Nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques ultrasmall pour le suivi de cellules souches dans la thérapie de Parkinson

Résumé

La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par la perte progressive de neurones dopaminergiques dans le mésencéphale, et la transplantation de cellules souches offre une stratégie prometteuse. Dans ces études, le suivi in vivo des comportements biologiques des cellules transplantées est essentiel pour comprendre la fonction des cellules souches et évaluer l'efficacité clinique. Cette étude a développé de nouvelles nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques ultrasmall (USPIO) enrobées d'acide polyacrylique (PAA) et d'amine méthoxypolyéthylène glycol (PEG) par décomposition thermique et modification en deux étapes. Les NP USPIO-PAA/PEG ont un diamètre uniforme de 10,07 ± 0,55 nm et des pics d'absorption des ligands correspondants, comme montré par MET et FTIR. Le test MTT montre que la survie des cellules incubées avec les NP USPIO-PAA/PEG reste supérieure à 96 %. Les USPIO-PAA/PEG synthétisés présentent un bon taux de relaxation de 84,65 s⁻¹ mM⁻¹, indiquant qu'ils peuvent être efficacement internalisés et tracés par IRM. De plus, des cellules souches adipeuses humaines primaires (HADSC) ont été caractérisées, marquées avec USPIO-PAA/PEG et transplantées dans le striatum de modèles rats de MP induits par 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Les cellules marquées ont pu être tracées par IRM jusqu'à 3 semaines après la transplantation ; de plus, la transplantation avec les HADSC marquées a significativement atténué les rotations induites par l'apomorphine dans les modèles MP et augmenté le nombre de neurones dopaminergiques dans la substance noire. Globalement, le développement des NP USPIO-PAA/PEG fournit un outil prometteur pour la technique de traçage in vivo de la thérapie cellulaire et identifie une nouvelle stratégie pour suivre les cellules souches à potentiel thérapeutique dans la MP.

Introduction

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de neurones dopaminergiques dans le mésencéphale. L'atteinte relativement focale en fait un bon candidat pour les thérapies cellulaires. Plusieurs types cellulaires, du tissu mésencéphalique fœtal aux neurones induits dérivés de cellules souches embryonnaires (ESC) ou de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), ont été impliqués dans le traitement de la MP ; cependant, les préoccupations éthiques et le risque potentiel de tumorigenicité ne peuvent être évités. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont une population multipotente rapportée comme outil thérapeutique prometteur pour les maladies neurodégénératives, dont la MP. Comparées à d'autres types, les CSM montrent une bonne prolifération, une disponibilité étendue dans le corps humain et une capacité immunosuppresseure. Certaines études ont montré que la transplantation intracrânienne de CSM favorise la neuroprotection, la différenciation neuronale et l'immunomodulation. Dans ces études, le suivi in vivo de la viabilité, migration et intégration des cellules transplantées est essentiel pour comprendre la fonction des cellules souches et évaluer l'efficacité clinique.

Pour mieux analyser les effets thérapeutiques des cellules transplantées, divers traceurs ont été développés. La sécurité et l'efficacité des traceurs sont les facteurs les plus critiques. Comparé au marquage par protéines fluorescentes, le suivi par particules superparamagnétiques d'oxyde de fer (SPIO) n'apporte aucune modification génétique aux cellules transplantées. Plusieurs études ont utilisé les SPIO comme agent de contraste efficace pour visualiser et suivre les cellules transplantées. Cependant, certains SPIO commerciaux affectent les fonctions normales des CSM ; des efforts considérables ont donc été consacrés au développement de nouveaux SPIO. Cette étude a synthétisé des nanoparticules SPIO ultrasmall (USPIO) enrobées de PAA et d'une couche subséquente de PEG. Les nouveaux USPIO-PAA/PEG montrent une bonne internalisation cellulaire et une capacité de suivi IRM à long terme in vitro et in vivo. De plus, les CSM dérivées du tissu adipeux humain (HADSC) marquées avec USPIO-PAA/PEG ont maintenu leurs caractéristiques biologiques, améliorant les troubles comportementaux et augmentant l'immunoréactivité TH dans la substance noire de modèles animaux de MP.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Acétylacétonate de fer, TREG (triéthylène glycol), diéthylène glycol et PEG achetés chez Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Chine). Bromure de méthylthiazolyldiphényl-tétrazolium (MTT) chez Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine). Milieu modifié de Dulbecco (DMEM), trypsine-EDTA (0,25 %) et sérum fœtal bovin (FBS) chez Thermo Fisher Scientific. EDC et NHS chez Sigma-Aldrich (Chine). DMF, alcool éthylique absolu et acétate d'éthyle chez Sinopharm Chemical Reagent Corporation. Eau ultrapure par système Millipore. Anticorps antihumains CD90-FITC, CD45-PE, CD34-FITC, CD105-PE chez Biolegend.

