Nanoparticules multifonctionnelles activées par ultrasons : une plateforme innovante pour l'imagerie et la thérapie synergique du cancer du sein métastatique

Résumé

La métastase du cancer du sein est considérée comme ayant un effet négatif sur son pronostic. Bénéficiant de caractéristiques remarquables de pénétration profonde et de non-invasivité, la thérapie sonodynamique (SDT) démontre un potentiel considérable pour le traitement du cancer. Pour surmonter les limites de la monothérapie, une nanoplatforme multifonctionnelle a été explorée afin de réaliser une efficacité thérapeutique synergique. Nous avons mis au point un nouveau nanosystème multifonctionnel encapsulant la chlorine e6 (Ce6, pour la SDT), le perfluoropentane (PFP, pour l'imagerie ultrasonore) et le docétaxel (DTX, pour la chimiothérapie) dans une structure cœur-coquille PLGA bien conçue. Les nanoparticules synergiques Ce6/PFP/DTX/PLGA (NPs CPDP), dotées d'une excellente biocompatibilité et stabilité, permettent leur application ultérieure. Sous irradiation par ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU), une imagerie ultrasonore améliorée a été révélée à la fois in vitro et in vivo. Plus important encore, combinées au LIFU, les nanoparticules présentent une capacité antitumorale intrigante grâce aux espèces réactives de l'oxygène (ROS) cytotoxiques induites par la Ce6 ainsi que la libération de DTX pour générer une efficacité thérapeutique concertée. En outre, cette stratégie thérapeutique active une forte capacité anti-métastatique par laquelle les nodules métastatiques pulmonaires ont été significativement réduits. Les résultats indiquent que la nanoplatforme orientée SDT combinée à la chimiothérapie pourrait être une approche prometteuse pour améliorer la thérapie synergique efficace et supprimer la métastase pulmonaire du cancer du sein.

Introduction

Le cancer du sein hante les femmes depuis des années comme l'une des tumeurs malignes les plus menaçantes. En raison de son hétérogénéité élevée et de sa forte capacité métastatique, il est rapporté que la métastase à distance du cancer du sein représente plus de 90 % de sa mortalité, alors que le taux de survie à 5 ans des patientes à un stade avancé ou métastasé n'est que de 26 %, entraînant un pronostic clinique défavorable [1-3]. La caractérisation négative du cancer du sein le rend difficile à guérir complètement, poussant la stratégie thérapeutique à être plus complexe pour éliminer à la fois la tumeur primitive et la métastase à distance.

Les approches thérapeutiques traditionnelles telles que la chirurgie et la chimiothérapie sont encore considérées comme efficaces pour traiter le cancer du sein [4]. Parmi tous les agents chimiothérapeutiques, le docétaxel (DTX) joue un rôle significatif dans le traitement du cancer du sein métastatique (CSM) et du cancer du sein avancé (CSA) [5]. En tant que premier médicament antitumoral synthétisé à partir de substances chimiques de l'if, l'effet antitumoral du DTX est principalement obtenu en détruisant la mitose et la prolifération cellulaire [6]. En raison de son efficacité antitumorale étendue, le DTX devient l'un des agents chimiothérapeutiques les plus efficaces pour traiter le cancer du sein [7]. Cependant, les agents chimiothérapeutiques induisent généralement des effets indésirables et une toxicité systémique, qui limitent grandement l'efficacité thérapeutique [8]. De plus, les différents stades cliniques et conditions personnelles révèlent qu'une seule approche thérapeutique peut ne pas être suffisamment efficace pour répondre à toutes les attentes dans le traitement du cancer du sein. Il existe donc un besoin urgent de limiter les effets secondaires toxiques et d'améliorer l'efficacité thérapeutique du DTX pour les applications futures.

Les ultrasons ont d'abord été explorés dans le diagnostic clinique en raison de leurs avantages extraordinaires tels que l'absence de rayonnement, la non-invasivité et la rentabilité [9, 10]. Malgré ces caractéristiques uniques, ils ont également suscité beaucoup d'intérêt dans les perspectives thérapeutiques basées sur des matériaux nanostructurés [11]. La thérapie sonodynamique a été initialement réalisée par la cavitation et l'« effet sonoporation » déclenchés par les ultrasons. La génération de ROS pendant ce processus induit une cytotoxicité efficace向 les cellules cancéreuses, conduisant à un endommagement rapide de l'ADN et à l'apoptose des cellules tumorales [9]. Contrairement à l'emploi superficiel de la thérapie photodynamique (PDT), la SDT obtient un résultat thérapeutique plus favorable dans le traitement des tumeurs profondes par ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU), ce qui permet d'éviter les lésions thermiques indésirables pendant le traitement [12, 13]. En tant qu'élément essentiel de la SDT, les sonosensibilisateurs ont été explorés dans diverses thérapies tumorales [14]. La chlorin e6 (Ce6) était à l'origine utilisée comme photosensibilisateur courant, mais sa capacité thérapeutique désirable et son excellente affinité pour le tissu tumoral l'ont rendue capable d'être également appliquée comme sonosensibilisateur [15]. En tant que membre de la deuxième génération de la famille des chlorines, la Ce6 a suscité une grande attention dans le traitement des tumeurs pour sa génération désirable de ROS [16]. Cependant, l'application unique de la Ce6 a constamment soulevé des problèmes d'instabilité et de toxicité cutanée indésirable, qui ont tous limité l'exploration extensive de la SDT.

