Synthèse microplasma éco-compatible de points quantiques de carbone à émission jaune pour imagerie cellulaire cancéreuse et inactivation photocatalytique

Résumé

Ces dernières années, les nanoparticules multifonctionnelles combinant fonctions diagnostiques et thérapeutiques montrent un grand potentiel en nanomédecine. Dans cette étude, nous rapportons la synthèse écologiquement responsable de nano-points de carbone fluorescents, tels que les points quantiques de carbone (CQDs), par microplasma en utilisant l'o-phénylènediamine. Les CQDs produits présentent des pics d'absorption larges à 380–500 nm et émettent une fluorescence jaune brillante avec un pic à 550 nm. Les CQDs sont rapidement internalisés par les cellules cancéreuses HeLa. Sous excitation par lumière bleue, un signal de fluorescence jaune brillant et des espèces réactives de l'oxygène (ROS) intenses sont efficacement produits, permettant une imagerie fluorescente simultanée des cellules cancéreuses et une inactivation photodynamique, avec une diminution de 40 % de la viabilité cellulaire relative. De plus, environ 98 % des cellules restaient actives après incubation avec 400 µg mL⁻¹ CQDs dans l'obscurité, révélant l'excellente biocompatibilité des CQDs. Ainsi, les CQDs nouvellement préparés sont démontrés comme des matériaux potentiellement efficaces et sûrs pour le bio-imagerie in vivo et la thérapie cancéreuse guidée par imagerie.

Introduction

Le cancer reste une cause majeure de décès dans le monde. Les nanoparticules multifonctionnelles avec fonctions diagnostiques et thérapeutiques ont des applications prometteuses en nanomédecine. La thérapie guidée par imagerie simultanée est un nouveau concept dans le traitement du cancer et montre un grand potentiel pour l'optimisation de l'efficacité thérapeutique. Elle peut fournir des informations utiles sur la taille et la localisation des tumeurs, la fenêtre temporelle optimale pour la photothérapie, et l'efficacité thérapeutique. La thérapie photodynamique (PDT) a été utilisée pour traiter de nombreux cancers et autres maladies grâce à sa sélectivité spatio-temporelle et sa nature non invasive. Les photosensibilisateurs idéaux possèdent généralement : (1) génération hautement efficace d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), (2) bonne biocompatibilité, (3) solubilité dans l'eau. Cependant, les applications actuelles de la PDT sont limitées par la faible solubilité dans l'eau, l'instabilité, et les longueurs d'onde d'excitation sous-optimales des photosensibilisateurs. Il est donc nécessaire de générer des substituts de photosensibilisateurs avec bonne solubilité et biocompatibilité par des méthodes écologiques et peu coûteuses.

Les points quantiques de carbone (CQDs) ont reçu une attention considérable en raison de leurs propriétés bénéfiques uniques : synthèse simple et écologique, faible toxicité, biocompatibilité remarquable, excellente solubilité dans l'eau, et stabilité à la lumière. Les CQDs ont des utilisations potentielles en imagerie cellulaire, biosensing, administration ciblée de médicaments, et autres applications biomédicales. Il existe deux approches majeures pour la synthèse des points de carbone : bottom-up et top-down. Les méthodes top-down incluent l'oxydation électrochimique, l'ablation laser, l'oxydation chimique, et la synthèse ultrasonique. Les méthodes bottom-up consistent en traitement hydrothermal, synthèse micro-ondes, et décomposition thermique. Cependant, les hautes températures, pressions, et acides forts requis entraînent toujours une consommation d'énergie substantielle, des processus compliqués, et des dommages inévitables à l'environnement. Par conséquent, de nouvelles méthodes de synthèse écologiques émergent. Comme rapporté, les CQDs peuvent être produits en quelques minutes seulement par une méthode microplasma-liquide sans condition de haute température, grand apport d'énergie, et procédures laborieuses. Les microplasmas fournissent un environnement physicochimique unique pour les études fondamentales et applications impliquant matériaux avancés. Les environnements chimique et électronique fournis par les microplasmas sont hautement hors équilibre et peuvent stocker de l'énergie. Dans cet environnement, un grand nombre d'électrons, ions, radicaux libres, et autres substances excitées-ionisées-actives peuvent être produits. Bien que l'o-phénylènediamine soit une matière première pour la synthèse de nano-points de carbone, elle n'a pas été utilisée en synthèse microplasma.

