouvel agent de contraste fluorescent, qui pourrait être utilisé comme agent de contraste fluorescent pour la navigation dans la chirurgie du cancer du poumon.

Dans cette étude, DSPE-PEG-COOH a été utilisé pour préparer des micelles Si QD avec des groupes carboxyle sur leurs surfaces. Nous avons ensuite conjugué l'anticorps CKAP4 avec des micelles Si QD en utilisant l'EDC. Les résultats ont montré que les micelles Si QD-CKAP4 se dispersaient bien dans une solution aqueuse. Les micelles Si QD-CKAP4 présentaient une forte fluorescence rouge sous irradiation ultraviolette à 365 nm. En raison de la conjugaison de l'anticorps, les micelles Si QD-CKAP4 ont montré une bonne capacité de ciblage vers les cellules et les tissus cancéreux du poumon à la fois in vitro et in vivo. De plus, les micelles Si QD-CKAP4 présentaient une haute biosécurité à la fois in vitro et in vivo. Dans cette étude, nous avons préparé un agent de contraste fluorescent potentiel pour la navigation dans la chirurgie du cancer du poumon.

Méthodes

Réactifs

L'albumine de sérum bovin (BSA) a été achetée chez Sigma (dosage 98 %; Missouri, USA); tétrahydrofurane (THF) d'Adamas-beta (pureté :99,9 %; Bâle, Suisse); DSPE-PEG-COOH d'Aladdin (Shanghai, Chine); anticorps CKAP4 d'Abcam (0,55 mg/mL ; Cambridge, Royaume-Uni); Milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) et tampon phosphate salin (PBS) de Hyclone (Utah, États-Unis) ; sérum bovin foetal (FBS) et tyrisine de Gibco (New York, USA); paraformaldéhyde (4%), tampon de perméabilisation d'immunocoloration avec Triton X-100 et tampon de blocage pour immunocoloration de Beyotime (Shanghai, Chine); glycérine de Solarbio (pureté ≥ 99%; Pékin, Chine); et trypsine de Kingmorn (0,25 % ; Shanghai, Chine).

Instrumentation

Des images de microscopie électronique à transmission (MET) ont été prises en utilisant la microscopie électronique JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Japon). L'hydrodiamètre a été déterminé en utilisant JEM Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni). Les spectres d'absorption UV-Vis ont été obtenus à l'aide du spectrophotomètre Cary 50 (Varian, Palo Alto, CA, USA). Le spectre d'émission de fluorescence a été obtenu en utilisant le spectrophotomètre F-182 4500 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japon). La spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) a été réalisée en utilisant le système PHI-5000C ESCA amélioré par RBD (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Les rendements quantiques (QY) de photoluminescence (PL) ont été estimés à l'aide d'un spectromètre à fluorescence (FLS1000, Edinburgh Instruments, Livingston, Angleterre). La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) a été réalisée en utilisant Thermo IS50 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). La diffraction des rayons X (XRD) a été testée par SmartLab (Rigaku Corporation, Tokyo, Japon).

Cellules

Les lignées cellulaires A549 et 293 T ont été achetées auprès du Shanghai Institute of Cell Biology (Shanghai, Chine).

Préparation de Si QD Micelles

Tout d'abord, les dodecly-Si QDs ont été préparés par une réaction d'hydrosilylation et dissous dans du THF pour préparer une solution de dodecly-Si QDs (15 mg/mL) selon une méthode précédemment rapportée [12]. Ensuite, 20 mg de DSPE-PEG-COOH ont été dissous et mélangés dans 10 mL d'eau déminéralisée pour préparer une solution de DSPE-PEG-COOH (2 mg/mL, 10 mL). Par la suite, une solution de dodecly-Si QDs (15 mg/mL, 66 µL) a été lentement ajoutée goutte à goutte à une solution de 10 mL de DSPE-PEG-COOH. Après agitation aux ultrasons pendant 3 minutes, une solution claire et transparente a été obtenue. La solution a ensuite été placée sous une hotte et agitée pendant 12 h dans l'obscurité. Par la suite, la solution a été dialysée pendant 24 h puis lyophilisée pendant 3 jours pour obtenir les micelles Si QD.

Préparation de Si QD Micelles-CKAP4

Dans cette étude, l'anticorps CKAP4 a été conjugué avec des micelles Si QD en activant le groupe carboxyle par EDC [14]. La méthode était la suivante :4 mg de micelles de Si QD ont été dispersés dans 900 µL de PBS pour préparer la solution de micelles de Si QD. L'EDC (10 mg) a été ajouté à 100 µL de PBS pour préparer la solution d'EDC. Ensuite, 100 µL de solution d'EDC ont été ajoutés lentement à 900 µL de micelles de Si QD, sous agitation par ultrasons pendant 5 min. De plus, 20 µL d'anticorps CKAP4 ont été ajoutés lentement et le mélange de solution a été agité pendant 2 h à température ambiante dans l'obscurité. Le produit a ensuite été ultrafiltré à 4000 tr/min pendant 15 min. Après trois lavages au PBS, le produit a été appelé Si QD micelles-CKAP4.