Ces dernières années, le développement de la nanotechnologie a joué un rôle très important dans de nombreux domaines, y compris la biosensorisation, la pollution environnementale et la dégradation des contaminants [17-23]. Les nanoparticules basées sur la nanotechnologie présentent de nombreux avantages, tels qu'un diamètre plus petit, une surface externe plus grande et une résistance à la diffusion interne plus faible [24]. Auparavant, les nanoparticules ont été impliquées dans l'application de divers matériaux tels que les MOF [25], le dioxyde de titane [26] et le graphène [21]. La tendance croissante rapide de la nanotechnologie combinée au traitement du cancer a également été largement explorée, ouvrant une voie réalisable pour promouvoir une stratégie thérapeutique combinée [27]. Pour réaliser des applications thérapeutiques tumorales efficaces, les nanoparticules finement conçues sont principalement conçues pour améliorer l'efficacité du transport des agents chimiothérapeutiques toxiques via l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR), permettant une accumulation accrue au site tumoral [28, 29]. De plus, les effets secondaires indésirables pourraient également être réduits par l'encapsulation de la chimiothérapie. Il a été rapporté que le perfluoropentane (PFP) possède une capacité exceptionnelle de transformation de phase liquide à phase gazeuse sous irradiation, ce qui pourrait être appliqué comme une nouvelle sonde moléculaire ultrasonore, en particulier dans l'imagerie et le traitement ultrasonores [30]. Plus important encore, la phase liquide initiale permet au PFP d'être facilement encapsulé dans divers matériaux [31]. En outre, l'encapsulation du PFP peut grandement améliorer la capacité d'imagerie ultrasonore au site tumoral selon l'effet EPR mentionné ci-dessus et éviter la limitation de taille provoquée par des microbulles micrométriques plus grandes. Outre l'imagerie tumorale, la combinaison de multiples approches thérapeutiques est d'une valeur énorme dans le traitement du cancer orienté nanosystème. Plus précisément, des pratiques incluant l'intégration de la thérapie sonodynamique et de la chimiothérapie ont mis l'accent sur la révolution des efficacités thérapeutiques traditionnelles. Xu et al. [32] ont démontré que, grâce à la SDT, un résultat thérapeutique amélioré pouvait être révélé avec des médicaments de chimiothérapie et conduisait ainsi à l'activation de l'apoptose des cellules tumorales ciblant les mitochondries. Ce modèle dévoile la thérapie synergique, qui est hautement concernée dans l'utilisation future.

Ainsi, avec les inspirations mentionnées ci-dessus, nous avons l'intention d'utiliser les nanoparticules tout-en-un (NPs CPDP) pour établir un système diagnostique et thérapeutique, réalisé par la thérapie synergique orientée SDT combinée à la chimiothérapie, ainsi que l'imagerie ultrasonore améliorée. En raison de l'excellente sécurité et de la stabilité métabolique idéale en tant que nanovecteur désirable, le PLGA s'est avéré favorable pour explorer diverses capacités antitumorales [33, 34]. Ainsi, dans cette stratégie, en utilisant le PLGA comme matériau de couche externe, le PFP pourrait améliorer significativement l'imagerie ultrasonore grâce à sa capacité de changement de phase déclenchée par le LIFU, tandis que la Ce6, un sonosensibilisable de deuxième génération désirable, pourrait également être exposée au LIFU pour induire la génération de ROS. De plus, accompagnés de la libération de DTX, la chimiothérapie et la SDT seront réalisées pour atteindre une thérapie synergique ultime. Il est important de noter que la structure cœur-coquille des NPs CPDP peut être administrée de manière stable sans endommager les tissus ou cellules normaux et permet également aux nanoparticules d'avoir une efficacité d'encapsulation relativement plus élevée [35]. De plus, les contenus peuvent être bien protégés dans cette structure cœur-coquille [36-38], en particulier pour le PFP, qui peut être efficacement transformé de liquide en gaz grâce à l'existence de la structure. En utilisant cette structure cœur-coquille, la stratégie synergique pourrait être démontrée simultanément de manière plus stable. Premièrement, la stratégie synergique aide à réduire significativement l'effet secondaire du DTX par une encapsulation efficace, ce qui est d'une grande importance pour soulager la souffrance dans le traitement des tumeurs malignes et agressives ; deuxièmement, par rapport à la chimiothérapie seule, la combinaison de la SDT et de la chimiothérapie a été vérifiée comme une stratégie prometteuse pour renforcer l'efficacité thérapeutique. Troisièmement, l'imagerie ultrasonore améliorée réalisée par le PFP a optimisé la stratégie diagnostique et a également aidé à vérifier l'efficacité antitumorale. Enfin, l'ensemble du système est sûr et stable avec une excellente biocompatibilité. Il est souligné que dans cette stratégie, la métastase pulmonaire ainsi que la croissance tumorale ont été remarquablement inhibées à la fois in vitro et in vivo. En conclusion, la stratégie synergique a démontré une efficacité de traitement productive contre la tumeur maligne du sein et sa métastase à distance, et combinée à sa capacité d'imagerie ultrasonore, elle pourrait devenir une stratégie thérapeutique prometteuse pour une application clinique ultérieure.

Matériaux et méthodes

Matériaux

PLGA-COOH (Mw 12 000 Da) a été acheté chez Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (Jinan, Chine). Le perfluoropentane (PFP) et l'agarose ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO). La chlorin e6 (Ce6) a été achetée chez Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (Dalian, Chine). Le kit de test de cytotoxicité Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a été obtenu auprès de Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Japon). Le 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacétate (H2DCFDA) a été acheté chez MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, USA). L'iodure de propidium (PI) a été obtenu auprès de Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (Pékin, Chine). L'annexine V-FITC/PI a été obtenu auprès de BD Biosciences (USA). Le docétaxel (DTX) a été acheté chez MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, USA). Tous les autres réactifs étaient des produits analytiques purs sans purification supplémentaire. Le milieu Roswell Park Memorial Institute 1640 (DMEM), le sérum bovin fœtal et la trypsine ont été achetés chez Gibco (ThermoFisher Scientific, USA) et le spectrophotomètre UV (UV-Vis, Hitachi, Japon).