Synthèse des USPIO

Les USPIO ont été synthétisés par méthode polyol comme dans des recherches antérieures. Étapes : acétylacétonate de fer 1 mmol et TREG 25 mL mélangés dans un ballon à trois cols connecté à l'argon, condenseur sphérique et thermomètre. Après incubation sous flux d'argon 15 min, le mélange chauffé à 120 °C (vitesse 3 °C/min) maintenu 1 h, puis chauffé à 250 °C à même vitesse maintenu 30 min. Refroidissement naturel, dilution avec 2 mL alcool éthylique absolu, précipitation avec acétate d'éthyle. Sédiment collecté par centrifugation 8000 tr/min 20 min, resuspendu dans alcool éthylique absolu. USPIO stockés dans alcool éthylique absolu à 4 °C.

Préparation des USPIO enrobés PAA/PEG

Les USPIO-PAA obtenus selon un rapport précédent : PAA 1,5 g dissous dans 24 mL diéthylène glycol. Après 5 min flux argon, chauffage à 110 °C maintenu jusqu'à clarification. Solution dispersante éthanol contenant 28 mg USPIO (étape précédente) ajoutée après dispersion ultrasonique. Chauffage final à 210 °C à 3 °C/min, reflux 2 h, refroidissement naturel. Acétate d'éthyle ajouté pour précipiter les NP USPIO, centrifugation 8000 tr/min 20 min, surnageant éliminé. Précipité dispersé dans éthanol, précipitation acétate d'éthyle. Après trois lavages, USPIO-PAA dispersés dans eau ultrapure. Pour améliorer la biocompatibilité, PEG lié à la surface par amidation médiatisée par EDC/NHS. PEG 0,45 g dans 5 ml eau ultrapure ajouté à 15 ml dispersion USPIO-PAA (35 mg Fe) avec 20 mg EDC et 12 mg NHS. Mélange agité mécaniquement température ambiante 2 h, puis 10 ml DMF ajouté, eau éliminée à 40 °C par évaporation rotative. 40 mg EDC et 24 mg NHS ajoutés, mélange température ambiante 48 h. Solution transférée dans sac de dialyse dans eau ultrapure 72 h (remplacement eau toutes les 12 h). Transfert dans tube d'ultrafiltration pour collecter molécules Mr > 30 kD par centrifugation 4000 tr/min 10 min. Produit final dissous dans eau ultrapure, stocké à 4 °C. Dans certains cas, SPIO-PAA/PEG dissous dans l'eau collectés par centrifugation tube ultrafiltration (> 30 kD, Millipore), granulés séchés four vide.

Caractérisation des NP

Taille, distribution, morphologie analysées par MET. Couche d'enrobage mesurée par coloration négative. Après dispersion ultrasonique, USPIO-PAA et USPIO-PAA/PEG en solution aqueuse ajoutés sur réseau cuivre 300 mailles membrane carbone, séchés naturellement, observés au MET (Tecnai G2F20 s-twin, FEI). Spectroscopie infrarouge sur spectromètre FTIR Agilent Cary 600, poudre sèche ajoutée directement. Teneur en Fe par spectrométrie d'absorption atomique flamme (FAAS, PerkinElmer Analyst 700) : solutions étalons Fe 1-5 μg/mL pour courbe étalon, puis 100 μL dispersion USPIO-PAA/PEG dissous acide nitrique, dosage dans fiole 50 mL. IRM des NP sur scanners cliniques 3 T (hôpital affilié Université Soochow). NP dispersés dans gel d'agarose 1 % selon concentration. Après solidification, temps de relaxation transverse mesuré par séquence multi-écho. Export DICOM, lecture valeurs de gris par RadiAnt DICOM Viewer, import valeurs aux différents temps d'écho dans Origin pour ajustement, obtention temps relaxation transverse des dispersions USPIO à différentes concentrations ; taux relaxation transverse r2 obtenu par ajustement linéaire 1/T2 vs concentration Fe. Boucles d'hystérésis magnétique USPIO-PAA et USPIO-PAA/PEG par Quantum Design DynaCool-9 (Université Suzhou Science Technologie).