Dans cette étude, l'o-phénylènediamine a été utilisé comme matière première pour synthétiser des CQDs par traitement microplasma. Les CQDs générés étaient uniformes en taille (~3,2 nm de diamètre) et présentaient un pic d'émission vers 550 nm. Nous avons démontré que les CQDs nouvellement synthétisés pouvaient produire une grande quantité de ROS sous conditions de lumière. In vitro, les CQDs pouvaient être absorbés par les cellules tumorales HeLa et émettaient une lumière jaune sous excitation par longueur d'onde bleue 420–500 nm avec faible toxicité. Nous avons aussi observé l'inactivation des cellules tumorales HeLa sous irradiation à 460 nm. Ces résultats suggèrent que les CQDs nouvellement préparés pourraient être des matériaux prometteurs pour le bio-imagerie in vivo, la thérapie cancéreuse guidée par imagerie ou ciblée.

Résultats et discussion

Caractérisation des CQDs

Les CQDs à émission jaune de cette étude sont préparés de manière simple et écologique par une méthode microplasma utilisant l'o-phénylènediamine comme précurseur de carbone. Bien que la méthode de traitement microplasma ait été rapportée pour la synthèse de nano-points de carbone, il existe peu de recherches relatives. La figure 1A montre les images MET des particules CQD. Les particules produites par microplasma étaient cycloïdes ou ovales avec un diamètre moyen de 3,2 nm. Comme le montre l'image haute résolution Fig. 1A (encart), la distance de réseau dans les CQDs est de 0,21 nm, appartenant au plan (1,1,0) du graphite. Le spectre Raman montre que le mode D (désordre) se situe vers 1342 cm⁻¹ et le mode G vers 1507 cm⁻¹, dus à l'hybridation sp³ et sp² du carbone (Fig. 1E). L'intensité du mode D comparée au mode G dépend de la taille des micro-cristaux de graphite. Un désordre plus élevé entraîne un ratio ID/IG plus élevé et des micro-cristaux plus petits. Les modes D et G des poudres CQD peuvent être vus comme de petits flocons de graphite avec ratio ID/IG relativement élevé (0,77).

L'IRTF et le XPS sont des outils puissants pour caractériser la composition chimique et la structure des matériaux à base de carbone. Les données IRTF pour CQDs ont été enregistrées entre 400–4000 cm⁻¹ (Fig. 1F). Le spectre IRTF révèle que les CQDs contiennent principalement des groupes amine (3052 et 3324 cm⁻¹), OH (3200 cm⁻¹), C=O (1595 cm⁻¹), C–N/C–O (1200 cm⁻¹), C=C (1500 cm⁻¹) et CH (748 cm⁻¹). Les composants de surface des CQDs, déterminés par XPS, étaient cohérents avec les résultats IRTF. Le spectre complet (Fig. 2A) montre trois pics typiques : C 1s (285 eV), N 1s (400 eV), O 1s (531 eV).

