Nanoparticules d'albumine chargées de resvératrol avec une circulation sanguine prolongée et une biocompatibilité améliorée pour une thérapie ciblée très efficace contre les tumeurs pancréatiques

Contexte

Le cancer du pancréas représente une maladie dévastatrice avec moins de 6 mois de survie médiane et un taux de survie à 5 ans de 6 % seulement [1]. Le traitement clinique traditionnel du cancer du pancréas est l'exérèse chirurgicale, la radiothérapie et la chimiothérapie [2, 3]. Cependant, ces méthodes peuvent être limitées par des effets secondaires graves, tels que la propagation de cellules cancéreuses après une excision incomplète, une toxicité grave pour les cellules normales pendant la radiothérapie et de faibles taux de survie [4]. Bien que les effets cibles faibles et les effets secondaires élevés aient également limité l'utilité des médicaments anticancéreux en chimiothérapie, de plus en plus de nouveaux agents chimiothérapeutiques sont développés. Outre les drogues synthétiques, de nombreux extraits d'herbes chinoises se sont révélés efficaces contre certains types de cancer. Le resvératrol (RV), un extrait naturel de la végétation telle que le raisin et le soja [5], a largement agi dans l'agrégation plaquettaire et inhibe la vasodilatation et réduit la viscosité sanguine [6, 7]. Et au cours des dernières décennies, il s'est également avéré avoir de grands effets anticancéreux dans certains cancers, tels que le cancer du foie, du sein et de l'ovaire [8, 9]. Cependant, l'utilisation du RV comme médicament anticancéreux potentiel présente certains inconvénients pour une application clinique ultérieure, tels qu'une faible solubilité, une faible circulation sanguine et un manque de sélectivité [4, 10].

Dans le cadre de la protection de l'intégrité structurelle du médicament, la stratégie d'encapsulation a suscité l'intérêt de nombreux chercheurs, qui s'est avérée efficace pour surmonter certains des inconvénients mentionnés ci-dessus par rapport aux médicaments « libres » conventionnels [11]. Par exemple, il peut améliorer la faible solubilité et la faible biodisponibilité, abaisser la clairance rénale rapide, ainsi qu'augmenter la sélectivité cellulaire [12]. Actuellement, de nombreuses méthodes d'encapsulation telles que les liposomes, les nanoparticules à base de polymères, les hydrogels et l'albumine sérique sont utilisées [13,14,15,16]. Parmi ces méthodes, l'utilisation de l'albumine sérique est devenue l'un des vecteurs les plus intéressants pour administrer des médicaments anticancéreux insolubles. L'albumine sérique humaine (HSA), une protéine endogène est non toxique, présente une non-immunogénicité et présente une grande biocompatibilité [17]. Il a été largement utilisé comme transporteur de protéines macromoléculaires pour l'administration de médicaments [18]. Ainsi, la HSA est capable d'améliorer la solubilité des médicaments lipophiles. De plus, la présence de groupes carboxyliques et aminés fonctionnels à la surface facilite la fonctionnalisation de surface pour les nanoparticules d'albumine [19, 20]. Par exemple, via une liaison covalente, la surface des nanoparticules d'albumine peut être décorée de colorants fluorescents, de molécules cibles et d'ARN fonctionnel [21, 22]. En outre, il peut être facilement fonctionnalisé avec des polymères hydrophiles, tels que le PEG, pour prolonger la circulation sanguine [23].

Dans cette étude, la HSA est utilisée pour encapsuler le RV lipophile en tant que nanomédicament qui est fonctionnalisé en surface avec une molécule de ciblage tumoral, l'arginine-glycine-aspartate (RGD) via un «pont» PEG (NPs HRP-RGD). Les NP HRP-RGD préparées présentent une grande biocompatibilité in vitro et in vivo et une circulation sanguine prolongée. L'absorption cellulaire et la biodistribution tumorale in vivo ont également été évaluées pour valider son potentiel de ciblage dans les cellules PANC-1. De plus, l'efficacité anticancéreuse ciblée des NPs HRP-RGD a été étudiée in vitro et in vivo. Ces résultats indiquent que les NP HRP-RGD peuvent être une nanoplate-forme polyvalente pour les agents thérapeutiques potentiels contre les tumeurs pour une application de chimiothérapie ciblée.