Synthèse des NPs CPDP

Les nanoparticules Ce6-PFP-DTX/PLGA (NPs CPDP) ont été préparées par une méthode d'émulsion double W/O/W selon un rapport antérieur [39, 40]. Brièvement, 2 mg de Ce6 ont d'abord été dissous dans 500 μL de méthanol. Ensuite, 50 mg de PLGA-COOH et de docétaxel (2 mg) ont été dissous dans 4 mL de dichlorométhane, puis la solution précédente y a été ajoutée simultanément. Puis, 200 μL de PFP ont été ajoutés à la solution ci-dessus. En conséquence, le mélange a été traité par une sonde ultrasonique (Sonics & Materials Inc., USA) pour obtenir une première émulsion (5 s marche et 5 s arrêt, 3 min). Pour obtenir la seconde émulsion, 8 mL d'une solution de poly(vinyl alcohol) (PVA) (p/v = 4 %) ont été ajoutés à l'émulsion ci-dessus, en utilisant la même sonde ultrasonique pendant 2 min. Après l'ajout de 10 mL d'alcool isopropylique à 2 % dans l'émulsion finale, la solution a été mélangée mécaniquement à température ambiante pendant au moins 4 h pour faire évaporer totalement le dichlorométhane. Finalement, les NPs CPDP ont été centrifugées trois fois (12 000 tr/min, 5 min) puis collectées et stockées à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Les NPs PDP ont été préparées de la même manière, sauf pour la Ce6. Tous les processus expérimentaux ont été effectués sur glace et strictement dans l'obscurité.

Caractérisation des NPs CPDP

La taille des particules et le potentiel zêta des NPs CPDP et PDP ont été réalisés par un instrument Malvern Zetasizer Nano (Malvern, UK). La morphologie a été caractérisée par microscopie électronique à transmission (MET) et microscopie optique. Pour évaluer la stabilité, les NPs CPDP ont été dissoutes dans une solution tampon phosphate (PBS) et les tailles mesurées pendant 7 jours, respectivement. Chaque échantillon a été mesuré en triplicat. L'efficacité d'encapsulation des NPs CPDP a été calculée selon la formule suivante :

Efficacité d'encapsulation (%) = (Poids de DTX ou Ce6 chargé / Poids total de DTX ou Ce6) × 100 %. Pour vérifier l'encapsulation des divers matériaux, les spectres UV-Vis de divers échantillons ont été étudiés (UH5300, Hitachi). L'encapsulation efficace a également été analysée par MET.

Taux de libération des médicaments des NPs CPDP

Pour évaluer la capacité de libération de la Ce6 et du DTX dans les NPs CPDP, deux solutions à pH différents (solution tampon phosphate, PBS : 7,4 ; solution tampon acétate, ABS : 5,6) ont été utilisées pour tester l'efficacité de libération cumulative. Brièvement, les NPs CPDP ont d'abord été dispersées avec 1 mL de PBS ou d'ABS après que le mélange ait été scellé dans une poche de dialyse (Mw : 10 000) ; l'ensemble de la solution a ensuite été transféré dans un flacon en verre (volume total : 150 mL) dans lequel 149 mL de PBS ou d'ABS ont été ajoutés pour maintenir le volume total de la solution à 150 mL. Le flacon en verre a ensuite été placé dans un agitateur à température constante à 37 °C, et à différents intervalles (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h), la solution a été prélevée et immédiatement complétée avec le même volume de milieu. Chaque groupe a été répété trois fois. Finalement, les concentrations de Ce6 et DTX ont été mesurées par un lecteur multimode hybride Synergy (BioTek, USA) à 403 et 229 nm, respectivement, et le taux de libération du médicament à chaque point temporel a été calculé.

Imagerie ultrasonore in vitro

Pour étudier la capacité ultrasonore des NPs CPDP, l'émulsion (1 mg/mL) a d'abord été déclenchée par un équipement de transducteur à ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU) (Centre de recherche en ingénierie médicale ultrasonore Ronghai, Chongqing, Chine), et le mode de conduction a été réglé à 50 % de cycle de travail, 1 s de durée d'impulsion sous différentes intensités (1-2 W/cm²) pour différentes durées. Pour l'imagerie ultrasonore, les NPs CPDP irradiées ont été ajoutées au modèle d'agarose préparé précédemment, respectivement, en utilisant l'instrument de diagnostic ultrasonore Philips EPIQ5 (fréquence de la sonde : 12 MHz, MI : 0,06) pour observer à la fois l'imagerie 2D et CEUS des NPs CPDP. Parallèlement, le logiciel ImageJ a été appliqué pour analyser la valeur de niveau de gris de chaque groupe.

Absorption cellulaire et génération de ROS in vitro des NPs CPDP par irradiation LIFU

La lignée cellulaire murine de cancer du sein 4T1 a été obtenue de la banque de cellules de Shanghai de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine) et incubée dans un milieu RPMI 1640 mélangé à 10 % FBS et 1 % streptomycine/pénicilline à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % CO₂.

Les cellules 4T1 ont d'abord été incubées dans les conditions précédentes à une densité de 1 × 10⁴ cellules par boîte pour tester l'absorption cellulaire en utilisant CLSM à différents intervalles temporels (1 h, 2 h, 4 h, 8 h). Pour vérifier la génération de ROS, les cellules ont été séparées en 5 groupes suivants : contrôle, NPs CPDP, LIFU, Ce6 + LIFU, NPs CPDP + LIFU. Après 24 h de culture conventionnelle, le milieu a été remplacé par des NPs CPDP (200 μL, 0,8 mg/mL) ou une solution de Ce6 (200 μL), respectivement, et les cellules ont été co-incubées pendant 3 h supplémentaires. Ensuite, l'irradiation LIFU (2 W/cm², 120 s) a été réalisée, respectivement, selon les différents groupes. Après co-incubation et traitement LIFU, 100 μL de solution DCFH-DA diluée ont été ajoutés, et chaque groupe a été cultivé dans l'incubateur précédent pendant 15 min. Un microscope confocal à balayage laser (CLSM) a été utilisé pour confirmer le résultat de la production d'espèces réactives de l'oxygène, et les intensités de fluorescence correspondantes ont été mesurées par le logiciel ImageJ.