Test de cytotoxicité

Dans cette étude, le bleu trypan a été utilisé pour tester la biosécurité des nanomatériaux [15]. Les cellules A549 et 293 T ont été incubées en plaque 24 puits (1 × 10 ⁶ /puits) à 37 °C pendant 12 h. Après avoir jeté le milieu, une série de concentrations de micelles Si QD ou de micelles Si QD-CKAP4 (concentration en Si :0-152 µg/mL) ont été ajoutées à une plaque de 24 puits et incubées à 37 °C pendant 2 h. Après avoir jeté le milieu, les cellules ont été collectées et lavées deux fois avec du PBS. Du bleu trypan a été mélangé à la suspension cellulaire dans un rapport de 1:1. Le nombre de cellules vivantes et mortes a été détecté et enregistré à l'aide de Countstar. Viabilité cellulaire (%) = nombre de cellules vivantes/(nombre de cellules vivantes + nombre de cellules mortes) x 100. Trois réplicats biologiques ont été utilisés. Le logiciel Prism (version 7.01; GraphPad Software, San Diego, CA, USA) a été utilisé pour l'analyse statistique. Les données ont été analysées en utilisant une ANOVA bidirectionnelle avec le post-test de Dunnett. La signification statistique a été fixée à P < 0,05. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; et ***P < 0.001.

Les nanomatériaux ciblent les cellules cancéreuses du poumon in vitro

La capacité de ciblage des micelles Si QD et des micelles Si QD-CKAP4 sur les cellules cancéreuses du poumon in vitro a été détectée comme suit :tout d'abord, les cellules A549 ont été incubées dans des boîtes confocales laser (3 × 10 ⁵ cellules/boîte) à 37 °C pendant 12 h. Après avoir jeté le milieu, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Par la suite, 1 mL de paraformaldéhyde (4 %) a été ajouté aux cellules et incubé à 25 °C pendant 10 min. Après avoir jeté le paraformaldéhyde, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Ensuite, 1 mL de tampon de perméabilisation d'immunocoloration avec Triton X-100 a été ajouté aux cellules et incubé à 25 °C pendant 10 min. Après avoir jeté le tampon de perméabilisation d'immunocoloration avec du Triton X-100, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Par la suite, 1 mL de tampon de blocage pour l'immunocoloration a été ajouté aux cellules et incubé à 25 °C pendant 10 min. Après avoir jeté le tampon de blocage pour l'immunocoloration, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Ensuite, 200 µL de micelles Si QD ou de micelles Si QD-CKAP4 (concentration en Si 150 μg/mL) ont été ajoutés aux cellules et incubées à 37 °C pendant 2 h. Après avoir jeté les nanomatériaux, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Les photographies ont été prises à l'aide d'un microscope confocal laser (Leica, Wetzlar, Allemagne). La lumière d'excitation a été réglée à 405 nm et la longueur d'onde d'émission à 630 nm.

La capacité de ciblage des micelles Si QD et des micelles Si QD-CKAP4 vers les cellules normales in vitro a été détectée comme suit :tout d'abord, 293 cellules T ont été collectées dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL à une densité de 1 × 10 ⁶ cellules/tube. Après centrifugation à 1000 tr/min pendant 5 min, le surnageant a été jeté. Ensuite, 1 ml de paraformaldéhyde (4 %) a été ajouté aux cellules et incubé à température ambiante pendant 10 minutes. Après centrifugation à 1000 tr/min pendant 5 min, le surnageant a été jeté. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS. Ensuite, 1 mL de tampon de perméabilisation d'immunocoloration avec Triton X-100 a été ajouté aux cellules et incubé à 25 °C pendant 10 min. Les cellules ont ensuite été centrifugées à 1000 tr/min pendant 5 min. Après avoir jeté le surnageant, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Ensuite, 1 mL de tampon de blocage pour l'immunocoloration a été ajouté aux cellules et incubé à 25 °C pendant 10 min. Les cellules ont ensuite été centrifugées à 1000 tr/min pendant 5 min. Après avoir jeté le surnageant, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Par la suite, 200 µL de micelles Si QD ou de micelles Si QD-CKAP4 (concentration de Si 150 μg/mL) ont été ajoutés aux cellules et incubées à 37 °C pendant 2 h. Après centrifugation à 1000 tr/min pendant 5 min, le surnageant a été jeté et le sédiment a été lavé trois fois avec du PBS. Les cellules ont été récoltées et des lames de microscope ont été préparées. La microscopie a été réalisée à l'aide d'un microscope confocal laser. La lumière d'excitation a été réglée à 405 nm et la longueur d'onde d'émission à 630 nm.