Méthodes

Matériaux

Sérum albumine humaine (HSA, poudre lyophilisée, ≥96 %), resvératrol (RV, ≥99 %), 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), fluorescéine isothiocyanate (FITC), Arg–Gly–Asp (RGD, ≥97%), acide 3-(2-pyridyldithio)propionique N L'ester -hydroxysuccinimide (SPDP), le colorant Hoechst 33258 et le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). NH₂ –PEG₂₀₀₀ –COOH a été acheté à Seebio Biotech Inc. (Shanghai, Chine). N -Succinimidyl S -acétylthioacétate (SATA) a été acheté auprès de Pierce Biotech Inc. (Rockford, IL, USA). Le DMSO, la solution Trypsine-EDTA, le tampon phosphate (PBS), le sérum bovin fœtal (FBS), la solution pénicilline-streptomycine et les milieux DMEM ont été achetés auprès de Sigma.

Synthèse de nanoparticules HSA-RV

Les nanoparticules HSA-RV ont été synthétisées par une méthode de désolvatation simple [24]. En détail, 6 mg de RV ont été dissous dans du DMSO à 1 mg/mL et ont été mélangés avec 10 mg de HSA dans 1 mL d'eau sous légère agitation, formant des coacervats durcis après agitation pendant 6 h à température ambiante, puis ont été traités par croisement -liaison avec 0,5% de glutaraldéhyde (100 μL). Ensuite, les solvants organiques ont été éliminés par dialyse dans l'eau pendant 1 jour, ce qui a donné les nanoparticules HSA-RV. Des nanoparticules de HSA vierges ont été préparées comme mentionné ci-dessus, sauf que le DMSO sans RV a été mélangé avec une solution de HSA pendant 6 h.

Synthèse et caractérisation des NP HRP-RGD

Les nanoparticules HSA-RV ont été conjuguées avec HS-PEG-RGD par le réticulant traditionnel SPDP comme décrit dans la littérature [25]. En bref, 20 mg de NH₂ –PEG₂₀₀₀ –COOH a été traité avec 2 mg de SATA pendant 3 h et purifié par dessalage. Le SATA-PEG résultant a été ajouté dans un peptide RGD de 10 mg et 8 mg d'EDC pendant 3 h. Le PEG-RGD protégé par SATA a ensuite été mis à réagir avec 1 mL d'hydroxylamine dans du phosphate de sodium pendant 3 h. Après avoir été purifié par dessalage, il a reçu le HS-PEG-RGD. Ensuite, le HS-PEG-RGD obtenu a été conjugué avec des nanoparticules HSA-RV via des liaisons disulfure. En bref, les groupes amino des nanoparticules HSA-RV ont d'abord été activés par SPDP, puis ont été remis en suspension dans 10 mL de PBS et ont réagi avec un excès de HS-PEG-RGD ou HS-PEG pendant 24 h. La solution résultante a été répétée lavée par du PBS et filtrée à travers un filtre Millipore (100 kDa) pour éliminer tout PEG-RGD restant et d'autres solvants organiques, ce qui a donné des NP HRP-RGD. La morphologie et la taille des nanoparticules ont été détectées par microscopie électronique à balayage (SEM, Philips XL-30 FEG, Eindhoven, Pays-Bas) et un système Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni), respectivement. Les spectres d'absorption ont été acquis par un spectrophotomètre UV-Vis (UV1800, Shimadzu, Japon). Les spectres de fluorescence ont été enregistrés par un spectromètre à fluorescence (F-4500, Hitachi, Japon).

Chargement et libération du médicament

Six milligrammes de RV ont été dissous dans du DMSO à 1 mg/mL et ont été mélangés avec 10 mg de HSA dans 1 mL d'eau sous légère agitation, formant des coacervats durcis après agitation pendant 6 h à température ambiante, puis ont été traités par réticulation avec 0,5 % de glutaraldéhyde (100 μL). Ensuite, les solvants organiques et le RV libre ont été éliminés par dialyse dans l'eau pendant 1 jour. Le dialysat a été utilisé pour quantifier le VR libre par spectromètre UV-Vis à 306 nm selon une courbe d'étalonnage. La quantité de médicament dans les NP HRP-RGD correspond au total du RV ajouté moins la quantité de RV libre.