Cytotoxicité in vitro et capacité de traitement concerté des NPs CPDP

Un test CCK-8 a été appliqué pour évaluer la cytotoxicité in vitro des NPs CPDP. À cet égard, différents groupes ont été conçus avec ou sans irradiation LIFU à différentes concentrations. Les résultats ont indiqué qu'après une co-incubation de 24 h sans exposition au LIFU, il n'y avait pas d'effet évident sur le taux de survie des NPs CPDP même à la concentration la plus élevée (0,8 mg/mL), démontrant la biosécurité désirable des NPs CPDP (Fig. 5a). En revanche, il a été montré qu'il y avait une diminution frappante de la viabilité cellulaire après irradiation LIFU, montrant que la combinaison des NPs CPDP et du LIFU a déclenché de manière remarquable la mort des cellules 4T1, ce qui était cohérent avec la génération de ROS in vitro.

Pour évaluer l'efficacité de l'apoptose cellulaire du traitement concerté, les cellules 4T1 ont été co-cultivées comme précédemment pendant 24 h, puis séparées en cinq groupes suivants : (1) contrôle (sans aucun traitement), (2) LIFU (seulement avec exposition LIFU à 2 W/cm²), (3) NPs CPDP (seulement avec solution NPs CPDP à 0,8 mg/mL), (4) NPs PDP + LIFU et (5) NPs CPDP + LIFU. Après diverses co-incubations de nanoparticules (200 μL) et exposition LIFU, chaque groupe a été traité avec un double marquage annexine V (5 μL) et iodure de propidium (5 μL) pendant 20 min et analysé selon un protocole de cytométrie de flux.

Inhibition in vitro de la métastase cellulaire

Pour étudier l'inhibition de la capacité métastatique des cellules, des essais de guérison de plaie et de Transwell ont été conçus. Pour l'essai de guérison de plaie, les cellules 4T1 ont été cultivées conventionnellement comme précédemment dans une plaque à 6 puits. Après croissance cellulaire jusqu'à une confluence de 80 %, une pointe de pipette (10 μL) a été utilisée pour effectuer une rayure artificielle le long du centre de la plaque à 6 puits. Ensuite, les cellules ont été traitées dans les mêmes groupes mentionnés ci-dessus. Après une co-incubation continue de 24 h, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS et observées au microscope optique (Olympus, Japon).

Pour l'essai Transwell, le compartiment supérieur de la chambre Transwell (Corning, San Diego, USA) a été principalement utilisé pour imiter la matrice extracellulaire in vivo. Les cellules 4T1 à une densité de 1 × 10⁵ cellules par puits ont été ensemencées dans la chambre supérieure dans un milieu RPMI 1640 sans sérum, tandis que le compartiment inférieur était rempli d'un milieu de culture complet mélangé à 10 % FBS. Ensuite, les cellules ont été séparées comme les groupes ci-dessus et traitées pendant 24 h, respectivement. Après cela, les cellules sur la surface inférieure ont été fixées avec du paraformaldéhyde et colorées au violet de cristal. Les résultats ont été observés au microscope optique (Olympus, Japon).

Imagerie ultrasonore in vivo

Des souris BALB/c femelles saines (4 semaines) et des souris Kunming (4 semaines) ont été obtenues du Centre des animaux de laboratoire de l'Université médicale du Ningxia. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives approuvées par le Comité d'éthique du bien-être animal de l'Université médicale du Ningxia. Pour établir le modèle de souris porteuses de tumeur, les souris BALB/c ont été inoculées avec des cellules de cancer du sein 4T1 (1 × 10⁷/mL) au flanc droit. Après que la taille de la tumeur ait atteint 60-80 mm³, les souris BALB/c ont été injectées avec des NPs CPDP (200 μL, 1 mg/mL) par voie intraveineuse via la veine caudale. 24 h plus tard, les sites tumoraux des souris ont été soumis au LIFU (2 W/cm², 120 s), puis l'imagerie 2D et CEUS a été acquise via l'instrument de diagnostic ultrasonore Philips EPIQ5 mentionné précédemment. L'analyse du niveau de gris a été mesurée par le logiciel ImageJ.

Efficacité thérapeutique synergique in vivo des NPs CPDP

Après l'inoculation des cellules cancéreuses 4T1, la taille de la tumeur a été enregistrée tous les deux jours, et le volume de la tumeur a été calculé par la formule : Volume = 1/2 × Longueur × Largeur². La taille de la tumeur et le poids corporel des souris ont été enregistrés tous les 2 jours, tandis que les photos de la croissance tumorale ont été enregistrées tous les 3 jours. Lorsque le volume tumoral a atteint 60-80 mm³, les souris de taille tumorale similaire ont été divisées au hasard en les mêmes cinq groupes : contrôle, LIFU, NPs CPDP, NPs PDP + LIFU, et NPs CPDP + LIFU (n = 3). Chaque groupe a été injecté par voie intraveineuse avec diverses NPs (200 μL) via la veine caudale, sauf le groupe contrôle (200 μL PBS à la place). Vingt-quatre heures plus tard, le site tumoral a été exposé à l'irradiation LIFU (2 W/cm²) pendant 120 s. L'administration complète de SDT a été répétée tous les 3 jours et a duré 18 jours. Le poids corporel et le volume tumoral des souris ont été mesurés et calculés. Après le traitement, les souris ont été euthanasiées et les tissus tumoraux ont été envoyés pour analyses histologiques H&E, TUNEL et PCNA.

Biosécurité des NPs CPDP in vivo

Pour étudier la biosécurité des nanoparticules CPDP in vivo, des souris Kunming femelles saines (n = 3) ont été séparées en 4 groupes suivants : contrôle, 5 mg/mL, 10 mg/mL et 20 mg/mL. Les NPs CPDP (200 μL) ont été injectées par la veine caudale des souris ; ensuite, les souris ont eu un accès libre à la nourriture et à l'eau sans aucune administration supplémentaire. Le poids corporel des souris a été mesuré tous les 2 jours. Après 30 jours, les souris ont été euthanasiées et des échantillons de sang ont été prélevés pour analyses de cellules sanguines et biochimiques. Les organes majeurs (cœur, foie, rate, poumon et rein) ont été prélevés et examinés pour la coloration H&E, respectivement.