Trois expériences indépendantes ont été menées. L'analyse quantitative de l'intensité de fluorescence moyenne a été réalisée à l'aide du logiciel ImageJ (Bethesda, MD, USA). Le logiciel Prism (version 7.01) a été utilisé pour l'analyse statistique. Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec le post-test de Dunnett. La signification statistique a été fixée à P < 0,05. ***P < 0.001.

Modèle de souris porteuses de tumeurs

Dix souris nude mâles (âgées de 5 à 6 semaines) ont été achetées auprès de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Toutes les souris ont été hébergées dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques (SPF) au Experimental Animal Center de l'Université de Tongji (Shanghai, Chine). Pour établir le modèle de souris porteuses de tumeurs, des souris ont reçu une injection sous-cutanée de 1 × 10 ⁶ Cellules A549. Des souris porteuses de tumeurs ont été utilisées dans l'expérience lorsque le diamètre de la tumeur a atteint 6 mm. Toutes les expériences sur souris ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et ont été approuvées par le comité institutionnel d'utilisation et de soins des animaux de l'université de Tongji.

Si QD Micelles-CKAP4 ciblant les tissus cancéreux du poumon in vitro

Des souris porteuses de tumeurs ont été sacrifiées sous anesthésie. La tumeur et le tissu pulmonaire normal ont été collectés pour préparer des coupes en paraffine. Après déshydratation, récupération de l'antigène et blocage du sérum, des micelles Si QD ou des micelles Si QD-CKAP4 (concentration de Si 150 µg/mL) ont été ajoutées aux tissus et incubées à 37 °C pendant 2 h. Après avoir jeté les nanomatériaux, les tissus ont été lavés trois fois avec du PBS. Les tissus ont été colorés au 4′, 6-diamidino-2-phényline-dole (DAPI) pendant 10 min. Après trois lavages avec du PBS, un milieu anti-décoloration a été ajouté aux tissus et incubé à 25°C pendant 5 min. Après avoir jeté le milieu antifade, les tissus ont été lavés trois fois avec du PBS. Les photographies ont été prises à l'aide d'un microscope à fluorescence (Nikon, Tokyo, Japon) avec une longueur d'onde d'excitation de 405 nm et une longueur d'onde d'émission de 630 nm. Trois expériences indépendantes ont été menées. Une analyse quantitative de l'intensité moyenne de fluorescence rouge a été réalisée à l'aide du logiciel ImageJ. Le logiciel Prism (version 7.01) a été utilisé pour l'analyse statistique. Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec le post-test de Dunnett. La signification statistique a été fixée à P < 0,05. ***P < 0.001.

Imagerie de fluorescence in vivo

Dans l'expérience, neuf souris porteuses de tumeurs ont été divisées en trois groupes (groupe d'injection de micelles Si QD-CKAP4, groupe d'injection de micelles Si QD et groupe d'injection de solution saline). Les souris du groupe d'injection de micelles Si QD-CKAP4 ont reçu une injection intraveineuse de 200 µL de micelles Si QD-CKAP4 (Si :4 mg/kg). Les souris du groupe d'injection de micelles Si QD ont reçu une injection intraveineuse de 200 µL de micelles Si QD (Si :4 mg/kg). Les souris du groupe injection de solution saline ont reçu une injection intraveineuse de 200 µL de solution saline. Les images de fluorescence ont été acquises à différents moments (0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 et 4 h). Les souris du groupe d'injection de micelles Si QD-CKAP4 ont été anesthésiées et euthanasiées à 4 h pour détecter le signal de fluorescence dans leur cœur, leur foie, leur rate, leurs poumons, leurs reins et leur tumeur. Dans cette étude, l'imagerie par fluorescence a été réalisée à l'aide d'un VISQUE Invivo Smart-LF (VIEWORKS, Gyeonggi-do, Corée) avec un ensemble de filtres PE (λ _excitation 450-500 nm, λ _émission 600-650 nm). Le logiciel Prism (version 7.01) a été utilisé pour l'analyse statistique. Les données ont été analysées à l'aide d'une ANOVA à sens unique avec le post-test de Dunnett. La signification statistique a été fixée à P < 0,05. *P < 0,05 ; **P < 0,01.

Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E)

Dans cette étude, 12 souris porteuses de tumeurs ont reçu une injection de solution saline (200 µL), de micelles Si QD (Si :4 mg/kg, 200 µL) ou de micelles Si QD-CKAP4 (Si :4 mg/kg, 200 µL) par la veine caudale. Après 24 h, les souris ont été euthanasiées. Une coloration H&E a été réalisée sur leur cœur, leur foie, leur rate, leurs poumons et leurs reins. Des changements pathologiques ont été observés par microscopie optique [14, 16].