La libération de RV des NPs HRP-RGD a été détectée via une technique de dialyse dynamique (sac de dialyse avec un seuil Mw de 8-12 kDa) à pH 5,0, 7,4 et 9,0 PBS, respectivement, à 37 °C. La concentration de médicament a été calculée en utilisant une courbe d'étalonnage standard. L'efficacité d'encapsulation = W ₁ /W ₂ × 100 %, où W ₁ représente le poids de RV dans les NP HRP-RGD, et W ₂ est le poids du RV ajouté. Libération cumulative = W _un /W _b × 100 %, où W _un représente la quantité de RV libérée, et W _b est le RV total présent dans les NP HRP-RGD.

Test d'hémolyse in vitro

Un test d'hémolyse in vitro a été réalisé comme décrit dans des travaux antérieurs [26]. En détail, 0,2 ml de globules rouges (GR, dans du PBS) ont été mélangés avec 0,8 ml de NP HRP-RGD (dans du PBS) à des concentrations prédéterminées (10, 50, 100 et 200 μg/ml). Les globules rouges incubés avec de l'eau déminéralisée ou du PBS ont été définis comme contrôle positif ou négatif, respectivement. Après incubation à 37 °C pendant 3 h, l'ensemble de suspensions ci-dessus a été centrifugé à 10 000 tr/min pendant 1 min et l'absorbance des surnageants à 541 nm a été contrôlée par un spectromètre UV-Vis. Rapport hémolytique = (OD_t − OD_nc )/(OD_pc − OD_nc ) × 100%, où OD_t , OD_pc , et OD_nc sont l'absorbance du surnageant de l'échantillon à tester, des contrôles positifs et négatifs, respectivement.

Culture cellulaire

Des cellules tumorales pancréatiques humaines PANC-1 ont été achetées auprès de la Cell Bank of Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Chine) et cultivées dans des milieux DMEM complétés avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine dans un incubateur humidifié (5 % CO₂ ) à 37 °C.

Captation cellulaire

Pour l'absorption cellulaire, le FITC a été utilisé pour étiqueter les NP HRP-RGD. Les cellules PANC-1 ont adhéré à des lames de verre dans des plaques à 6 puits et ont été incubées avec des NP HRP, des NP HRP-RGD + un blocage RGD libre et des NP HRP-RGD à la même concentration de FITC marqué pendant 5 h, respectivement. Ensuite, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et fixées par 0,2 mL de glutaraldéhyde, suivies d'une coloration au DAPI pendant 10 min. Les images de fluorescence des cellules ont été capturées par le microscope confocal à balayage laser (Leica TCS SP8 CARS, Wetzlar, Allemagne).

De plus, les taux d'absorption des NPs HRP, des NPs HRP-RGD + blocage RGD libre et des NPs HRP-RGD à la même concentration de FITC marqué par les cellules PNAC-1 ont été analysés en utilisant la cytométrie en flux (FCM, FACSCalibur, FACSCanto II) en mesurant la fluorescence FITC. Des dizaines de milliers de cellules ont été enregistrées pour chaque analyse FCM. La fluorescence FITC a été excitée à l'aide d'un laser à 488 nm.

Cytotoxicité in vitro

La cytotoxicité des NP HP-RGD, le porteur du RV, a été réalisée en utilisant un test standard de comptage cellulaire-8 (CCK-8) (Bestbio, Chine). Cellules PNAC-1 (1 × 10 ⁵ cellules/mL, 0,5 mL) ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits et cultivées pendant 24 h. Après avoir jeté les anciens milieux, des milieux frais contenant 10, 50, 100 et 200 μg/mL de NP HRP-RGD ont été incubés avec des cellules PNAC-1 pendant 24 h. Du PBS a été utilisé pour laver doucement les cellules trois fois. Une solution de travail de 100 μL de CCK-8 (10 % de CCK-8  +   90 % de DMEM) a ensuite été ajoutée à chaque puits, suivie d'une incubation à 37 °C pendant 0,5 h. La valeur d'absorbance à 450 nm a été détectée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Infinite 200 Pro, Tecan, Autriche). De plus, l'efficacité anticancéreuse in vitro du RV (dissous dans le DMSO), des NP HRP et des NP HRP-RGD avec la même concentration de RV contre les cellules PNAC-1 a été évaluée par le test CCK-8 mentionné ci-dessus. Toutes les expériences ont été réalisées à quatre reprises. De plus, l'examen morphologique de l'apoptose a été détecté par coloration Hoechst 33258. La fluorescence de Hoechst 33258 dans les cellules a été observée et enregistrée au microscope confocal à balayage laser.

