Synthèse et performances in vitro de nanoparticules de fer-platine revêtues de polypyrrole pour la thérapie photothermique et l'imagerie photoacoustique

Contexte

Au cours de la dernière décennie, de nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques ont été introduites pour le traitement du cancer. Dans ces cas, la thérapie photothermique (PTT) a attiré une attention considérable en raison de ses avantages, notamment une spécificité élevée, une sélectivité spatio-temporelle précise et des effets secondaires limités [1, 2]. Le PTT utilise les photoabsorbeurs de la région proche infrarouge (NIR) pour générer de la chaleur pour l'ablation thermique des cellules cancéreuses lors d'une irradiation laser NIR [2]. Profitant de l'utilisation de l'irradiation laser avec la même longueur d'onde, les photoabsorbeurs NIR peuvent être utilisés pour la thérapie photothermique du cancer guidée par imagerie photoacoustique (PAI) [3, 4].

Récemment, les nanoparticules de fer-platine (FePt NPs) sont apparues comme des agents efficaces pour l'imagerie à double modalité CT/IRM [5]. Les NP FePt affichent une efficacité photothermique plus élevée que les nanoparticules d'or dans la région NIR [6]. Un signal photoacoustique plus fort généré par l'utilisation de FePt NPs, par rapport aux nanoparticules d'or, a également été récemment démontré [7]. La modification de surface avec un polymère est une technique bien connue pour améliorer la biocompatibilité et les performances des nanoparticules pour le traitement du cancer. Malgré leurs propriétés prometteuses, il y a eu quelques efforts de recherche sur la modification de surface des NP FePt pour l'application biomédicale [8, 9].

La haute efficacité de la transformation lumière-chaleur des agents nanométriques est le facteur le plus important pour le PTT [10]. Ainsi, le matériau sélectionné pour la modification de surface des FePt NPs ne devrait avoir aucun effet négatif sur la transformation lumière-chaleur du noyau FePt NP. Le polypyrrole (PPy), qui a une forte excitation dans la région NIR, a reçu une importance considérable dans les applications biomédicales en raison de ses caractéristiques inhérentes supérieures, notamment la stabilité photothermique, le faible coût et la biocompatibilité [11, 12]. Des études récentes ont rapporté que le PPy était un agent de haute performance pour le traitement du cancer du PTT [11, 13] et le PAI des tissus profonds [12]. Dans le présent travail, nous avons développé des FePt NPs recouvertes de PPy (FePt@PPy NPs) en tant que nouveaux agents pour la combinaison PTT et PAI. Notre attente lors de l'utilisation du polymère PPy pour revêtir les FePt NPs est de faire progresser l'effet photothermique et la biocompatibilité des FePt NPs.

Les nanoparticules résultantes ont montré une excellente biocompatibilité, une stabilité photothermique et un fort effet photothermique. L'étude du test MTT a révélé que les NP FePt@PPy présentaient une thérapie efficace contre le cancer. De plus, le test fantôme du PAI en conjonction avec les NP FePt@PPy a montré un signal photoacoustique (PA) fort qui est très prometteur pour d'autres applications du PAI.

Méthodes

Matériel

Acétylacétonate de platine (Pt(acac)₂ , 97 %) a été acheté auprès d'Acros Organics et utilisé tel quel. Fer pentacarbonyle (Fe(CO)₅ , 99%), hexadécane-1,2-diol (90%), oléylamine (80-90%), acide oléique (70%), éther dioctyl (90%), 1-octadécène (90%), 3- mercaptopropionique (3-MPA, 97%), pyrrole (Py, qualité réactif, 98%), alcool polyvinylique (PVA, Mw:9000-10000), persulfate d'ammonium ((NH₄ )₂ S₂ O₈ , 98 %), le dodécyl sulfate de sodium (SDS), le ferrocyanure de potassium, l'acide chlorhydrique et le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich et utilisés tel que reçu au cours des expériences. Des réactifs de coloration cellulaire comprenant le bleu trypan, l'iodure de propidium (PI) et Hoechst 33342 ont également été achetés auprès de Sigma-Aldrich. Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), le sérum bovin fœtal (FBS), la pénicilline, la streptomycine, la trypsine 1 × et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ont été achetés auprès de HyClone (South Logan, UT, États-Unis). De l'eau distillée (DI) a été utilisée pour toutes les expériences.