Résultats

Préparation et caractérisation des micelles Si QD

Tout d'abord, les QD de dodécyl-Si ont été préparés par hydrosilylation selon un rapport publié précédemment (Schéma 1, Étape 1) [12]. Semblable aux données rapportées, les QD de dodécyl-Si synthétisés par notre groupe se sont bien dispersés dans le méthylbenzène [12]. La MET a montré que les QD de dodécyl-Si étaient sphériques avec des tailles relativement uniformes. Les tailles des QD de dodécyl-Si dans les images MET ont été mesurées à l'aide du logiciel ImageJ. Les données ont montré que le diamètre des QD de dodécyl-Si variait de 4,1 à 5,3 nm, avec un diamètre moyen d'environ 4,7 nm (Fig. 1a). Dans les images agrandies des QD dodécyl-Si, des franges de réseau évidentes peuvent être observées (Fig. 1a). Dans cette étude, la distance plane du réseau a été mesurée à l'aide du logiciel ImageJ. Les données ont montré que la distance moyenne entre les franges du réseau est d'environ 0,35 nm, ce qui est presque la même que celle des QD de dodécyl-Si (0,34 nm) précédemment signalés. Par conséquent, les QD de dodécyl-Si synthétisés dans cette étude ont montré une bonne cristallinité [12]. La diffusion dynamique de la lumière (DLS) a montré les diamètres hydrodynamiques des QD de dodécyl-Si allant de 4,8 à 13,5 nm avec une moyenne de 6,5 nm (Fig. 1b).

Schéma de la préparation des micelles Si QD-CKAP4 et de l'imagerie biologique ciblée dans les tissus cancéreux du poumon

un images MET de QD dodécyl-Si ; b distribution hydrodiamétrique des QD dodécyl-Si; c images MET de micelles Si QD; d distribution hydrodiamétrique des micelles Si QD; e images MET de micelles Si QD-CKAP4 ; f distribution hydrodiamétrique des micelles Si QD-CKAP4; g Spectres de spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) C1s de micelles Si QD ; h Spectres XPS C1s des micelles Si QD-CKAP4

Pour préparer des micelles Si QD dispersibles dans l'eau, des QD dodécyl-Si ont été modifiés par auto-assemblage à partir de DSPE-PEG-COOH (Schéma 1, Étape 2) [12]. Ici, DSPE-PEG-COOH a été utilisé au lieu de F127 pour préparer des micelles Si QD avec des groupes carboxyle sur la surface. Les résultats ont montré que les micelles de Si QD se dispersaient bien dans l'eau. Les images MET ont montré que les micelles de Si QD étaient des particules sphériques avec des Si QD insérés. Le diamètre des micelles de Si QD variait de 22,7 à 54,6 nm, avec un diamètre moyen d'environ 34,3 nm (Fig. 1c). Le DLS a montré que les diamètres hydrodynamiques des micelles de Si QD variaient de 43,8 à 615,9 nm, avec une moyenne de 58,7 nm (Fig. 1d). Le potentiel zêta moyen des micelles Si QD était d'environ - 20,7 mV. Dans cette étude, le FTIR a été réalisé pour étudier la composition des micelles Si QD (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1A). Les données ont montré que les pics d'absorption des vibrations d'étirement de N-H, C-H, O-H et C=O étaient à 3430, 2920, 2850 et 1640 cm ⁻¹ , respectivement; les pics d'absorption des vibrations de flexion de C–H et O–H étaient à 1460 et 1400 cm ⁻¹ , respectivement; les pics d'absorption des vibrations d'étirement de Si–C, C–O et P–O–C étaient à 1 250, 1 100 et 951 cm ⁻¹ , respectivement; les pics d'absorption des vibrations de flexion de Si–H et O=C–N étaient à 850 et 526 cm ⁻¹ , respectivement. Ces données montrent que les groupes caractéristiques de DSPE-PEG-COOH (tels que N-H, O-H, C=O, C-O, P-O-C et O=C-N) et les groupes caractéristiques de Des QD de dodécyl-Si (tels que Si–C et Si–H) ont pu être trouvés dans le spectre FTIR des micelles de Si QD, indiquant que les QD de dodécyl-Si ont été encapsulées avec succès dans des micelles auto-assemblées par DSPE-PEG-COOH. De plus, les micelles Si QD ont été caractérisées par XRD (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1B). Le pic de diffraction des micelles Si QD était net, indiquant que la cristallinité des micelles Si QD était bonne. Dans le modèle XRD, les pics à 2θ de 27.073, 28.451, 56.598 et 73.145 correspondent aux plans cristallins (100), (002), (112) et (203) du silicium (PDF # 80-0005), indiquant que les QD Si ont été encapsulés avec succès dans le Si QD micelles. Les pics à 2θ de 31,692, 45,431, 66,200, 75,260 et 83,955 correspondent aux plans cristallins (200), (220), (400), (420) et (422) de NaCl (PDF # 77-2064). Une explication rationnelle de la présence de NaCl dans les micelles de Si QD pourrait être la suivante :après la préparation des micelles de Si QD, nous avons dissous les micelles de Si QD dans du PBS, ce qui a conduit à la présence de NaCl dans les micelles de Si QD.