Modèle animal

Des souris nude Balb/c, âgées de 4 à 5 semaines, ont été achetées auprès de Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, Chine). Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par le Bureau d'administration des animaux de laboratoire de l'Université médicale de Taishan. Des modèles de xénogreffe de tumeur sous-cutanée ont été établis dans la région arrière droite de souris en injectant 1 × 10 ⁶ cellules PNAC-1 par souris, et lorsque les tumeurs présentaient un volume d'environ 80 mm ³ , ces souris ont été réparties au hasard en différents groupes (n = 5) pour une utilisation ultérieure.

Circulation sanguine et biodistribution tumorale

Les souris normales ont reçu une injection intraveineuse de RV, de NP HRP et de NP HRP-RGD. Par la suite, des échantillons de sang ont été prélevés à des moments différents du plexus orbitaire. Chaque échantillon de sang a été dissous dans 900 μL de tampon de lyse. La concentration des NPs RV, HRP et HRP-RGD dans le sang a été déterminée par les spectres d'absorbance RV de chaque échantillon de sang solubilisé par un spectromètre UV-Vis. Les concentrations de l'échantillon sont définies comme le pourcentage de dose injectée par gramme de tissu (ID%/g).

La biodistribution dans la tumeur a été réalisée chez des souris porteuses de tumeurs. Les tissus tumoraux ont été pesés et digérés par une solution d'eau régale pendant la nuit 24 h après l'injection intraveineuse de RV, HRP NP et HRP-RGD NP, respectivement. La concentration des NPs RV, HRP et HRP-RGD dans la tumeur a été déterminée par les spectres d'absorbance RV de chaque tissu tumoral solubilisé par un spectromètre UV-Vis. Les concentrations de l'échantillon sont définies comme le pourcentage de dose injectée par gramme de tissu (ID%/g).

Efficacité anticancéreuse In Vivo

Les souris de différents groupes ont reçu une injection intraveineuse de solution saline, de RV, de NP HRP et de NP HRP-RGD (la dose égale à RV, n = 5, 10 mg/kg). Pendant le traitement, la taille des tumeurs et le poids corporel des souris porteuses de tumeurs ont été surveillés tous les 3 jours. Le volume tumoral a été calculé à l'aide de la formule :V = (longueur × largeur ² )/2. Volume tumoral relatif = V /V ₀ , où V ₀ était le volume tumoral avant le traitement initial.

Examen histologique

Des souris nudes Balb/c saines de différents groupes ont reçu une injection intraveineuse de solution saline (témoin), de RV, de NP HRP et de NP HRP-RGD (la dose égale à RV, n =5, 5 mg/kg). Après 35 jours, les souris ont été sacrifiées et le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins ont été prélevés. Les organes principaux obtenus ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit. Ensuite, ces organes ont été déshydratés dans 25 % de saccharose, coupés en tranches de 5 μm et colorés à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). Les sections colorées ont été imagées sous un microscope à contraste de phase inversé.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des NP HRP-RGD

Selon une méthode de désolvatation simple [24], le RV a été encapsulé par HSA, résultant en des nanoparticules HSA-RV. Après quoi, la surface des nanoparticules HSA-RV a été fonctionnalisée de manière covalente avec HS-PEG-RGD par l'agent de réticulation traditionnel SPDP [25], formant des NP nanocomposites HRP-RGD. Les NP HRP et les NP HRP-RGD ont montré une distribution granulométrique unimodale et étroite (Fig. 1a, b). Après avoir conjugué RGD à la surface des NP HRP, la taille moyenne des nanoparticules est passée de 113 ± 3,1 nm à 120 ± 2,6 nm. De plus, les NP HRP et les NP HRP-RGD présentaient une morphologie de forme sphérique homodispersée (Fig. 1c, d).