Inhibition in vivo de la métastase pulmonaire

Pour évaluer l'inhibition de la métastase pulmonaire de chaque groupe, l'ensemble du processus a été mené en observant le nombre de nodules métastatiques dans le poumon ainsi qu'une évaluation histologique par coloration H&E. Après l'euthanasie de toutes les souris, les tissus pulmonaires ont été prélevés et fixés ; puis, des photographies des nodules cancéreux ont été prises et les tissus pulmonaires ont été analysés plus en détail par coloration H&E.

Analyse statistique

Les données de mesure ont toutes été effectuées 3 fois et exprimées en moyenne ± écart type (ET) et analysées par ANOVA à un facteur ou un test t de Student standard via le logiciel SPSS (version : 19.0), tandis que la valeur p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Caractérisation des NPs CPDP et efficacité de libération des médicaments

Une méthode d'émulsion double a été appliquée pour la fabrication des NPs CPDP, qui encapsulaient simultanément le matériau de changement de phase PFP, le sonosensibilisateur Ce6 et l'agent chimiothérapeutique DTX. Lorsque dispersées dans du PBS ou de l'eau déionisée, la solution présentait une apparence gris clair. Les NPs CPDP présentaient une forme sphérique homogène et une structure cœur-coquille claire, que ce soit observées par microscopie optique ou MET (Fig. 1a, b). Les diamètres moyens des NPs CPDP et PDP étaient de 249,5 ± 77,46 nm et 246,6 ± 81,01 nm, et les potentiels zêta de surface moyens étaient de − 18,47 ± 0,55 mV et − 3,987 ± 0,66 mV, respectivement (Fig. 1c, d). La taille des NPs CPDP garantissait qu'elles pouvaient s'accumuler passivement au site tumoral via l'effet EPR [40]. La différence de charge entre NPs CPDP et PDP est principalement due à la Ce6 chargée négativement [41]. De plus, le potentiel zêta négatif des NPs CPDP indiquait une adsorption plasmatique de protéines plus faible, vérifiant la stabilité relative des nanoparticules. Les distributions de taille des particules étaient maintenues entre 249,5 et 385,1 nm en 7 jours (Fig. 1e), démontrant la relative stabilité des NPs CPDP. Selon la courbe standard, l'efficacité d'encapsulation du DTX et de la Ce6 était de 83,84 ± 1,39 % et 60,54 ± 3,79 %, respectivement.

a MET (barre d'échelle : 500 nm) et b image au microscope optique des NPs CPDP (barre d'échelle : 20 μm). c Distribution de taille et d potentiel zêta des NPs PDP et CPDP. e Distribution de taille des NPs CPDP sur 7 jours. f Taux de libération de la Ce6 et g taux de libération du DTX sous différentes conditions (pH 7,4 et pH 5,6, n = 3). h Spectre UV-Vis de la Ce6, DTX, PFP/PLGA et NPs CPDP, respectivement. Les flèches des NPs CPDP montrent les pics caractéristiques de la Ce6 et du DTX, indiquant l'encapsulation efficace des deux matériaux. i Résultat MET de deux nanoparticules. La nanoparticule PFP/PLGA présente une coquille fine et un cœur rond (gauche). La nanoparticule CPDP encapsulant à la fois la Ce6 et le DTX montre une coquille beaucoup plus épaisse et un cœur ovale (droite)

Comme l'indique l'efficacité de libération des médicaments Ce6 et DTX des NPs CPDP Fig. 1f, g, une augmentation près de deux fois de l'indice de libération du DTX a été enregistrée à pH 5,5 par rapport aux nanoparticules dissoutes à pH 7,4, ce qui indiquait qu'un taux de libération raisonnable du DTX pouvait être atteint efficacement dans un microenvironnement tumoral acide. L'ensemble des résultats ci-dessus a montré que les NPs CPDP finement conçues peuvent exercer une libération de médicament chimiothérapeutique stable et opportune dans l'environnement tumoral acide, et sont également fondamentalement désirables pour être préparées pour la SDT.

Comme l'a montré l'UV-Vis, le DTX et la Ce6 révélaient des pics d'absorption uniques à 229 nm et 403 nm, respectivement, tandis que le PFP/PLGA n'en montrait aucun. Il convient de noter que le spectre des NPs CPDP présentait des pics similaires près des deux longueurs d'onde ci-dessus, tandis que le reste montrait la même tendance que le spectre PFP/PLGA, indiquant l'encapsulation réussie des divers matériaux (Fig. 1h). Pour vérifier davantage l'encapsulation efficace, la Fig. 1i indiquait que la nanoparticule PFP/PLGA possédait une coquille beaucoup plus fine et un cœur rond, tandis que la nanoparticule CPDP révélait une coquille relativement plus épaisse et un cœur ovale en raison de l'encapsulation à la fois du DTX et de la Ce6.

Imagerie ultrasonore in vitro

Il est souligné que le PFP possède une excellente capacité de changement de phase. La transformation liquide-gaz aide non seulement les nanoparticules à s'agréger au site tumoral, mais confère également sa capacité à améliorer l'efficacité de l'imagerie ultrasonore [42]. Pour démontrer cela, l'irradiation LIFU a été appliquée comme déclencheur pour induire la transformation de phase du PFP, à savoir l'effet de vaporisation acoustique de gouttelettes (ADV) [43]. Les résultats ont montré que les intensités de niveau de gris étaient maintenues à un niveau relativement bas avant l'irradiation LIFU, tandis qu'après l'augmentation de l'intensité et du temps d'irradiation du LIFU, la tendance à une imagerie ultrasonore améliorée était révélée à la fois en 2D et en CEUS (Fig. 2a). L'analyse acoustique d'ImageJ a renforcé le résultat par une valeur de niveau de gris élevée (Fig. 2b, c), ce qui était cohérent avec les résultats d'imagerie. Il convient de noter que le résultat le plus significatif en 2D et CEUS a été obtenu lorsque l'intensité du LIFU a atteint 2 W/cm² et a duré 120 s. Les résultats ci-dessus ont démontré que le PFP était encapsulé avec succès dans les NPs CPDP, et que la capacité d'imagerie ultrasonore avait été significativement promue sous une intensité plus élevée ainsi qu'un temps plus long d'administration LIFU.

a Images ultrasonores en 2D et CEUS sous différentes intensités et durées de LIFU. b Intensité de niveau de gris correspondante à différentes intensités et temps d'imagerie 2D et c imagerie CEUS (**p < 0,01, n = 3)

Absorption cellulaire et génération de ROS in vitro des NPs CPDP par irradiation LIFU

Comme le montre le résultat CLSM Fig. 3, l'absorption cellulaire des NPs CPDP présentait une tendance accrue à différents intervalles temporels, atteignant l'agrégation la plus significative à la co-incubation de 8 h.