Synthèse des NP FePt@PPy

La synthèse des NP FePt@PPy a été réalisée en trois étapes décrites dans le schéma 1.

Représentation schématique de la synthèse des NPs FePt@PPy

Étape 1—Synthèse des NPs FePt hydrophobes

La synthèse des NPs FePt hydrophobes a été réalisée selon le schéma rapporté [5]. En bref, 97 mg de Pt(acac)₂ , 4 mL d'éther dioctylique, 66 μL de Fe(CO)₅ , 195 mg de 1,2-hexadécandiol, 100 L d'oléylamine et 100 L d'acide oléique ont été chargés dans un ballon à fond rond à trois cols de 50 ml. Le mélange réactionnel a été chauffé à 240 °C avec une vitesse de chauffage de 15 °C/min sous argon gazeux. Après 30 min, le produit a été refroidi à température ambiante. Les FePt NPs ont été collectées par centrifugation (15 000 tr/min, 30 min) et lavées plusieurs fois avec de l'hexane. La solution finale de nanoparticules a été stockée dans de l'hexane.

Étape 2—Échange de ligand

Les ligands à la surface des NP FePt hydrophobes ont été échangés avec de l'acide 3-mercaptopropionique (3-MPA) comme rapporté dans les articles [14]. De plus, 1 mL de 3-MPA et 1 mL de cyclohexanone ont été chargés dans un tube à centrifuger, puis 0,5 mL de FePt NP hydrophobes dispersées dans de l'hexane (~ 10 mg) ont été ajoutés à la solution ci-dessus et secoués à l'aide d'un vortex. Après 30 min, les NP de FePt ont commencé à précipiter et toutes les nanoparticules ont précipité après 1 h. Les NP de FePt hydrophiles ont été recueillies par centrifugation (3 500 tr/min, 5 min). Le produit a été lavé avec de la cyclohexanone, de l'éthanol et de l'acétone, respectivement. Enfin, les NPs FePt hydrophiles diluées en DI avec l'ajout de NaOH.

Étape 3 : revêtement des NP FePt hydrophiles avec du PPy

Cinq milligrammes de FePt NPs hydrophiles ont été dissous dans 200 mL d'écorceur contenant 60 mL de DI et ont été soniqués en continu pendant 10 min. Ensuite, 6 ml de SDS 40 mM ont été ajoutés à la solution ci-dessus. Ensuite, 1 g de PVA qui a été complètement dissous dans de l'eau chaude a été ajouté à la solution ci-dessus. Le mélange résultant a ensuite été agité à 500 tr/min. Ensuite, 10 mL de 6 mM (NH₄ )₂ S₂ O₈ a été ajouté à la solution agitée. Après 1 h d'équilibrage, 6 ml de Py 100 mM ont été ajoutés à la solution ci-dessus. Après quelques minutes, la solution vire progressivement au noir. Après 2 h de polymérisation, les nanoparticules résultantes ont été séparées par centrifugation (12 000 tr/min, 30 min) et ont été lavées plusieurs fois à l'eau chaude pour éliminer les impuretés. Les NP FePt@PPy obtenues ont été remises en suspension avec du PBS par ultrasonication pendant 3 min.

Caractérisation

La morphologie des nanoparticules a été observée en utilisant la microscopie électronique à transmission à émission de champ (FETEM; JEM-2100F, JEOL, Japon). La composition atomique a été analysée par spectroscopie à dispersion d'énergie (EDS). Les groupes fonctionnels chimiques des nanoparticules ont été analysés à l'aide d'un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (spectrophotomètre Perkin Elmer 1320 FTIR). Le diamètre des nanoparticules a été déterminé par la méthode de diffusion dynamique de la lumière en utilisant un spectrophotomètre à diffusion de lumière électrophorétique (ELS-8000, OTSUKA Electronics Co. Ltd., Japon). Les spectres UV-Vis-NIR ont été mesurés en utilisant la spectroscopie UV-Vis-NIR (Thermo Biomate 5 Spectrophotometer). L'irradiation laser a été réalisée à l'aide d'un laser 808 nm réglable en puissance (onde continue, puissance maximale = 5 W, Hi-TechOptoelectronics Co., Pékin, Chine).