Distribution granulométrique des NP HRP (a ) et les NP HRP-RGD (b ). Images SEM des NP HRP (c ) et les IP HRP-RGD (d )

Les spectres UV-Vis et de fluorescence ont été pris pour confirmer la présence de RV dans les NP HRP-RGD. Comme le montre la figure 2a, les NP HRP et les NP HRP-RGD présentaient des pics d'absorbance pour le RV à 304 nm, indiquant la présence de RV dans les deux nanoparticules. De plus, les NP HRP et les NP HRP-RGD ont montré des signaux de fluorescence du RV à une longueur d'onde d'excitation de 325 nm, ce qui est cohérent avec les spectres de fluorescence du RV (Fig. 2b). Ces résultats démontrent que RV conserve ses propriétés optiques après conjugaison aux NP HRP et NP HRP-RGD.

un Les spectres d'absorbance des NP libres RV, HRP et HRP-RGD. b Les spectres de fluorescence des NP libres RV, HRP et HRP-RGD

Chargement et libération du VR

La figure 3a montre la courbe de changement d'efficacité d'encapsulation de RV dans les NP HRP-RGD lors de l'augmentation de la concentration de RV. Le RV EE maximal des NP HRP-RGD obtenu était de 62,5 ± 4,21%. De plus, comme le montre la figure 3b, les NP HRP-RGD ont présenté le taux de libération de RV le plus élevé de 58,4,2   ± 2,8 % après 60 h à 37 °C et pH 5,0 par rapport au taux de libération obtenu à pH 6,5, pH 7,4, et pH 9,0 à 37 °C. Il a été rapporté que le pH sanguin normal est de 7,4, tandis que le tissu tumoral est légèrement acide [27]. Cela s'avère être une caractéristique bénéfique de l'utilisation des NP HRP-RGD dans le traitement des tumeurs.

un Efficacité d'encapsulation de RV en fonction des concentrations de RV ajoutées. b Profil de libération in vitro du RV à partir des NP HRP-RGD à pH 5,0, 6,5, 7,4 et 9,0 à 37 °C

Biocompatibilité in vitro

La figure 4a, b montre des images des NPs RV et HRP-RGD dissous dans du PBS à 4 °C après 7 jours. Le premier montre une matière solide comme un cristal aciculaire, tandis que le dernier a beaucoup de particules sphériques micro et homodisperses, indiquant la stabilité améliorée du RV après encapsulation par des nanoparticules HSA. De plus, la taille moyenne des NP HRP-RGD dans l'eau, le DMEM, le PBS et le FBS n'a montré presque aucune variation sur 4 semaines (Fig. 4c), démontrant la stabilité colloïdale élevée des NP HRP-RGD, très probablement attribuée au PEG et Encapsulation HSA.

L'image au microscope de a RV gratuit (dissous dans DMSO) dans PBS et b NPs HRP-RGD dans PBS après 7 jours. c Test de stabilité colloïdale des NPs HRP-RGD dans différents milieux (eau, DMEM, PBS et FBS). d La stabilité de la fluorescence du RV dans les NP HRP-RGD après 4 semaines. e Taux d'hémolyse des globules rouges après 1 h d'incubation avec des NP HRP-RGD à différentes concentrations. L'encart montre la photographie de globules rouges exposés à de l'eau distillée, du PBS et des NP HRP-RGD avec différentes concentrations suivies d'une centrifugation

Les figures 4d montrent la stabilité fluorescente des NPs RV et HRP-RGD en solution aqueuse à 4 °C. Après 4 semaines de stockage, l'intensité de fluorescence RV des NP HRP-RGD est restée supérieure à 96,8 % de ses intensités initiales ; cependant, la fluorescence du RV a chuté rapidement à 12,1 % de son intensité initiale, probablement en raison de la précipitation du RV hors de la solution [10], indiquant en outre la stabilité des NP HRP-RGD par rapport au RV libre. De plus, comme le montre la figure 4e, aucun phénomène d'hémolyse significatif n'a été détecté pour les globules rouges traités par HRP-RGD NPs en dessous de 200 μg/mL, similaire à celui du groupe témoin négatif traité par PBS, illustrant l'excellente hémocompatibilité des NPs HRP-RGD . Ces résultats suggèrent que l'encapsulation de HSA a amélioré la stabilité et la biocompatibilité in vitro du RV, ce qui est bénéfique pour les applications biomédicales.