Absorption cellulaire 4T1 des NPs CPDP pendant différents intervalles temporels (Bleu : cellules 4T1 colorées DAPI. Rouge : NPs CPDP marquées DiR, la barre d'échelle est 50 μm)

La stratégie principale de la thérapie sonodynamique (SDT) est la génération de ROS — une série de produits de réduction à un électron — pour induire l'apoptose des cellules cancéreuses et inhiber la prolifération cellulaire [44]. Il est souligné que lorsqu'exposés aux ultrasons, le sonosensibilisateur est enclin à déclencher la production de ROS ; pendant ce temps, une quantité considérable d'énergie sera libérée au cours de tout le processus [45]. Étant donné que les ultrasons et le sonosensibilisateur sont des éléments indispensables pour promouvoir la SDT, la génération intracellulaire de ROS a été conçue et analysée pour étudier les différences entre les groupes divisés. Selon la Fig. 4a, la quantité de ROS générée par le groupe Ce6 libre plus irradiation LIFU était négligeable, ce qui peut être dû au métabolisme rapide de la Ce6 libre conduisant à une production de ROS insatisfaisante. Au contraire, l'intensité de fluorescence la plus forte a été révélée par le groupe NPs CPDP + LIFU. On a supposé que la Ce6 encapsulée était bien protégée et donc maintenue à l'abri du métabolisme. Par conséquent, après stimulation LIFU, la Ce6 a été libérée pour produire d'abondants ROS. Comparativement, aucun signal fluorescent significatif n'a été trouvé dans les autres groupes (Fig. 4b).

a Images CLSM de génération de ROS avec divers traitements et b analyse d'intensité FL correspondante (****p < 0,0001, n = 3). Les barres d'échelle sont 50 μm

Cytotoxicité in vitro et capacité de traitement concerté des NPs CPDP

Le test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a été introduit pour tester la cytotoxicité in vitro des NPs CPDP. À cet égard, différents groupes ont été conçus avec ou sans irradiation LIFU à différentes concentrations. Les résultats ont indiqué qu'après une co-incubation de 24 h sans exposition au LIFU, il n'y avait pas d'effet évident sur le taux de survie des NPs CPDP même à la concentration la plus élevée (0,8 mg/mL), démontrant la biosécurité désirable des NPs CPDP (Fig. 5a). En revanche, il a été montré qu'il y avait une diminution frappante de la viabilité cellulaire après irradiation LIFU, montrant que la combinaison des NPs CPDP et du LIFU a déclenché de manière remarquable la mort des cellules 4T1, ce qui était cohérent avec la génération de ROS in vitro.

a Viabilité cellulaire relative avec ou sans irradiation LIFU sous différentes concentrations de NPs CPDP. b Apoptose et nécrose des cellules tumorales 4T1 par essai de cytométrie de flux et c données d'analyse correspondantes des taux de nécrose et d'apoptose (****p < 0,0001, ***p < 0,001, n = 3)

Pour évaluer davantage l'efficacité de la SDT, un essai de cytométrie de flux a été introduit. Comme le montrent les résultats Fig. 5b, c, l'indice de nécrose et d'apoptose cellulaire était le plus élevé observé dans le groupe NPs CPDP + LIFU, tandis que les autres groupes ne montraient pas de nécrose et d'apoptose évidentes. Notamment, le taux de nécrose et d'apoptose du groupe NPs CPDP + LIFU était trois fois plus élevé que celui du groupe NPs CPDP seul, ce qui assurait l'efficacité significative de mort cellulaire tumorale de la SDT sous un autre aspect. Intriguant, par rapport au groupe NPs PDP + LIFU, le taux de nécrose et d'apoptose cellulaire dans le groupe NPs CPDP + LIFU était significativement augmenté, exhibant l'efficacité de la thérapie synergique de la SDT et de la chimiothérapie.

Inhibition in vitro de la métastase cellulaire

La capacité d'invasion et de migration des cellules tumorales sont indispensables dans la progression tumorale [46, 47]. Comme le montre la Fig. 6a, la fermeture de l'espace physique du groupe NPs CPDP + LIFU était significativement plus large que les autres groupes, indiquant une vitesse de migration relativement plus lente. Selon l'analyse du logiciel ImageJ (Fig. 6c), le taux de migration du groupe NPs CPDP + LIFU était également remarquablement réduit par rapport aux autres groupes.

a Guérison de plaie et b essai Transwell après divers traitements. c Taux de migration correspondant de l'essai de guérison de plaie. d Nombre de migration correspondant de l'essai Transwell (****p < 0,0001, n = 3)

De même dans l'essai Transwell, par rapport à la vitesse de migration rapide des autres groupes, le groupe NPs CPDP + LIFU a révélé une réduction significative du nombre de cellules (Fig. 6b), démontrant une excellente capacité anti-migration de la thérapie synergique. Plus spécifiquement, en l'absence de SDT (groupes NPs CPDP seul et LIFU seul), le nombre de cellules tumorales était légèrement diminué (Fig. 6d). Dans l'ensemble, grâce à la combinaison de la SDT et de la chimiothérapie, la métastase des cellules 4T1 a été remarquablement inhibée in vitro.