Comme le montrent Fig. 2B–D, l'analyse C 1s révèle la présence de carbones sp²/sp³ (C–C/C=C, 284,8 eV), carbones nitreux (C–O/C–N, 285,9 eV), et carbones carbonyl (C=O, 287,7 eV). La bande N 1s est déconvoluée en trois pics à 399,3, 400,3, et 401,7 eV, correspondant à N pyrrolique, N graphitique, et N amino respectivement. La bande O 1s contient des pics à 531,6 et 533,1 eV pour C–O et C=O. L'existence de ces groupes fonctionnels confère aux CQDs une solubilité favorable. Les propriétés optiques ont été étudiées par spectroscopie de fluorescence et UV-Vis. Les spectres d'émission de fluorescence (Fig. 1C) montrent un comportement d'émission fluorescent dépendant de l'excitation. Excités de 400 à 500 nm, le pic d'émission maximal se décale vers le rouge de 473 à 519 nm et l'intensité diminue fortement. Les spectres UV-Vis (Fig. 1D) montrent un pic d'absorption fort entre 400–490 nm. Les CQDs présentent deux pics d'absorption caractéristiques à 280 et 420 nm, correspondant aux transitions π–π* (C=C aromatique) et n–π* (carboxyle et/ou C–N). Ces propriétés optiques offrent la faisabilité pour l'imagerie biologique simultanée et l'inactivation photodynamique.

Bio-imagerie et cytotoxicité des CQDs

Pour évaluer la capacité des CQDs pour le bio-imagerie et le marquage cellulaire, l'imagerie cellulaire in vitro a été étudiée sur cellules HeLa par microscope confocal laser (CLSM). Les cellules HeLa ont été incubées avec 200 µg mL⁻¹ CQDs pendant 6 h puis préparées pour détection CLSM. Résultat : les cellules HeLa montraient une fluorescence jaune brillante uniformément distribuée (Fig. 3A). Notamment, une faible concentration de 200 µg mL⁻¹ suffisait pour marquer les cellules HeLa avec fluorescence jaune, confirmant le potentiel des CQDs en imagerie cellulaire. Comme rapporté, les nanoparticules de carbone présentent toujours une forte émission seulement dans la région lumière bleue, tandis que les émissions à longueurs d'onde longues sont généralement faibles. Sous excitation UV, les tissus biologiques montrent souvent une autofluorescence bleue et sont vulnérables aux photodommages, entravant sérieusement les applications d'imagerie biologique des nanoparticules de carbone à émissions courtes. Le développement de nanoparticules de carbone à émissions longues est donc largement recherché. Dans cette étude, les CQDs préparés montraient une fluorescence jaune brillante sous excitation 400–450 nm. Cette fluorescence jaune excitée pourrait permettre l'utilisation des CQDs pour la détection de tumeurs profondes. Cependant, il reste un long chemin avant les applications pratiques en imagerie cancéreuse humaine.

Outre les caractéristiques luminescentes, la haute biocompatibilité et la faible toxicité sont requises si les CQDs sont destinés à être développés comme réactifs de bio-marquage potentiels. Pour applications biomédicales, les matériaux doivent être hautement biocompatibles aux dosages recommandés. Pour examiner la cytotoxicité, les cellules HeLa ont été traitées avec CQDs à concentrations finales de 0 à 400 µg mL⁻¹ pendant 24 h. Comme le montre Fig. 3B, plus de 95 % des cellules survivent selon les tests MTT, révélant que les CQDs sont pratiquement non toxiques.

Ces données suggèrent que les CQDs nouvellement générés avec fluorescence jaune excitée ont une faible cytotoxicité et haute biocompatibilité, facilitant leurs perspectives prometteuses en imagerie biologique.

Efficacité de la thérapie photodynamique

Inactivation des cellules cancéreuses

Comme le montre Fig. 3C, la viabilité ne différait pas entre cellules HeLa traitées avec CQDs ou lumière bleue seules. Le traitement simultané CQDs + lumière bleue réduisait marquément la viabilité des cellules HeLa, selon la durée de photo-exposition. Après irradiation à 460 nm pendant 15 min, les CQDs montraient une activité antitumorale remarquable ; la viabilité des cellules HeLa diminuait d'environ 40 % à 200 µg mL⁻¹. Pour détecter davantage les effets des CQDs excités, des tests MTT ont évalué la concentration inhibitrice moitié maximale (IC50) des CQDs excités sur cellules HeLa. Résultat : IC50 d'environ 427,5 µg mL⁻¹ (IC 95 % 366,7–498,7 µg mL⁻¹) après irradiation 10 min, et ~255,1 µg mL⁻¹ (IC 95 % 220,9–249,8 µg mL⁻¹) après 15 min d'exposition à la lumière bleue.