Le spectre d'absorption UV-visible a montré que l'absorption des micelles de Si QD variait de 200 à 500 nm (Fig. 2a). Avec une longueur d'onde d'excitation de 330 nm, une forte fluorescence à 650 nm a été observée dans les spectres d'émission de fluorescence des micelles Si QD (Fig. 2b). La solution aqueuse de micelles Si QD (concentration en Si :80 µg/mL) était transparente et limpide à la lumière naturelle ; cependant, il a émis une forte fluorescence rouge sous une lumière UV de 365 nm (Fig. 2c). Dans cette étude, les QY PL absolus ont été testés à l'aide d'un spectromètre à fluorescence (FLS1000). La longueur d'onde d'excitation était de 365 nm. Les données ont montré que le PL QY absolu des micelles Si QD était d'environ 14,49 %.

un Spectre d'absorption UV-visible des micelles Si QD et des micelles Si QD-CKAP4 ; b spectre d'émission de fluorescence des micelles Si QD et des micelles Si QD-CKAP4; c images de micelles Si QD et de micelles Si QD-CKAP4 exposées à la lumière naturelle (à gauche) et à la lumière UV de 365 nm (à droite)

Préparation et caractérisation des Si QD Micelles-CKAP4

Nous avons conjugué l'anticorps CKAP4 avec des micelles Si QD en utilisant l'EDC (Schéma 1, Étape 3) [14]. Les images MET ont montré que les micelles Si QD-CKAP4 étaient des particules sphériques avec des Si QD insérés. Le diamètre des micelles Si QD-CKAP4 variait de 24,4 à 67,7 nm, avec un diamètre moyen d'environ 35,5 nm (Fig. 1e). Le DLS a montré que les diamètres hydrodynamiques des micelles Si QD-CKAP4 variaient de 58,7 à 824,9 nm avec une moyenne de 78,8 nm, ce qui était légèrement supérieur à celui des micelles Si QD (Fig. 1f). Cette augmentation peut être due à la conjugaison de l'anticorps CKAP4. Les spectres C1s XPS ont montré six types d'atomes de carbone dans la région C1s :C(O)O (288,81 eV), C=O (286,5 eV), C–O (285,76 eV), C–N (285,25 eV), C –C (284,88 eV) et C–H (284,34 eV) (Fig. 1g). Cependant, le pic de C(O)O a presque disparu dans les spectres XPS des micelles Si QD-CKAP4, indiquant que la conjugaison entre les groupes carboxyle et les amines primaires était réussie; par conséquent, l'anticorps CKAP4 a été conjugué avec succès avec les micelles Si QD (Fig. 1h). Le potentiel zêta moyen des micelles Si QD-CKAP4 était d'environ - 10,7 mV, supérieur à celui des micelles Si QD. L'explication du phénomène ci-dessus pourrait être la suivante :il existe de nombreux groupes carboxyle à la surface des micelles de Si QD; par conséquent, les micelles de Si QD présentaient une forte électricité négative. Cependant, dans les micelles Si QD-CKAP4, le couplage de l'anticorps CKAP4 a conduit à la diminution des groupes carboxyle à la surface des micelles Si QD-CKAP4; par conséquent, le potentiel zêta moyen des micelles Si QD-CKAP4 a augmenté.

Le spectre d'absorption UV-visible a montré que l'absorption des micelles Si QD-CKAP4 variait de 200 à 500 nm, similaire au résultat des micelles Si QD (Fig. 2a). Avec une longueur d'onde d'excitation de 330 nm, une forte fluorescence à 640 nm a été observée à partir des micelles Si QD-CKAP4 dans les spectres d'émission de fluorescence (Fig. 2b). Ces résultats ont indiqué que la conjugaison d'anticorps n'exerçait aucune influence significative sur les propriétés de fluorescence des micelles Si QD-CKAP4. La solution aqueuse de Si QD micelles-CKAP4 (concentration en Si :80 µg/mL) était transparente et limpide à la lumière naturelle. Sous une lumière UV de 365 nm, il pourrait émettre une forte fluorescence rouge, cohérent avec les résultats des micelles Si QD (Fig. 2c). Les tests PL QY ont montré que le PL QY absolu des micelles Si QD-CKAP4 était d'environ 16,96 %.