Test photothermique

Pour mesurer les performances photothermiques des NP telles que préparées, une suspension (1 mL) contenant les NP FePt@PPy avec des concentrations spécifiques (20, 30, 50, 70, 100 et 120 μg/mL) a été ajoutée dans un 12 puits assiette. Ensuite, chaque puits a été exposé par un laser de 808 nm à une densité de puissance de 1 W/cm ² pendant 5 minutes. De plus, la température croissante des NP FePt@PPy irradiées à différentes densités de puissance du laser 808 nm a également été enregistrée. En bref, une solution de 50 μg/mL de FePt@PPy NP a été irradiée par le laser NIR à la densité de puissance souhaitée de 0,5, 1 et 1,5 W/cm ² pendant 6 minutes. La température a été enregistrée par un thermomètre (MASTECH, CA, USA) via une fibre thermique.

Test de photostabilité

Des NPs de 50 μg/mL FePt@PPy ont été exposées au laser 808 nm à une densité de puissance de 1 W/cm ² jusqu'à ce que la température la plus élevée soit atteinte, puis, il a été autorisé à revenir à la température ambiante en éteignant le laser. Les cycles de chauffage et de refroidissement ont été répétés six fois. Le spectre UV-Vis de l'échantillon irradié a été enregistré pour comparer avec l'échantillon irradié.

Test de stockage à long terme

La suspension aqueuse FePt@PPy NPs à une concentration de 120 μg/ml a été conservée à 4 °C pendant 30 jours pour évaluer sa stabilité en stockage à long terme. Pour la comparaison, les spectres d'absorption UV-Vis et la taille des particules de FePt@PPy NPs ont été observés pour le 1er jour et le dernier jour. De plus, les NP FePt@PPy sur différents supports, y compris les supports DI, DMEM plus FBS et PBS, ont été stockées à 4 °C pendant 30 jours pour évaluer la stabilité des NP FePt@PPy préparées.

Dosage de cytotoxicité des NP FePt-PPy

Un test MTT standard [15] a été utilisé pour quantifier la cytotoxicité cellulaire. Les cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 ont été utilisées comme cellules cancéreuses modèles pour tester la biocompatibilité des NP FePt@PPy. Des cellules cancéreuses traitées au FePt NP ont été utilisées comme contrôle. La lignée cellulaire MDA-MB-231 a été cultivée dans un milieu DMEM additionné de 10% de FBS et 1% d'antibiotiques en atmosphère humidifiée à 37 °C et 5% CO₂ . Les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées en microplaque 96 puits à une densité de 1 × 10 ⁴ cellules/puits. Après 24 h, les milieux DMEM contenant FePt@PPy NPs (ou FePt NPs) avec différentes concentrations (0, 20, 30, 50, 70, 100 et 120 μg/mL) ont été ajoutés aux plaques cellulaires, et les cellules traitées ont été puis incubé pendant 48 h. Notez que la quantité de FePt est la même pour les deux nanoparticules testées, y compris les NP FePt et les NP FePt-PPy. Ensuite, 100 μL de MTT dissous dans du PBS à 0,5 mg/mL ont été ajoutés à chaque puits, et les plaques de cellules ont été encore incubées pendant 4 h. L'enzyme déshydrogénase, présente dans les mitochondries des cellules vivantes, a converti le MTT soluble en formazan violet insoluble. Ensuite, 100 μL de DMSO ont été ajoutés pour dissoudre le formazan violet insoluble. Par la suite, l'absorption du formazan violet a été enregistrée à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre à lecture de plaques pour quantifier le pourcentage de viabilité cellulaire.

Captation cellulaire

La coloration au bleu de Prusse a été utilisée pour vérifier l'absorption cellulaire des NP FePt@PPy dans la cellule MDA-MB-231 [16]. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 1 × 10 ⁵ cellules/mL dans des plaques à 12 puits et incubées pendant 24 h. Ensuite, 200 μg/mL de FePt@PPy NPs ont été ajoutés aux plaques cellulaires et incubés pendant 24 h supplémentaires. Après cela, les cellules ont été fixées avec du formaldéhyde froid pendant 15 min. Et puis, 10% de ferrocyanure de potassium et 20% de solution aqueuse d'acide chlorhydrique (50:50 v /v ) ont été ajoutés aux plaques cellulaires et incubés pendant 1 h. Le résultat a été observé en utilisant la microscopie optique.