Isolation et identification des HADSC

Études conformes aux « Principes directeurs éthiques sur la recherche sur les cellules souches embryonnaires humaines » (Ministère Science Technologie et Ministère Santé, Chine, 2003) et Déclaration Helsinki. Échantillons adipeux obtenus avec consentement éclairé et approbation éthique (hôpital affilié Université Soochow). Tissu adipeux lavé, découpé après retrait vaisseaux et tissu conjonctif sous microscope anatomique. Blocs digérés collagenase type I (0,3 pzu/mL) 37 °C 30 min, centrifugation 500g 10 min. Culot cellulaire suspendu DMEM + 10 % FBS, ensemencé densité 8 × 10⁴/cm². Après 48 h, vieux milieu avec cellules flottantes éliminé, remplacé par milieu frais.

HADSC caractérisées par cytométrie de flux pour marqueurs de surface : mésenchymateux (CD90, CD105) et hématopoïétiques (CD34, CD45). 1 × 10⁵ cellules incubées avec anticorps conjugués PE, FITC, APC/cy7, PerCP contre CD34, CD45, CD90, CD105 anticorps monoclonaux antihumains souris et contrôles isotypiques. Cellules teintées analysées cytomètre (LSRFortessa, BD, USA), données analysées logiciel FlowJo. Quatre phénotypes CD90+, CD105+, CD34−, CD45− sélectionnés pour marqueurs HADSC. Niveaux d'expression identifiés par cytométrie (BD LSRFortessa).

Différenciation adipogénique et ostéogénique évaluées par coloration Oil Red O et Alizarin Red. HADSC cultivées avec milieu différenciation adipogénique MesenCultTM (Stem cell Tech., 05412) ou kit ostéogénique OriCellTM (Cyagen, HUXMA-90021). Adipogénique évaluée jour 14 par Oil Red O pour adipocytes matures lipidiques. Ostéogénique évaluée jour 21 par Alizarin Red pour nodules calcifiés ostéocytes matures. Images microscope inversé Nexcope.

Internalisation cellulaire in vitro des USPIO-PAA/PEG et évaluation biocompatibilité

HADSC ensemencées plaque 6 puits densité 1 × 10⁶/puits. Incubation milieu contenant USPIO-PAA/PEG (Fe 10 μg/mL et 0,1 μg/mL) 2 h, coloration bleu de Prusse (PB) pour identification Fe intracellulaire.

Biocompatibilité déterminée par colorimétrie MTT et essai incorporation 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) (kit prolifération EdU, Thermo). MTT : HADSC plaque 96 puits densité 5 × 10³/puits, incubation concentrations USPIO-PAA/PEG (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL) 24, 48, 72 h. 20 μl MTT (5 mg/mL) ajoutés 4 h, puis 150 μL DMSO dissolution cristaux. Absorbance OD 570 nm lecteur enzymatique (BioTek Synergy HT). EdU : HADSC incubées SPIO-PAA/PEG 160 Fe μg/mL 72 h, puis incubation 10 μM EdU 24 h. Cellules collectées, fixées paraformaldéhyde 4 %, neutralisées glycine 2 mg/mL. Après perméabilisation, incubation solution colorante (complexe Azide 647), taux incorporation EdU évalués cytométrie flux.

Modèle MP induit par 6-OHDA

15-20 rats Wistar mâles (SPF, 220 ± 20 g) pour traçage in vivo HADSC marquées USPIO-PAA/PEG sur modèles MP. Procédures selon Règlements Chine (2017) et approuvées comité soins animaux Académie Chinoise Sciences. Animaux logés illumination contrôlée (12/12 h jour/nuit, allumage 7h) avec accès libre nourriture/eau. Modèle MP par injection 2 points 6-OHDA (Sigma, St. Louis, MO, USA) dans striatum unilatéral. Comme décrit antérieurement, rats injectés stéréotaxiquement 3 μL solution 6-OHDA (5 μg/μL) à 2 coordonnées (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: -4,0 à -6,0 mm ; AP: -1,0 mm, ML: 4,4 mm, DV: -4,5 à -6,5 mm). Tests rotation induite apomorphine (0,5 mg/kg, sous-cutanée) pour valider modèles. Rats injectés apomorphine (0,5 mg/kg) sous-cutanée à 1, 2, 3 semaines post-6-OHDA, scores rotation évalués 30 min champ ouvert. Modèle MP : > 7 rotations/min induites apomorphine = succès.

Transplantation cellulaire et imagerie IRM in vivo

HADSC incubées USPIO-PAA/PEG (concentration Fe 10 μg/mL) 2 h à 80 % confluence. 3 semaines post-modèle MP, 3 × 10⁶ HADSC marquées USPIO-PAA/PEG ou sérum physiologique injectées dans striatum gauche modèles MP à coordonnée (AP: 1,2 mm, ML: 2,2 mm, DV: -4,0 à -6,0 mm). Animaux transplantation recevaient buprénorphine (0,5 mg/kg) immédiatement post-chirurgie et 2 jours après. Tests rotation apomorphine à 1, 2, 3 semaines post-transplantation.