Test de cytotoxicité de Si QD Micelles-CKAP4 In Vitro

La lignée cellulaire de cancer du poumon humain A549 et la lignée cellulaire épithéliale rénale humaine 293 T ont été utilisées comme cellules cibles pour étudier la biosécurité des micelles Si QD et des micelles Si QD-CKAP4. Dans cette étude, différentes concentrations de micelles Si QD et de micelles Si QD-CKAP4 (concentration en Si 0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 et 152 µg/mL) ont d'abord été incubées avec des cellules A549 ou 293 T à 37 °C pendant 2 h. La viabilité cellulaire a été détectée à l'aide de bleu trypan (Fig. 3) [15]. La DI50 des micelles Si QD et des micelles Si QD-CKAP4 a été obtenue à l'aide du logiciel GraphPad. Les données ont montré que la DI50 des micelles Si QD était supérieure à 152 µg/mL dans les cellules A549 et 293 T. La DI50 des micelles Si QD-CKAP4 était de 25,94 µg/mL dans les cellules A549 et de 72,69 µg/mL dans les cellules 293 T. Ces résultats ont indiqué que la cytotoxicité des micelles Si QD-CKAP4 était significativement plus élevée que celle des micelles Si QD et que la cytotoxicité des micelles Si QD-CKAP4 dans les cellules A549 était significativement plus élevée que celle des cellules T 293. Ce phénomène peut être dû à une cytotoxicité dépendante du complément [17]. En outre, ces résultats ont également indiqué que les micelles Si QD-CKAP4 présentaient une sécurité biologique plus élevée dans les cellules normales que dans les cellules cancéreuses du poumon, ce qui a jeté les bases de son application in vivo.

Viabilité cellulaire de A549 a et 293 T b incubé avec différentes concentrations de micelles Si QD et de micelles Si QD-CKAP4 (concentration en Si :0, 2,375, 4,75, 9,5, 19, 38, 76 et 152 µg/mL) pendant 2 h (n = 3; signifie  ± SD; ANOVA bidirectionnelle avec le post-test de Dunnett ; *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; et ***P < 0.001)

Si QD Micelles-CKAP4 ciblant les cellules cancéreuses du poumon in vitro

Pour étudier plus avant la fonction de ciblage des micelles Si QD-CKAP4 dans les cellules cancéreuses du poumon in vitro, les cellules A549 et 293 T ont été utilisées comme cellules cibles. Les micelles Si QD et les micelles Si QD-CKAP4 ont d'abord été incubées avec des cellules A549 et 293 T à 37 °C pendant 2 h. L'effet de ciblage a été détecté par microscopie confocale laser (Fig. 4). Les résultats ont montré que la fluorescence rouge dans les micelles Si QD-CKAP4 incubées A549 était significativement plus élevée que celle des micelles Si QD-CKAP4 et du groupe de co-incubation 293 T, des micelles Si QD et du groupe de co-incubation A549, et des micelles Si QD et 293 T groupe de co-incubation. Ces résultats ont indiqué que les micelles Si QD-CKAP4 pourraient cibler spécifiquement les cellules A549 in vitro.

Détection de la capacité des micelles Si QD-CKAP4 à cibler les cellules A549 in vitro. un A549 et 293 T ont été incubés avec des micelles Si QD-CKAP4 et des micelles Si QD (concentration de Si 150 µg/ml) à 37 ℃ pendant 2 h. Après avoir jeté le surnageant et lavé deux fois, les cellules ont été photographiées au microscope confocal à balayage laser (Bar, 25 µm). b Une analyse quantitative de l'intensité fluorescente moyenne a été mesurée par ImageJ (n = 3; signifie  ± SD; ANOVA à sens unique avec le post-test de Dunnett ; ***P < 0.001)

Si QD Micelles-CKAP4 ciblant les tissus cancéreux du poumon in vitro

Pour explorer la possibilité que les micelles Si QD-CKAP4 ciblent les tissus cancéreux du poumon, nous avons conçu une expérience in vitro pour vérifier la propriété de ciblage des micelles Si QD-CKAP4 à A549. Dans cette étude, des cellules A549 ont été inoculées par voie sous-cutanée à des souris. Après la formation de la tumeur, les tissus tumoraux A549 et les tissus pulmonaires normaux ont été collectés et incubés avec des micelles Si QD et des micelles Si QD-CKAP4 à 37 °C pendant 2 h. L'effet de ciblage a été détecté par microscopie confocale laser (Fig. 5). Les résultats ont montré que le tissu A549 incubé avec des micelles Si QD-CKAP4 pouvait émettre une forte fluorescence rouge à une longueur d'onde d'excitation de 405 nm. Cependant, seule une faible fluorescence rouge a été observée dans les tissus A549 incubés avec des micelles Si QD, des tissus pulmonaires normaux incubés avec des micelles Si QD-CKAP4 et des tissus pulmonaires normaux incubés avec des micelles Si QD. La fluorescence rouge dans les tissus A549 incubés avec des micelles Si QD-CKAP4 était significativement plus élevée que celle des tissus A549 incubés avec des micelles Si QD, des tissus pulmonaires normaux incubés avec des micelles Si QD-CKAP4 et des tissus pulmonaires normaux incubés avec des micelles Si QD. Ces données indiquent que les micelles Si QD-CKAP4 pourraient cibler efficacement les tissus du cancer du poumon in vitro, ce qui est censé être un agent de contraste fluorescent potentiel pour le cancer du poumon.