Thérapie photothermique in vitro

Le test MTT a été réalisé pour quantifier l'efficacité des NP FePt@PPy sur la capacité de destruction des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231. Brièvement, les cellules MDA-MB-231 ont été cultivées dans une microplaque de 96 puits à une densité de 1 × 10 ⁴ cellules/puits. Le lendemain, les solutions FePt@PPy NP avec une concentration spécifique (0, 10, 20, 30, 50, 70 et 100 μg/mL) ont été ajoutées aux plaques cellulaires et les cellules traitées ont été incubées pendant 24 h supplémentaires. . Ensuite, du PBS a été utilisé pour laver les nanoparticules non liées. Par la suite, les microplaques ont été exposées au laser NIR à une densité de puissance de 1 W/cm ² pendant 4 et 6 min, respectivement. Pour obtenir les résultats, les étapes suivantes ont été menées conformément au test de cytotoxicité cellulaire dans la section « Essai de cytotoxicité des NP FePt-PPy ».

Une double coloration de Hoechst 33342 et de PI a également été utilisée pour détecter les cellules endommagées et mortes à la suite du traitement photothermique utilisant des NP FePt@PPy. Concrètement, les cellules MDA-MB-231 ont été ensemencées dans une plaque 12 puits à une densité de 1 × 10 ⁵ cellules/puits. Après 24 h, les cellules ont été traitées avec les NP FePt@PPy (0, 50, 70 et 100 μg/mL) et incubées en continu pendant 24 h supplémentaires à 37 °C. Ensuite, les nanoparticules non liées ont été éliminées en lavant doucement avec du PBS. Par la suite, les plaques cellulaires ont été exposées au laser NIR à une densité de puissance de 1 W/cm ² pendant 6 minutes. Ensuite, les plaques de culture cellulaire ont été conservées pendant 24 h dans l'incubateur, puis les cellules irradiées ont été colorées avec Hoechst 33342 et PI. Notez que 1,5 ml de Hoechst 33342 (10 μg/ml) a été ajouté dans la plaque de culture cellulaire, puis conservé dans l'incubateur pendant 20 min. Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS trois fois pour éliminer l'excès de coloration. Ensuite, les cellules ont été colorées en continu avec 1,5 ml de PI (10 μg/ml) et incubées à température ambiante pendant 5 min. Enfin, les cellules ont été à nouveau lavées avec du PBS, et les images fluorescentes ont été capturées par un microscope à fluorescence (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Allemagne).

Expérience animale

Pour effectuer un test in vivo des propriétés photothermiques des NP FePt@PPy, une souris nude BALB/c femelle âgée de 6 semaines a reçu une injection sous-cutanée de 100 μL de 100 μg/mL de FePt@PPy NPs dans du PBS. Une autre souris nude sans injection a été utilisée comme témoin. Ensuite, la zone injectée des souris a été irradiée avec un laser de 808 nm à 1 W/cm ² pendant 6 minutes. Les procédures expérimentales avec des animaux ont été approuvées par le comité de soin et d'utilisation des animaux de l'Université nationale de Pukyong et réalisées conformément aux principes directeurs pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Imagerie photoacoustique in vitro

Configuration PAI

Le PAI sur fantôme a été réalisé pour évaluer le signal PA des NP FePt@PPy. Notre groupe a développé le système PAI non invasif comme rapporté dans l'étude précédente [17]. Le diagramme schématique de la configuration PAI a été montré sur la figure 11. Un système optique intégré avec un laser pulsé Nd-YAD Q-switché (Surelite III, CA, USA) a été utilisé. Le laser a été réglé à une longueur d'onde de 808 nm et à une fréquence de 10 Hz avec un fonctionnement par impulsions de 5 ns. La fibre optique d'entrée ayant une distance focale de 50 mm (Thorlabs, Newton, NJ, USA) a été connectée à une lentille plan-convexe. La fibre optique de sortie était reliée à un transducteur focalisé (Olympus NDT, USA) et ajustée au centre de la zone éclairée. Pour enregistrer les signaux PA, les données ont été numérisées et stockées via un système DAQ (acquisition de données) intégré au système laser. Par la suite, les données enregistrées ont été utilisées pour reconstruire des images 2D du fantôme par un programme LabVIEW.