Captation cellulaire

Les NP HRP et les NP HRP-RGD ont été étiquetées par le FITC. Comme le montre la figure 5a, les noyaux ont affiché une fluorescence bleue, qui a été colorée par DAPI. Une fluorescence verte intense (signal FITC) a été observée dans la région périnucléaire des cellules PANC-1 traitées avec les NP HRP-RGD, montrant qu'une quantité suffisante de NP HRP-RGD est entrée dans le cytoplasme. En revanche, très peu de fluorescence verte a été montrée dans les cellules PANC-1 traitées par HRP NPs. De plus, les cellules PANC-1 prétraitées avec du RGD libre présentaient également une légère fluorescence verte, probablement attribuée au récepteur RGD sur la surface PANC-1 bloqué par le RGD libre. Le taux d'absorption cellulaire des nanoparticules a été détecté par FCM, qui était de 16,2 ± 4,9%, 7,1 ± 5,1% et 58,5 ± 3,5% pour les NP HRP, les NP HRP-RGD avec blocage RGD et les PANC- traités par les NP HRP-RGD 1 cellules, respectivement (Fig. 5b). Ces résultats démontrent que la molécule cible RGD peut faciliter l'absorption à haute efficacité des NP HRP-RGD par les cellules PANC-1 [28, 29].

un Images de fluorescence confocale des cellules PANC-1 après incubation avec des NP HRP, des NP HRP-RGD avec blocage RGD et des NP HRP-RGD marqués par FITC. Vert et couleurs bleues représentent respectivement la fluorescence FITC et les noyaux cellulaires colorés au DAPI. Barre d'échelle = 20 μm. b L'absorption cellulaire quantitative des cellules PANC-1 vers les NP HRP, les NP HRP-RGD avec blocage RGD et les NP HRP-RGD par cytométrie en flux

Cytotoxicité in vitro

La figure 6a montre la cytotoxicité des NP HP-RGD avec une plage de concentration de 0 à 200 μg/mL par le test CCK-8, dans laquelle la viabilité des cellules PANC-1 a été maintenue au-dessus de 90 %. Il a été suggéré que les niveaux de NP HP-RGD porteurs du RV inférieurs à 200 μg/mL n'avaient pas de cytotoxicité significative. De plus, l'effet anticancéreux des NPs HRP-RGD in vitro a également été évalué. La figure 6b montre que les NP libres de RV, HRP et HRP-RGD à des concentrations de RV comprises entre 0 et 50 μg/mL ont induit une diminution de la viabilité cellulaire de manière dose-dépendante. Par rapport aux NP libres de RV et HRP, les NP HRP-RGD peuvent entraîner la plus grande baisse de la viabilité cellulaire sous toutes les concentrations d'essai, probablement en raison de la stabilité et des effets de ciblage RGD des NP HRP-RGD sur les cellules PANC-1 [30, 31] . De plus, les noyaux des cellules PANC-1 traitées par RV libre, NP HRP et NP HRP-RGD (tous à 30 μg/mL RV) ont été colorés par Hoechst 33258 et observés au microscope à fluorescence confocale. Les cellules traitées par HRP NPs et HRP-RGD NPs ont montré la présence de noyaux pycnotiques, compatibles avec les cellules traitées par RV (Fig. 6c-f), indiquant que le type de mort cellulaire est très probablement l'apoptose [32].

un Viabilité cellulaire des cellules PANC-1 après traitement avec des NP HP-RGD pendant 24 h. b Viabilités cellulaires des cellules PANC-1 après incubation avec différentes concentrations de RV, HRP NP et HRP-RGD NP. Le noyau des cellules PANC-1 traitées au PBS (c ), VR (d ), les IP HRP (e ), NPs HRP–RGD (f ) coloré par Hoechst 33258 après un traitement de 24 h. Les images ont été enregistrées à l'aide d'un appareil photo numérique. Barre d'échelle = 20 μm. Flèches rouges représentent les noyaux des cellules pycnotiques