Détection de la capacité des micelles Si QD-CKAP4 à cibler le tissu A549 in vitro. un Le tissu A549 et le tissu pulmonaire normal ont été cultivés avec des micelles Si QD-CKAP4 et des micelles Si QD (concentration de Si :150 ug/ml) à 37 ℃ pendant 2 h. Après deux lavages, les tissus ont été colorés avec du DAPI pour visualiser le noyau. Les tissus ont été photographiés au microscope confocal à balayage laser (Bar, 200 µm). b Une analyse quantitative de l'intensité moyenne de fluorescence rouge a été mesurée par ImageJ (n = 3; signifie  ± SD; ANOVA à sens unique avec le post-test de Dunnett ; ***P < 0.001)

Imagerie de fluorescence in vivo

Nine tumor-bearing mice were divided into three groups (Si QD micelles-CKAP4 injection group, Si QD micelles injection group, and saline injection group). Mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were intravenously injected with 200 µL Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg). Mice in the Si QD micelle injection group were intravenously injected with 200 µL of Si QD micelles (Si:4 mg/kg). Mice in the saline injection group were intravenously injected with 200 µL saline. Fluorescence images were acquired at different time points (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, and 4 h). The significant fluorescence signals were not observed in lung cancer tissues among all the mice in the three groups (data not shown). This might be because of the weak fluorescence penetration of the Si QD micelles-CKAP4 and Si QD micelles.

The mice in the Si QD micelles-CKAP4 injection group were anesthetized and euthanized at 4 h to detect the fluorescence signal in their heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor. Data showed that a significant fluorescence signal could be observed in the liver, kidney, and tumor tissues. However, there was no significant fluorescence signal in the heart, spleen, or healthy lung tissues (Fig. 6). The significant fluorescence signal in the liver and kidney indicated that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. In addition, the fluorescence signal in A549 tumor tissues was significantly higher than that in healthy lung tissues. This phenomenon contributed to the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer tissues. These results indicate that Si QD micelles-CKAP4 specifically targets lung cancer tissue, which is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

un Bright photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. b Fluorescence photograph of the heart, liver, spleen, lung, kidney, and tumor in Si QD micelles-CKAP4 injected mice. c Relative fluorescence intensities of heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor tissue (n = 3; mean ± SD; one-way ANOVA with Dunnett’s post test; *P < 0.05; **P  < 0.01)

Biosafety Evaluation of Si QD Micelles-CKAP4 In Vivo

Finally, we investigated the acute toxicity of the Si QD micelles-CKAP4 in vivo. In this study, tumor-bearing mice (n  = 12) were intravenously injected with saline (200 µL), Si QD micelles (Si:4 mg/kg, 200 µL), or Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg, 200 µL) and then euthanized 24 h later. H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys are shown in Fig. 7. Compared with saline-injected mice, there were no evident pathological changes in the major organs of Si QD micelles-injected mice and Si QD micelles-CKAP4-injected mice. The above data indicated that Si QD micelles (Si:4 mg/kg) and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) showed no significant toxicity in vivo.

H&E staining images of the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys in tumor-bearing mice injected with saline, Si QD micelles (Si:4 mg/kg), and Si QD micelles-CKAP4 (Si:4 mg/kg) for 24 h (magnification:200×)

Discussion

At present, various fluorescent nanomaterials have been designed and synthesized as optical contrast agents for surgical navigation [3, 4]. In 2020, On et al. prepared fluorophore [indocyanine green (ICG) or cyanine 5.5 (Cy5.5)]-conjugated glycol chitosan nanoparticles (CNPs) as a fluorescent contrast agent in lung cancer surgery navigation [18]. However, there are no reports on the preparation of fluorescent contrast agents for lung cancer surgery navigation using Si QDs.

This study successfully synthesized Si QD micelles-CKAP4, which could target the imaging of lung cancer tissues. Si QD micelles-CKAP4 is expected to be used as an optical contrast agent for navigation in lung cancer surgery in the future. The advantages of Si QD micelles-CKAP4 are as follows:(1) We synthesized a fluorescent contrast agent for lung cancer surgery navigation using Si QDs for the first time, which expands the toolbox of the lung cancer surgery navigation tool library. (2) This study optimized water-dispersible Si QD micelles reported by Pi et al. to add targeting ability to Si QD micelles [12]. Thus, it provides a new possibility for applying Si QDs in the biomedical field. (3) The principle of Si QD micelles-CKAP4 targeting lung cancer is based on the high expression of CKAP4 protein in lung cancer tissue. Owing to the conjugation of CKAP4 antibody, Si QD micelles-CKAP4 could actively target lung cancer tissue. Compared with the nanomaterials that passively target tumors via the EPR effect, Si QD micelles-CKAP4 showed stronger specificity to lung cancer tissue. (4) Si QD micelles-CKAP4 showed selective toxicity to tumor cells in a specific range of concentrations. Therefore, Si QD micelles-CKAP4 showed high biological safety in the range of rational drug concentrations, which exhibited its potential clinical application value.