Ces résultats indiquent que les CQDs excités pourraient tuer efficacement les cellules tumorales comme certains médicaments anticancéreux cliniques (ex. Photofrin), suggérant la valeur prometteuse des CQDs en thérapie antitumorale guidée par imagerie.

Génération de ROS par les CQDs

Pendant la PDT, les cellules cancéreuses peuvent être tuées par ROS cytotoxiques générés par le photosensibilisateur endocytosé sous irradiation appropriée. Les ROS inactivent les cellules cibles par apoptose ou nécrose avec peu d'effets secondaires via PDT dans plusieurs maladies. L'inspection de Fig. 4A montre que le réactif ROS émet une fluorescence rouge, indiquant la génération de ROS. De plus, le signal rouge ROS se chevauche bien avec la fluorescence des CQDs, signifiant que la génération de ROS est étroitement associée à l'absorption des CQDs par les cellules tumorales. Comme le montre Fig. 4B, comparé aux groupes contrôle et sans irradiation laser, les groupes expérimentaux sous irradiation laser 460 nm pendant 15 min montraient une génération de ROS évidente. Nos résultats indiquent que les CQDs pouvaient significativement promouvoir la production de ROS intracellulaires sous irradiation laser 460 nm et ont un grand potentiel pour la PDT. En principe, les CQDs peuvent être excités de l'état fondamental (S0 Fig. 4C) à un état excité (Sn Fig. 4C), l'efficacité dépendant de l'intensité de la source lumineuse et du coefficient d'extinction. Après relaxation par solvant, les CQDs restent au niveau de vibration le plus bas du premier état singulet excité. Suite à la relaxation vibrationnelle rapide, l'énergie du photon émis du premier état singulet excité (S1 Fig. 4C) est inférieure à celle du photon d'excitation, résultant en augmentation de longueur d'onde. L'imagerie fluorescente utilise la transition CQDs S0 → Sn → S1. Les CQDs ingérés par cellules HeLa émettaient de la fluorescence sous source de longueur d'onde appropriée, permettant le marquage cellulaire. S1 peut retourner à S0 par fluorescence ou par croisement intersystème vers un état triplet excité non fluorescent (T1 Fig. 4C). Le groupe fluorescent de T1 est particulièrement actif dans les réactions de transfert d'électrons, générant radicaux superoxydes et dégradation subséquente du groupe fluorescent. L'énergie de T1 transférée à l'oxygène moléculaire produirait un agent oxydant oxygène singulet excité plus fort que l'oxygène moléculaire état fondamental. Les radicaux superoxydes, oxygène singulet, et autres ROS (OH, H₂O₂) réagissent avec les molécules biologiques proches pour exercer une phototoxicité, menant à la mort cellulaire. Après absorption par cellules HeLa, l'illumination résultait en transfert de l'état singulet vers l'état triplet par croisement intersystème, le transfert d'énergie produisant ROS et mort cellulaire. Sous source de longueur d'onde appropriée, les CQDs subissent deux types de transfert d'énergie : fluorescence émise pour marquer cellules HeLa, et cellules HeLa tuées par ROS. Nos données révèlent la bonne biocompatibilité des CQDs nouvellement produits dans l'obscurité et l'efficacité de destruction tumorale sous lumière. Donc, les CQDs pourraient être utilisés comme photosensibilisateur pour cellules et tissus tumoraux.