Imagerie ultrasonore in vivo

Puisque le PFP était encapsulé dans les NPs CPDP, il est également nécessaire d'évaluer la capacité d'imagerie ultrasonore caractéristique in vivo. Après l'injection via la veine caudale des NPs CPDP, le LIFU a ensuite été appliqué au site tumoral pour acquérir à la fois l'imagerie 2D et CEUS (Fig. 7a). La différence graphique claire entre les deux groupes indiquait qu'après irradiation LIFU, l'intensité correspondante des NPs CPDP était élevée de manière évidente par rapport au groupe pré-irradiation. Les données supplémentaires de l'intensité d'écho moyenne ont également confirmé ce résultat, qui était également cohérent avec le résultat d'imagerie in vitro précédent (Fig. 7b, c).

a Images 2D et CEUS avec et sans irradiation LIFU. b, c Analyse d'intensité de niveau de gris correspondante mesurée par ImageJ (**p < 0,01, *p < 0,05, n = 3)

Efficacité thérapeutique synergique in vivo des NPs CPDP

D'après la Fig. 8a, b, le volume tumoral du groupe NPs CPDP + LIFU était significativement plus petit après 18 jours de traitement que celui des autres groupes, ce qui peut être attribué à l'efficacité des ROS provenant du traitement SDT ainsi qu'à la chimiothérapie pour exercer une efficacité de thérapie synergique valide. De même, les photographies de souris porteuses de tumeurs (Fig. 8a) montraient la même tendance, vérifiant l'efficacité thérapeutique coopérative des NPs CPDP déclenchée par l'exposition LIFU. De plus, il n'y avait pas de réduction évidente du poids des souris entre les différents groupes (Fig. 8c). L'ensemble des résultats ci-dessus indiquait un taux d'inhibition beaucoup plus élevé du groupe NPs CPDP + LIFU, révélant que la thérapie synergique pouvait prévenir significativement la croissance tumorale.

a Images de souris porteuses de tumeurs sous divers traitements pendant les 18 jours certains (n = 3). b Analyse du volume tumoral selon divers traitements (**p < 0,01). c Poids des souris porteuses de tumeurs sous divers traitements (ns non significatif, n = 3). d Résultats H&E, PCNA et TUNEL sous divers traitements (barre d'échelle : 200 μm). e Analyse de l'indice de prolifération PCNA des tumeurs sous divers traitements. f Analyse de l'indice d'apoptose TUNEL des tumeurs sous divers traitements (****p < 0,0001, n = 3)

Pour témoigner davantage des résultats thérapeutiques de tous les groupes, les colorations H&E, PCNA et TUNEL ont été utilisées (Fig. 8d). Le taux de prolifération PCNA dans le groupe NPs CPDP + LIFU n'était que de 20,50 %, soit quatre fois inférieur au groupe contrôle, trois fois inférieur aux groupes LIFU et NPs CPDP seul et deux fois inférieur au groupe NPs PDP + LIFU, démontrant un taux anti-prolifération tumorale significatif (Fig. 8e). Comme le montre la Fig. 8d, f, les résultats TUNEL indiquaient que le groupe NPs CPDP + LIFU présentait un indice d'apoptose évident de 72,86 %, bien plus élevé que le contrôle (9,66 %), LIFU (12,86 %), NPs CPDP (19,59 %) et NPs PDP + LIFU (37,06 %). L'ensemble des résultats ci-dessus a démontré l'efficacité de la thérapie synergique exercée in vivo, qui s'est également avérée cohérente avec les résultats in vitro précédents.

Biosécurité des NPs CPDP in vivo

Malgré le résultat thérapeutique efficace, il est d'une grande importance d'explorer la biosécurité des nouvelles nanoparticules établies. Au nom de la distribution sûre des NPs CPDP in vivo, la sécurité métabolique a été réalisée. Les résultats ont montré qu'au lieu d'une perte de poids corporel apparente, le poids corporel des souris augmentait progressivement dans tous les groupes de souris (Fig. 9a), ce qui indiquait une influence négative négligeable des NPs CPDP. De plus, comme le montrent les divers organes et les échantillons sanguins Fig. 9b, aucun changement significatif n'a été observé dans les cellules sanguines, l'indice d'analyse biochimique et la coloration H&E (Fig. 9c) parmi les différents groupes de traitement, indiquant l'excellente biosécurité des NPs CPDP in vivo.

a Poids des souris Kunming saines sous diverses concentrations de NPs CPDP (n = 3). b Examen biochimique et numération globulaire sous diverses concentrations de NPs CPDP sur une période de 30 jours (n = 3). c Résultats H&E de différents organes (cœur, foie, rate, poumon et rein) de souris sous le même traitement (barre d'échelle : 50 μm)

Inhibition in vivo de la métastase pulmonaire

Il est bien établi que le poumon est l'organe cible principal pour la métastase à distance du cancer du sein [48]. Afin d'évaluer l'efficacité de suppression de la métastase, les tissus pulmonaires de souris ont été utilisés pour l'investigation anti-métastatique. Comme on peut le voir Fig. 10a, b, par rapport aux groupes contrôle, LIFU, NPs CPDP et NPs PDP + LIFU, le groupe NPs CPDP + LIFU présentait la diminution la plus remarquable des nodules pulmonaires, suggérant son efficacité désirable d'inhibition de la métastase pulmonaire. Une tendance similaire de diminution était également indiquée par la coloration H&E (Fig. 10c), ce qui démontrait dans l'ensemble que cette stratégie de thérapie synergique pouvait exercer un effort efficace dans l'élimination de la métastase pulmonaire chez les souris.

a Images des apparences générales des tissus pulmonaires. b Analyse des nodules pulmonaires métastatiques entre divers traitements (**p < 0,01, n = 3). c Images correspondantes des résultats de coloration H&E de métastase pulmonaire (barre d'échelle : 50 μm)

Discussion

Il a été largement reconnu que la métastase du cancer du sein influencera considérablement son mauvais pronostic [3, 49]. En tant qu'approche thérapeutique désirable, la SDT peut servir pour sa haute efficacité et sa capacité de pénétration profonde, qui ont été largement convaincues [11, 50]. Admettons que, puisque certaines limitations existent dans l'application unique des sonosensibilisateurs, l'utilisation de la SDT seule peut encore être moins suffisante dans l'exploration ultérieure du cancer. Le développement de la nanotechnologie combinée à la médecine clinique a été considérablement promu ces dernières années, en raison des mérites inspirants tels que la toxicité négligeable, l'absence d'invasivité et l'excellente biocompatibilité. En utilisant cette nouvelle approche, les chercheurs ont fait de nombreux efforts pour explorer des stratégies thérapeutiques multifonctionnelles afin d'améliorer l'efficacité antitumorale.