In this study, PL QY tests showed that the absolute PL QY of Si QD micelles was approximately 14.49% and the absolute PL QY of the Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%. A study by Pi et al. showed that the PL QY of dodecyl-Si QDs was approximately 26%, which was very high for Si QDs that emit red light with a PL peak at less than 700 nm [12, 19, 20]. However, the PL QY of the Si QD micelles in this study was approximately 14.49%, which was lower than that of dodecyl-Si QDs. This might be because of the surface defects introduced during the emulsion process, which was nearly consistent with the decrease in PL QY in Si-QD micelles (dodecyl-passivated Si QDs were encapsulated in the micelles self-assembled from F127 in the emulsion) in the study reported by Pi et al. [12, 21]. In this study, the PL QY of Si QD micelles-CKAP4 was approximately 16.96%, which was slightly higher than that of Si QD micelles (14.49%). This could be because in the Si QD micelles-CKAP4, the coupling of the CKAP4 antibody repaired some surface defects of the Si QD micelles, leading to a slight enhancement of the PL QY.

As we all know, there is a challenge in Si QDs biological imaging applications:Although Si exhibits little cytotoxicity, Si particles may exhibit cytotoxicity as the size decrease to a certain extent. In this study, cytotoxicity tests showed that Si QD micelles-CKAP4 exhibited selective cytotoxicity to lung cancer cells at 9.5–19 µg/mL. Therefore, as a result of CKAP4 antibody conjugation, the cytotoxicity of Si QD micelles-CKAP4 to normal cells was significantly less than that of lung cancer cells, which provides a powerful condition for the biological application of Si QD micelles-CKAP4.

In this study, human lung cancer cell line A549 and human renal epithelial cell line 293 T were used as target cells to investigate the targeting ability of Si QD micelles and Si QD micelles-CKAP4. A549 and 293 T cells were adherent and semi-adherent, respectively. During the experiment, the number of 293 T cells decreased because of repeated centrifugation and washing. Therefore, as shown in Fig. 4, the number of 293 T cells was lower than that of A549 cells.

In addition, it should be noted that A549 cells belong to the p53 wild-type lung cancer cell line. Therefore, only A549 cells cannot fully reflect the targeting ability of the Si QD micelles-CKAP4 to lung cancer. Further studies will be conducted to test the targeting ability and imaging effect of Si QD micelles-CKAP4 on p53-negative cell lines (such as H1299) to provide a solid experimental basis for the clinical application of Si QD micelles-CKAP4 [22].

Conclusions

This study improved and modified the Si QD micelles reported by Pi et al. to prepare water-dispersible Si QD micelles-CKAP4. Si QD micelles-CKAP4 were spherical particles with a mean hydrodiameter of approximately 78.8 nm. UV–visible absorption of the Si QD micelles-CKAP4 ranged from 200 to 500 nm. With an excitation wavelength of 330 nm, strong fluorescence at 640 nm was observed in the fluorescence emission spectra. Si QD micelles-CKAP4 exhibited good targeting ability to lung cancer cells and lung cancer tissues both in vitro and in vivo. In addition, the in vivo fluorescence-imaging assay further showed that the Si QD micelles-CKAP4 was metabolized by the liver and excreted by the kidney. Cytotoxicity and H&E staining assays showed that the Si QD micelles-CKAP4 exhibited high biosafety both in vitro and in vivo. Si QD micelles-CKAP4 is a specifically targeted imaging agent for lung cancer and is expected to be a fluorescent contrast agent for lung cancer surgical navigation in the future.

Disponibilité des données et des matériaux

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Abréviations

Si QD:

Si quantum dot

Si QD micelles-CKAP4:

CKAP4 antibody-conjugated Si quantum dot micelles

Dodecyl-Si QDs:

Dodecyl-passivated Si QDs

BSA :

Sérum albumine bovine

THF :

Tétrahydrofurane

DMEM:

Dulbecco’s modified eagle’s medium

PBS :

Tampon phosphate salin

FBS :

Sérum fœtal bovin

TEM :

Microscopie électronique à transmission

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

XRD :

Diffraction des rayons X

SPF:

Specific pathogen free

DAPI:

4′, 6-Diamidino-2-phenylin-dole

H&E:

Hematoxylin and eosin