De plus, comment les CQDs peuvent cibler précisément la tumeur et tuer les cellules plus efficacement reste un problème non résolu. L'abondance de groupes fonctionnels hydrophiles de surface (carboxyle, carbonyl, époxy, hydroxyle, etc.) permet aux points de carbone de se conjuguer avec anticorps spécifiques ciblant précisément les tumeurs, nécessitant des biomarqueurs tumoraux spécifiques. Simultanément, les points de carbone pourraient servir d'outil pour l'administration de médicaments et gènes grâce à leur ratio surface/volume élevé. Considérant l'excellente biocompatibilité, la petite taille pour internalisation par cellules tumorales, la richesse en groupes fonctionnels de surface et le potentiel de bio-imagerie, les points de carbone (incluant CQDs) sont considérés comme candidats théranostiques prometteurs pour thérapie tumorale. Cependant, des défis et problèmes non résolus persistent pour les applications des points de carbone en nanomédecine et bio-imagerie. Plus d'efforts sont nécessaires pour promouvoir la translation de la nanomédecine liée aux points de carbone du banc au lit du patient.

Conclusions

En résumé, nous avons synthétisé des CQDs photoluminescents en utilisant l'o-phénylènediamine par la méthode plasma. Excités par laser bleu, les CQDs d'environ 3,2 nm de diamètre émettaient une fluorescence jaune. Les résultats Raman, UV-Vis, IRTF, et XPS montraient que plus d'atomes de carbone étaient impliqués dans l'hybridation sp², formant un nouveau groupe organique. Les CQDs synthétisés par la méthode plasma se sont avérés être une sonde efficace en expériences d'imagerie cellulaire, et la fluorescence jaune émise peut marquer clairement les cellules HeLa. De plus, les CQDs synthétisés montraient une solubilité favorable, non-toxicité, et haute biocompatibilité, accélérant leur capacité de bio-imagerie. En outre, les CQDs excités pouvaient tuer efficacement les cellules HeLa par génération de ROS, exhibant clairement une cytotoxicité photodynamique satisfaisante in vitro et soutenant leurs applications en PDT.

Méthodes expérimentales

Synthèse des points quantiques de carbone

Le système de traitement microplasma est résumé en Additional file 1: Figure S1. Un tube creux en acier inoxydable de diamètre interne 180 µm était connecté à une source d'alimentation haute tension continue (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, Chine) et maintenu à 2 mm au-dessus de la surface de la solution. Une électrode Pt (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, Chine) était connectée à la cathode de la source et immergée dans la solution. Ensuite, 400 mg d'o-phénylènediamine (Shanghai, Chine) étaient dissous dans 40 mL d'eau déionisée, et 20 mL de cette solution étaient ajoutés dans une boîte de Pétri et agités avec un agitateur magnétique. Pendant le traitement microplasma, le gaz argon (Ar) traversait le tube à un débit de 60 sccm, et le courant continu était maintenu à 17 mA. Après 10 min de traitement plasma, le produit brun-noir était dialysé avec une membrane de dialyse (poids moléculaire cutoff 500 Da) contre 2 L d'eau déionisée pendant 12 h, puis filtré à travers une membrane d'ultrafiltration 0,22 µm. Finalement, les CQDs purs étaient obtenus par lyophilisation.

Caractérisation de la structure, composition, et propriétés optiques des CQDs

La taille et la morphologie des CQDs étaient caractérisées par MET avec un système JEM-2100F (JEOL, Tokyo, Japon). La spectroscopie de fluorescence était réalisée avec un spectromètre Perkin Elmer LS 55 (Waltham, MA, USA). Les spectres d'absorption UV/Vis étaient mesurés avec un spectrophotomètre Varian Cary 50 (Palo Alto, CA, USA). Les spectres IRTF étaient obtenus avec un spectroscope Nicolet 6700 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), et la spectroscopie Raman avec un spectromètre micro-Raman UV 800 (Invia-reflex, UK). Les expériences XPS étaient effectuées avec un système Axis Ultra DLD (Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Japon).