La biosécurité est la priorité des nano-agents. En tant que matériau largement accepté certifié par la Food and Drug Administration (FDA), il est souligné que le PLGA peut être utilisé comme vecteur désirable dans l'application [51, 52]. Basé sur ses avantages, nous avons établi un nanosystème pour réaliser une efficacité thérapeutique multifonctionnelle, exploitant le PLGA comme structure externe pour encapsuler le sonosensibilisateur Ce6, le matériau de changement de phase PFP et l'agent chimiothérapeutique DTX. Les nanoparticules CPDP (NPs CPDP) ont été principalement observées par la structure cœur-coquille et la taille appropriée afin qu'une agrégation désirable via l'effet EPR puisse être atteinte. La viabilité cellulaire des NPs CPDP a été prouvée être supérieure à 80 % après 24 h de co-incubation, indiquant la bonne sécurité de cette nanoplatforme. De plus, la transformation de phase du PFP encapsulé a également garanti les NPs CPDP comme agent de contraste amélioré lorsqu'activées par LIFU. La capacité d'imagerie ultrasonore améliorée assurera non seulement la fenêtre thérapeutique idéale, mais favorisera également l'avenir prometteur des NPs CPDP pour réaliser une intégration de diagnostic précis et de traitement précis.

La stratégie clé de la SDT est la génération de ROS. Comparée à l'emploi unique de la Ce6, la Ce6 encapsulée dans le PLGA a exercé une protection désirable, ce qui a pu être vérifié par le résultat ROS. Dans notre étude, il n'y avait qu'une quantité négligeable de ROS générée par l'utilisation unique de la Ce6, tandis que la Ce6 encapsulée dans les nanoparticules produisait une quantité considérable de ROS, ce qui a été prouvé davantage par l'efficacité de la SDT. Le résultat indiquait que la génération de ROS était préservée par la Ce6 encapsulée dans les NPs CPDP, ce qui pouvait poser une base solide pour l'inhibition tumorale ultérieure. De plus, le taux de libération du médicament montrait qu même à pH 5,5, peu de Ce6 était libéré des nanoparticules, démontrant une bonne protection du sonosensibilisateur par le PLGA, ce qui a été prouvé davantage par la production de ROS et le résultat SDT à haute efficacité. Intéressant, l'efficacité de libération du DTX et de la Ce6 à pH 5,5 était assez différente selon les résultats (plus de 40 % et environ 20 %, respectivement), ce qui peut être dû à l'efficacité d'encapsulation diverse des deux médicaments. Le faible taux de libération de la Ce6 démontrait qu'elle pouvait être efficacement protégée dans le PLGA afin qu'une génération substantielle de ROS par stimulation LIFU puisse être atteinte pour obtenir une efficacité SDT plus convaincante. Une autre raison de cette différence peut être due aux solvants différents des deux médicaments lors du processus de préparation. Plus spécifiquement, le DTX et le PLGA étaient directement dissous dans le dichlorométhane, tandis que la Ce6 devait d'abord être dissoute dans le méthanol, puis ajoutée goutte à goutte au dichlorométhane, en raison de sa faible solubilité dans ce dernier [53]. Puisque la libération du médicament dans les nanoparticules est directement liée à l'efficacité de la thérapie combinée ultérieure, l'évaluation du taux de libération du médicament ainsi que le résultat de génération de ROS ont mutuellement prouvé ce point. Les recherches actuelles ont suggéré que l'utilisation de la chimiothérapie seule ne pourrait pas inverser significativement la progression tumorale [41]. Dans cette étude, la nanoplatforme que nous avons conçue a démontré de solides preuves que, par rapport à l'emploi unique de la chimiothérapie, le traitement synergique a remarquablement élevé l'efficacité thérapeutique à la fois in vitro et in vivo. Puisque la stimulation LIFU a optimisé la stratégie thérapeutique, un taux d'apoptose cellulaire accru a été remarquablement élevé. Il convient de noter qu'en raison de cette stratégie synergique, la métastase pulmonaire a pu être significativement inhibée à la fois au niveau des cellules tumorales et du modèle de souris inoculées, ce qui est cohérent avec les rapports antérieurs [16, 52].

Conclusion

En conclusion, les NPs CPDP sûres et stables que nous avons conçues et préparées, associées à l'irradiation LIFU, pourraient éliminer de manière remarquable la progression de la tumeur du sein et sa métastase pulmonaire. Avec une capacité d'imagerie améliorée, cette nanoplatforme était également considérée comme un agent de contraste prometteur en clinique. Ainsi, la nouvelle stratégie synergique combinée au LIFU pourrait être considérée comme une application thérapeutique efficace pour inverser le mauvais pronostic du cancer du sein métastatique.

Abréviations

LIFU :

Ultrasons focalisés de faible intensité

SDT :

Thérapie sonodynamique

PFP :

Perfluoropentane

EPR :

Effet de perméabilité et de rétention accrue

DCFH-DA :

Dichlorodihydrofluorescein diacétate

PI :

Iodure de propidium

MET :

Microscope électronique à transmission

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

Ce6 :

Chlorin e6

DTX :

Docétaxel

FBS :

Sérum bovin fœtal

CCK-8 :

Cell Counting Kit-8

NPs CPDP :

Nanoparticules Ce6/PFP/DTX/PLGA

NPs PDP :

Nanoparticules PFP/DTX/PLGA