Préparation de l'échantillon

Le fantôme PVA a été préparé avec 8 % de PVA pour imiter le tissu. Les cellules cancéreuses MBA-MD-231 préensemencées ont été traitées avec différentes concentrations de FePt@PPy NPs (50, 100 et 200 μg/mL) pendant 24 h, puis les cellules ont été récoltées et mélangées avec 4 % de gélatine sur le fantôme (Fig. 12a). Ensuite, le fantôme a été recouvert d'une petite couche de gélatine à 4 % et laissé se solidifier. Enfin, le fantôme a été fixé sur le réservoir d'eau pour le traitement PAI.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisation des NP FePt@PPy

Le processus de synthèse des NP de FePt est illustré dans le schéma 1. L'analyse EDS de ces nanoparticules a révélé que la composition atomique finale de Fe et de Pt est respectivement de 20 et 80 % (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). Les NPs de FePt hydrophobes ont été modifiées avec du 3-MPA; ainsi, ils deviennent des NP FePt hydrophiles avec une taille moyenne de 8,3 nm. Les FePt NPs hydrophobes se dispersent dans l'hexane en raison de la présence d'acide oléique et d'oléylamine à la surface. Cependant, les particules deviennent solubles dans l'eau après échange de ligand. Les spectres FTIR des NP FePt hydrophobes et des NP FePt hydrophiles ont révélé les bandes caractéristiques des ligands d'absorption de l'acide oléique, de l'oléylamine et du 3-MPA à la surface (Fig. 3 ; Schéma 2) [14, 18]. Les données FTIR (Fig. 2) ainsi que la bonne solubilité des NP de FePt hydrophiles dans l'eau (Schéma 1, étape 2) ont confirmé le succès du processus d'échange de ligand.

Représentation schématique de la synthèse et de l'application des NPs FePt@PPy sur la thérapie photothermique et l'imagerie photoacoustique

Les NP de FePt ont été recouvertes de PPy par polymérisation par oxydation chimique en utilisant (NH₄ )S₂ O₈ comme agent oxydant et PVA comme stabilisant. La couche de PPy a été clairement observée par imagerie MET (Fig. 1c) avec une épaisseur d'environ 10 nm, et la taille moyenne des NP FePt@PPy est de 42 nm (Fig. 1d). Le FTIR des NP FePt@PPy a également été mis en œuvre pour confirmer le revêtement des NP PPy en examinant les changements de fréquence FTIR (Fig. 3c). Les pics caractéristiques de PPy ont été bien analysés dans le rapport précédent [19]. Les bandes de vibration FTIR à 1620 et 1446 cm ⁻¹ ont été attribués aux vibrations d'étirement C–C et C=C d'un anneau PPy. La bande à 1236 cm ⁻¹ a été attribuée à la vibration d'étirement C–N et à la bande à 1 076 cm ⁻¹ a indiqué la présence d'un mode de déformation dans le plan C–N. De plus, les bandes à 798 et 600 cm ⁻¹ ont été attribuées aux vibrations de déformation dans le plan C–H et N–H et aux vibrations de flexion externes C–H, respectivement. Le FTIR et le TEM assurent le revêtement réussi des NP FePt externes en PPy.

un TEM et b distributions de taille correspondantes des NPs FePt purs. c TEM et d distributions de taille correspondantes des NP FePt@PPy

Spectres FTIR de (a) NP FePt hydrophobes, (b) NP FePt hydrophiles et (c) NP FePt@PPy

Les spectres UV-Vis-NIR des NP purs FePt, PPy et FePt@PPy

Courbe d'échauffement photothermique de FePt NPs purs et FePt@PPy NPs avec la même quantité de FePt. Toutes les solutions ont été irradiées avec un 1-W/cm ² Laser 808 nm pendant 6 min

un Spectres UV-Vis-NIR de différentes concentrations de FePt@PPy NPs. b La décroissance photothermique des NP FePt@PPy avec différentes concentrations. c Les images thermographiques NIR correspondantes des échantillons irradiés. Toutes les solutions ont été irradiées avec un 1-W/cm ² Laser 808 nm pendant 5 min

un Comportement photothermique de 50 μg/mL de FePt@PPy NPs maintenus sous un laser de 808 nm à différentes densités de puissance pendant 6 min. b L'enregistrement de la température en temps réel de six cycles de chauffage/refroidissement de 50 μg/mL de FePt@PPy NPs dans le cadre d'une expérience laser marche/arrêt (1 W/cm ² ). c Spectres UV-Vis-NIR des NP FePt@PPy avant et après irradiation