Culture cellulaire et essai de cytotoxicité

Les cellules HeLa (ATCC, Manassas, VA, USA) étaient cultivées en milieu DMEM modifié d'Eagle contenant 10 % FBS et 1 % pénicilline-streptomycine à 37 °C en atmosphère humidifiée 5 % CO₂. Pour les études de cytotoxicité des CQDs, les cellules étaient comptées et semées en plaques 96 puits contenant 200 µL de milieu complet à densité de 6000 cellules/puits. Après 24 h de culture, les cellules étaient incubées avec CQDs à concentrations 0, 25, 50, 100, 200, 400 µg mL⁻¹ pendant 24 h, puis les viabilités étaient détectées par tests MTT. Brièvement, ces solutions étaient remplacées par 100 µL solution test MTT (0,5 mg mL⁻¹) et incubées 4 h dans l'obscurité. Le surnageant était éliminé et les cristaux dissous dans DMSO. Finalement, l'absorbance de chaque puits était mesurée à 490 nm. La densité optique était reliée à la viabilité cellulaire en assumant 100 % viabilité pour le témoin sans CQDs.

Le test MTT était aussi utilisé pour évaluer l'IC50 des CQDs excités sur cellules HeLa. Brièvement, cellules HeLa en plaque 96 puits incubées avec CQDs à concentrations 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200, 6400 µg mL⁻¹ pendant 24 h, traitées par lumière 460 nm pendant 10 min ou 15 min séparément, puis cultivées 24 h supplémentaires. La viabilité de chaque puits était détectée par MTT et les données utilisées pour l'évaluation IC50.

Imagerie cellulaire

Des cellules à concentration 2 × 10⁴ mL⁻¹ étaient semées dans une boîte de Pétri confocale (diamètre 15 mm), cultivées 24 h, lavées deux fois au PBS pour éliminer cellules mortes. Une solution CQD (200 µg mL⁻¹ ; pH 7) était ajoutée et les cellules incubées 6 h. Les cellules étaient ensuite lavées trois fois au PBS pour éliminer CQDs non liés et fixées avec 4 % paraformaldéhyde. Les échantillons étaient observés par CLSM (LSM510, Zeiss, Allemagne) avec excitation 400–450 nm.

Thérapie photodynamique et mesure ROS

Pour investiguer les effets antitumoraux, cellules HeLa incubées avec 200 µg mL⁻¹ CQDs pendant 24 h à 37 °C dans l'obscurité, traitées par lumière 460 nm (30 mW cm⁻²) pendant 5, 10, 15 min. Après 24 h incubation, test MTT standard pour viabilité relative. La génération intracellulaire de ROS était détectée chimiquement par méthode spectrophotométrique avec kit Fluorometric Intracellular Ros Assay (sigma, USA). Cellules cultivées en boîte confocale overnight pour adhérence. Incubation avec 200 µg mL⁻¹ CQDs pendant 4 h. Ajout de 100 µL/puits Master Reaction Mix. Après 1 h incubation, fixation 4 % paraformaldéhyde 10 min, observation images fluorescence par CLSM. Pour détection production ROS : cellules en plaques 96 puits avec 200 µL milieu. Après 24 h, milieu remplacé par 100 µL solution CQDs concentrations 0, 100, 200 µg mL⁻¹, incubation 4 h. Lavages trois fois PBS, irradiation 15 min ou non, incubation 100 µL/puits Master Reaction Mix 1 h. Intensité fluorescence détectée par lecteur fluorescence (excitation 520 nm, émission 605 nm).

Analyses statistiques

Les expériences étaient répétées trois fois, analyses statistiques par SPSS19.0. Différences entre deux groupes comparées par test Mann-Whitney U. IC50 évalué par régression non-linéaire. P < 0,05 considéré significatif.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données et matériaux de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Abréviations

PDT :

Thérapie photodynamique

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

CQDs :

Points quantiques de carbone

MET :

Microscope électronique en transmission

CLSM :

Microscope confocal à balayage laser

DMEM :

Milieu modifié d'Eagle de Dulbecco

MTT :

3-(4,5-diméthylthiazolyl-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

IC50 :

Concentration inhibitrice moitié maximale