IRM in vivo : animaux imagerie système IVIS petit animal (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) aux 3, 9, 15, 21 jours post-injection sérum physiologique ou HADSC.

Analyse histologique

Cerveaux modèles restants prélevés, sectionnés épaisseur 30 μm analyse 3 semaines post-transplantation (n = 5/groupe). Sections incubées anti-tyrosine hydroxylase (TH, abcam, Angleterre), visualisées anticorps anti-lapin conjugué Alexa-594 (Abcam). DAPI contre-coloration noyaux. Images capturées microscope confocal Leica TCS SP5.

Analyse statistique

Données numériques exprimées moyenne ± EC. Tests t bilatéraux ou ANOVA à un facteur logiciel GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). * p < 0,05, NS = non significatif.

Résultats

Synthèse et caractérisation des nanoparticules

Le design expérimental est figure 1. Les NP USPIO hydrophobes préparées par décomposition thermique. Figures 2a-c : diamètre USPIO originaux 4,07 ± 0,57 nm ; enrobage PAA → USPIO-PAA 6,34 ± 0,54 nm ; modification PEG → USPIO-PAA/PEG 10,07 ± 0,55 nm. Tous sphériques, uniformément dispersés. Analyse statistique : différence significative (F = 10, **p < 0,01, ##p < 0,01) entre diamètres USPIO, USPIO-PAA, USPIO-PAA/PEG, confirmant modification réussie PAA et PEG (figure 2d).

Par absorption infrarouge : USPIO-PAA pic carbonyle 1728 cm⁻¹ (étirement carbonyle PAA) ; USPIO-PAA/PEG pic liaison carbone-azote pliement plan 1595 cm⁻¹ et pic étirement hydroxyle 3440 cm⁻¹ (figure 2e). Tout confirme modification réussie PAA/PEG à la surface des NP.

USPIO-PAA/PEG : bonne réponse magnétique in vitro et biocompatibilité avec HADSC

Capacité imagerie in vitro évaluée par valeurs niveau gris IRM à différentes concentrations (équivalentes Fe). Après ajustement, temps relaxation transverse obtenus. Taux relaxation transverse 1/T2 en ordonnée, concentration Fe en abscisse : taux USPIO-PAA = 107,94 s⁻¹ mM⁻¹ (figure 3a) ; USPIO-PAA/PEG = 84,65 s⁻¹ mM⁻¹ (figure 3b). Les deux montrent bonnes propriétés IRM. Boucles hystérésis magnétiques (figures 3c, d) : aimantation saturation USPIO-PAA ~57 emu/g > 10 000 Oe ; USPIO-PAA/PEG ~40 emu/g > 10 000 Oe. Force coercitive et rémanence proches zéro → superparamagnétisme.

Incubation USPIO-PAA/PEG avec HADSC à différents temps : pas d'effet significatif sur survie (p > 0,05). Viabilité HADSC > 96 % concentration Fe 0-160 μg/mL. Augmentation temps incubation (24-72 h) n'induit pas perte cellulaire significative (figure 4a). Observation similaire avec iPSC (figure 4b). Même à 160 μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG 72 h, capacité prolifération (taux incorporation EdU) non altérée (figure 4c). Données indiquent biosécurité USPIO-PAA/PEG.

Étiquetage efficace ? Incubation HADSC USPIO-PAA/PEG Fe 10 μg/mL ou 0,1 μg/mL 2 h. Figure 4d : grand nombre NP colorées bleu observées dans ~100 % HADSC (Fe 10 μg/mL). Même à 0,1 μg Fe/mL, coloration PB uniforme et dispersée dans presque tous HADSC. Comparé à autres SPIO rapportés, USPIO-PAA/PEG montre haute efficacité d'internalisation cellulaire.

Suivi à long terme des HADSC marquées USPIO-PAA/PEG in vivo dans modèles rats MP

HADSC marquées USPIO-PAA/PEG transplantées striatum gauche modèle MP par injection stéréotaxique. Figure 5 : signal IRM clair striatum gauche 3 jours post-transplantation, indiquant traçage in vivo propre. Observation dynamique J3, J9, J15, J21 : cellules transplantées marquées NP clairement tracées jusqu'à 3 semaines, signaux IRM sans réduction évidente. NP synthétisées ont bon potentiel pour traçage in vivo cellules transplantées.