Viabilité cellulaire (avec test MTT) de cellules MDA-MB-231 incubées avec des NP FePt et FePt@PPy avec différentes concentrations pendant 48 h

Pourcentage de cellules vivantes parmi les cellules traitées avec des NP FePt@PPy sous différentes densités de puissance laser et différents temps d'irradiation. un L'irradiation a été réalisée pendant 4 min. b L'irradiation a été effectuée pendant 6 min

Images en champ clair et en fluorescence des cellules MDA-MB-231 dans différentes conditions. un Contrôler. b Laser uniquement. c 50 μg/mL FePt@PPy NPs + laser. d 70 μg/mL FePt@PPy NPs + laser. e 100 μg/mL FePt@PPy NPs + laser. Toutes les solutions ont été irradiées avec un 1 W/cm ² Laser 808 nm pendant 6 min

un L'image optique et les images thermographiques NIR correspondantes de la souris nude avant injection de FePt@PPy NPs. b Le côté gauche :l'image optique de la souris nude avec injection sous-cutanée. Le cercle rouge en pointillé indique l'emplacement de l'injection. Le côté droit :l'image thermographique NIR de la souris nue après 6 min sous irradiation à un laser de 808 nm (1 W/cm ² ). A noter que la chauffe maximale correspond au site d'injection. c Changement de température de la surface de la peau au site d'injection et chez les souris avec irradiation au laser 808 nm (1 W/cm ² ) pendant 6 minutes

Configuration expérimentale du système PAI

Évaluations des réponses PA des NP FePt@PPy à diverses concentrations :a fantôme et b images PA correspondantes

Les spectres d'absorption UV-Vis-NIR des NPs FePt, PPy et FePt@PPy purs sont donnés sur la Fig. 3. La forte absorption dans la région NIR a été observée pour les nanoparticules composites. Les spectres d'absorption de FePt et PPy peuvent contribuer ensemble à celui des NP FePt@PPy. Les propriétés optiques des dispersions aqueuses FePt@PPy NP à différentes concentrations (de 20 à 120 μg/mL) ont également été enregistrées par la spectroscopie UV-Vis-NIR. Comme représenté sur la figure 4a, avec une augmentation de la concentration de FePt@PPy NP, l'intensité de la photoabsorption de l'ensemble de la région UV-Vis-NIR a augmenté.

Performance photothermique des NP FePt@PPy

Les comportements photothermiques des NPs FePt et FePt@PPy purs ont été comparés sur la Fig. 4. Les NPs FePt et FePt@PPy purs avec la quantité fixe de FePt ont été irradiés par un laser de 808 nm à une densité de puissance de 1 W/cm ² . Les NP FePt@PPy ont montré un excellent comportement photothermique par rapport aux NP FePt purs. Ces données ont indiqué que la couche de PPy a amélioré l'efficacité photothermique de l'ensemble du système.

Comme le montrent les Fig. 5a, dans les mêmes conditions de laser NIR (5 min, 1 W/cm ² ), la température de la solution contenant 20 μg/ml de FePt@PPy NPs est passée de 25 à 39,3 °C tandis que celle contenant 120 μg/ml de FePt@PPy NPs a rapidement atteint 71 °C. De plus, des images thermographiques (Fig. 5c) ont indiqué la conversion efficace photothermique de l'échantillon contenant des NP FePt@PPy irradiées avec un laser de 808 nm. Des NP FePt@PPy (50 μg/mL) ont été exposées à une irradiation laser NIR à différentes densités de puissance laser de 0,5, 1,0 et 1,5 W/cm ² pendant 6 min, et les températures résultantes étaient respectivement de 41,1, 51,3 et 59,4 °C. Ces résultats expérimentaux ont révélé que le temps d'exposition, la concentration de nanoparticules et l'intensité de la puissance laser sont des paramètres importants qui influencent de manière significative les performances photothermiques des NP FePt@PPy.