Circulation sanguine et biodistribution tumorale

La figure 7a montre le temps de circulation sanguine des NPs RV libres, HRP et HRP-RGD après injection intraveineuse à des souris. On peut voir que les NP HRP et les NP HRP-RGD ont presque le même temps de demi-vie (t _1/2 ) de 7,5 ± 0,5 h et t _1/2 = 6,57 ± 0,9 h, respectivement. Alors que le RV gratuit a été rapidement retiré du système de circulation sanguine et t _1/2 = 1.21 ± 0.09 h. Les NP HRP-RGD ont prolongé le temps de circulation sanguine du RV, augmentant d'environ 5,43 fois (t _1/2 ). De plus, 24 h après l'injection des nanoparticules, la teneur en RV dans le tissu tumoral du groupe traité par les NP HRP-RGD était environ 3,01 et 8,1 fois plus élevée que celle des groupes traités par les NP HRP et les RV libres. , respectivement (Fig. 7b). Ces résultats indiquent que l'encapsulation de HSA et de PEG pourrait prolonger le temps de circulation pour diminuer l'élimination du RV et montrer une performance d'accumulation sélective significative dans le tissu tumoral [33, 34], probablement en raison de la perméabilité et de la rétention améliorées (EPR) et du ciblage RGD effet [35].

un Courbes de circulation sanguine du RV libre, des NP HRP et des NP HRP-RGD chez la souris après injection intraveineuse déterminées par l'absorbance du RV à partir du lysat tissulaire dilué. b Contenu du RV dans la tumeur 24 h après le traitement avec les NP RV, HRP et HRP-RGD. c Le volume tumoral relatif des souris porteuses de tumeurs après injection intraveineuse de solution saline (témoin), RV, HRP NP et HRP-RGD NP. d Poids corporel de souris porteuses de tumeurs après injection intraveineuse de solution saline (témoin), RV, NP HRP et NP HRP-RGD

Efficacité anticancéreuse In Vivo

La figure 7c montre l'efficacité anticancéreuse du RV libre, des NP HRP et des NP HRP-RGD à la même concentration de RV après injection intraveineuse dans la queue. A titre de contrôle, les souris ont été traitées avec une solution saline. Les souris traitées avec les NPs HRP-RGD ont montré une croissance tumorale significativement supprimée et aucune rechute après 35 jours de traitement. Alors que le RV libre, les groupes traités par les NPs HRP, similaires au groupe témoin, ont montré une croissance tumorale toujours croissante. Comme prévu, le poids corporel des souris dans tous les groupes n'a pas diminué de manière significative au cours des 35 jours de traitement (Fig. 7d). De plus, la toxicité systémique in vivo a été évaluée par coloration H&E des principaux organes (cœur, foie, rate, poumon et rein) après 35 jours de traitement (Fig. 8). Aucune toxicité ou anomalie tissulaire notable n'a été trouvée dans les images de coloration H&E des tissus correspondants de tous les groupes testés, ce qui a en outre garanti la sécurité in vivo des NP HRP-RGD pour les applications biomédicales.

Les images de coloration HE représentatives du cœur, du foie, de la rate, des reins et des poumons. Barre d'échelle = 100 μm

Conclusions

En résumé, nous avons illustré comment les NP HRP-RGD peuvent être utilisées comme agent thérapeutique de ciblage des tumeurs pancréatiques très efficace. Il a été démontré que les NPs HRP-RGD présentaient une stabilité colloïdale et une biocompatibilité améliorées in vitro par rapport au RV libre. Le RGD en tant que molécule cible a favorisé l'absorption cellulaire très efficace des NP HRP-RGD. Avec la présence de PEG et de HSA, les NP HRP-RGD ont montré un temps de circulation significativement prolongé qui peut surmonter la courte circulation sanguine du RV libre. Sur la base du ciblage RGD, le contenu des NP HRP-RGD dans le tissu tumoral était supérieur à celui des NP RV et HRP libres. De plus, des études in vitro et in vivo ont montré que par rapport aux NP libres de RV et HRP, les NP HRP-RGD présentent un excellent effet anticancéreux probablement induit par l'apoptose. Enfin, les NP HRP-RGD ont montré une biocompatibilité élevée et aucune toxicité systémique significative in vivo sur un traitement de 35 jours. Ces résultats démontrent que les NP HRP-RGD peuvent être des agents de chimiothérapie tumorale prometteurs dans les futures applications biomédicales.

Abréviations

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8

FBS :

Sérum fœtal bovin

FITC :

Isothiocyanate de fluorescéine

HSA:

Human serum albumin

PBS:

Phosphate buffer

PEG:

Polyethylene glycol

RGD:

Arginine–glycine–aspartate

RV:

Resveratrol