Tests de stabilité photothermique des NP FePt@PPy

Outre la forte transduction photothermique, la photostabilité des nanoparticules est importante en PTT. Une solution de FePt@PPy NP de 50 μg/mL a été irradiée avec le laser NIR 808 nm à 1,0 W/cm ² jusqu'à ce que la solution atteigne la température la plus élevée, puis se refroidit naturellement à température ambiante en éteignant le laser. Après six cycles de chauffage et de refroidissement, la courbe thermique des NP FePt@PPy est restée presque la même pour chaque cycle (Fig. 4d). Les spectres UV-Vis-NIR avant et après l'exposition au laser sont illustrés à la Fig. 6c. Aucun changement significatif n'a été observé pour l'ensemble des spectres. Les résultats ci-dessus ont indiqué une bonne stabilité photothermique des NP FePt@PPy pendant une longue période d'irradiation laser NIR.

Test de stockage à long terme

La taille des particules et les spectres d'absorption UV-Vis-NIR des nanoparticules préparées ont été surveillés pendant les 30 jours de stockage. Premièrement, aucune agrégation n'a été observée dans toutes les solutions contenant des NP FePt@PPy (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3a). Deuxièmement, les NP FePt@PPy dans les milieux de culture cellulaire à une concentration de 120 μg/mL n'ont montré aucun changement significatif dans leurs spectres UV-Vis-NIR (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3b) après les 30 jours de stockage. De plus, la taille moyenne des particules des NP FePt@PPy est restée presque inchangée pendant le stockage à long terme (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3c). Tous les résultats ci-dessus ont clairement prouvé la stabilité des nanoparticules préparées.

Test de cytotoxicité cellulaire in vitro

Pour le traitement du cancer, les nanoparticules doivent avoir une excellente biocompatibilité. Comme le montre la figure 7, les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 ont été traitées avec des NP FePt et FePt@PPy pures à différentes concentrations et incubées pendant 48 h. Aucune cytotoxicité significative des NP FePt@PPy n'a été observée, même à la concentration testée la plus élevée (120 μg/mL), et la viabilité cellulaire des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 était toujours supérieure à 95 %. Pour les NP de FePt pur, 120 μg/mL de nanoparticules irradiées ont tué 20 % des cellules cancéreuses. Ce résultat a indiqué que le revêtement de la couche de PPy améliorait la biocompatibilité des NP FePt, et les NP FePt@PPy peuvent être considérées comme un matériau non toxique.

Captation cellulaire

La coloration au bleu de Prusse, qui repose sur la réaction du fer et du ferrocyanure de potassium en solution acide, a été réalisée pour détecter l'absorption cellulaire des NP FePt@PPy. Comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S2, la plupart des cellules étaient colorées avec des taches bleues à l'intérieur des cellules, indiquant l'absorption cellulaire des NP FePt@PPy.

Thérapie photothermique in vitro

Le test MTT standard a été effectué pour évaluer l'efficacité des NP FePt@PPy irradiées sur la capacité de destruction des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231. Tout d'abord, les cellules cancéreuses ont été incubées avec différentes concentrations de FePt@PPy NP pendant 24 h, puis exposées au laser 808 nm à 1 W/cm ² pendant 4 minutes. Comme le montre la figure 8, le pourcentage de viabilité cellulaire a été progressivement diminué lorsque la concentration des nanoparticules traitées a été augmentée. Environ 50 % des cellules sont mortes à une concentration de 100 μg/mL de NP FePt@PPy irradiées. Afin de tuer plus de cellules cancéreuses, le temps d'irradiation a été augmenté jusqu'à 6 min. Avec une concentration de 100 μg/mL, environ 70 % de cellules mortes ont été observées. A comparison of the photothermal therapy performance between the proposed system and some reported nanoparticles was conducted in Additional file 1:Table S1. It is found that the proposed system shows comparable capability in killing cancer cells (i.e., 70% cell death) with quite low nanoparticle concentration (i.e., 100 μg/mL) under relatively weak power density condition (i.e., 1 W/cm ² ) and short irradiation time (i.e., 6 min).

In addition, by using the fluorescence imaging technique of five groups, we conducted experiments on the cancer cells to consider the killing capability of the prepared nanoparticles:the control groups (only cells), the laser-only group (cells were exposed to the 808-nm laser), the 50-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), the 70-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), and the 100-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser).

Double staining of Hoechst 33342 and PI was used to explore the damaged and dead cells. Hoechst 33342 is a DNA dye, which can be permeable in both dead and viable cells [20]. The changes in the size and shape of nuclei of the Hoechst 33342 stained cells can be observed under fluorescence microscopy. With the apoptosis cells, Hoechst 33342 will make the condensed chromatin brighter than that in a normal cell. PI dye also binds to DNA, but it only permeates through the membrane of damaged and dead cells [21]. Thus, double staining can differentiate between dead cells and live cells by each treatment method.

As shown in Fig. 9, the cancer cells exposed to the NIR laser in the presence of the FePt@PPy NPs emit strong fluorescence, whereas the slight fluorescence is emitted by cancer cells in the absence of the nanoparticles. Only a few dead cells with the red nuclei were observed in the control and laser-only group (Fig. 9a, b). In contrast, many cells in the FePt@PPy NPs + 808-nm laser groups died and displayed red nuclei, as observed in Fig. 9c–e. After incubation for 24 h, some dead cells lost the binding ability and were washed out of the cell disk. Therefore, the intensity of cancer cells in the 100-μg/mL of FePt@PPy NPs + 808-nm laser group was less than the others. Conclusively, almost cancer cells which were treated with 100-μg/mL of FePt@PPy NPs was destructed after being exposed to the 808-nm NIR laser at a power density of 1.0 W/cm ² .

In Vivo Laser Heating Experiment

The potential ability of FePt@PPy NPs for laser-induced heating was finally tested in an animal model. The nude mouse was subcutaneously injected with 100 μL of an aqueous FePt@PPy (100 μg/mL) NPs in PBS. Figure 10a presents the optical and NIR thermographic images of the nude mouse before injection, pointing out the temperature of mouse surface’s skin is about 36 °C. Fig. 10b (left side) shows an optical image of the mouse in which the injection site is indicated by a dashed red circle. The injected area was irradiated with the 808-nm laser at 1 W/cm ² for 6 min, and the NIR thermographic image of this mouse is shown in Fig. 10b (right side). The temperature of the skin’s surface was continuously monitored with an NIR thermographic camera. The time evolution of the surface temperature during the 6 min irradiation is shown in Fig. 10c, figuring out a temperature increment of the skin about 19 °C. From that, we can see clearly that the injected FePt@PPy NP area with laser irradiation produced a high temperature, as required for tumor ablation. Moreover, the heating area was found to be well localized at the injection site as shown in the NIR thermographic image (Fig. 10b, right side). Conclusively, with the excellent laser-induced heating properties, FePt@PPy could be a novel promising agent for photothermal therapy.

In Vitro Photoacoustic Imaging

The top-view image of the phantom filled with pretreated cancer cells is shown in Fig. 12a. The corresponding PAI acquired at the 808-nm laser from the sample in Fig. 12a is illustrated in Fig. 12b.

PAI is an emerging imaging modality and can be used to assist phototherapy [22]. All the samples containing pretreated cells were clearly visible, whereas the controlled samples with 4% gelatin did not produce any PA signal. The magnitude of the PA signal was increased when the concentration of nanoparticles increased. The ability to image FePt@PPy NPs inside phantom with the PAI system is very promising for image-guided photo-induced cancer therapy. The laser system for PAI, which was used in conjunction with FePt@PPy NPs, also showed the potential for future implementations.

Conclusions

In this study, we developed the photoabsorber FePt@PPy NPs and evaluated their efficiency on in vitro PTT and PAI (Scheme 2). The prepared FePt@PPy NPs showed many good properties for PTT and PAI including excellent biocompatibility, photothermal stability, and high NIR absorbance. Moreover, in vitro investigation confirmed the effectiveness of the FePt@PPy NPs in killing the cancer cells under the NIR laser. So far, the phantom test of PAI used in conjunction with FePt@PPy NPs showed a strong PA signal. Owing to their good properties, the novel FePt@PPy NPs could be considered as promising multifunctional nanoparticles for further applications in PTT and PAI.