HADSC marquées USPIO-PAA/PEG exercent effets thérapeutiques dans modèle MP

Évaluation effets thérapeutiques : phénotypage HADSC isolées. Figure 6a : HADSC fusiformes. Cytométrie flux : expression forte marqueurs mésenchymateux CD90 (> 99 %) et CD105 (> 99 %), peu marqueurs hématopoïétiques CD34, CD45 (figures 6b-g). Différenciation adipogénique/ostéogénique possible, montrées par Oil Red O / Alizarin Red (figure 6h). Gouttelettes lipidiques / nodules calcifiés HADSC différenciées, absents cellules HEK293 témoins. HADSC remplissent critères cellules mésenchymateuses.

Rotations apomorphine : 17,1 ± 1,79 ; 28,7 ± 1,77 ; 31,86 ± 1,72 tours/min aux semaines 1, 2, 3 post-injection 6-OHDA → modèle MP validé. Figure 7 : rotations modèles MP réduites à 32,59 ± 1,12 ; 31,85 ± 1,98 ; 31,54 ± 1,74 semaines 1, 2, 3 post-transplantation HADSC marquées NP dans striatum côté lésion. Différence significative groupes sérum physiologique vs HADSC à partir semaine 2 (p < 0,01 semaine 2, p < 0,01 semaine 3 ; n = 5/groupe) → HADSC marquées NP améliorent troubles comportementaux modèles MP.

MP = perte neurones exprimant tyrosine hydroxylase (TH) substance noire. Immunomarquage anti-TH : 6-OHDA réduit neurones TH+ substance noire ; transplantation HADSC striatum modèles MP atténue cette réduction (figure 8). Combiné à l'amélioration troubles comportementaux, conclusion : HADSC marquées USPIO-PAA/PEG exercent effets thérapeutiques modèles rats MP.

Discussion

Thérapie cellulaire = stratégie prometteuse maladies neurodégénératives, front recherche préclinique 20 ans. Traçage cellules transplantées = partie indispensable clarification mécanismes et évaluation effets cliniques ; cependant difficile et freine application thérapie cellulaire. Tomodensitométrie (TDM), imagerie fluorescence proche infrarouge (NIFI) et IRM = méthodes courantes suivi in vivo. Comparé à rayonnement élevé TDM et faible sensibilité NIFI, IRM = bon imagerie tissus profonds, haut contraste, faible rayonnement ionisant → bon candidat traçage in vivo. Développement traceurs IRM adaptés = indispensable promotion application thérapie cellulaire.

SPIO = stratégie marquage simple et fiable visualisation IRM. Pour traçage in vivo long terme, particules SPIO requièrent taille uniforme et ultrasmall, grosses particules → distribution inégale traceurs et interférence circulation sanguine. Efficacité internalisation et biocompatibilité NP = autres indices importants évaluation traceurs. NP entrent cellules par endocytose phase liquide, endocytose médiée récepteurs, phagocytose. Pour meilleure internalisation, SPIO modifiés ligands intermédiaires.

Outre traçage, SPIO appliqué administration médicaments. Distribution tissulaire et clairance pharmacocinétique = indices importants deux applications. Comparé NP-PAA, NP-PAA/PEG = temps rétention sanguin plus long, clairance urinaire plus lente. NP densément enrobées PEG = distribution plus uniforme surfaces muqueuses épithéliales (tractus gastro-intestinal, système respiratoire, tumeur cérébrale). Enrobage PEG réduit fixation protéines et formation couronne → distribution uniforme NP au coût d'internalisation réduite. Comme outil diagnostique et thérapeutique potentiel, capacité marquage SPIO-PAA/PEG sur CSM et application troubles cérébraux (MP) peu étudiée → étude présente conçue pour répondre. Synthèse nouveaux USPIO-PAA/PEG ultrasmall, modification cœurs SPIO ligands PAA et PEG. USPIO-PAA/PEG : diamètre ultrasmall uniforme (10,07 ± 0,55 nm), bonne dispersion aqueuse, biocompatibilité divers types cellulaires, bonne réponse magnétique in vitro/in vivo. Important : signaux HADSC marquées détectables IRM après transplantation cérébrale jusqu'à 3 semaines → bon potentiel application clinique.

MP = perte progressive neurones dopaminergiques substance noire, déficit dopaminergique réseaux dopaminergiques ; voie nigrostriatale (incluant striatum) la plus affectée. Transplantation HADSC marquées USPIO-PAA/PEG striatum modèles MP → amélioration troubles comportementaux ; atténuation perte neurones dopaminergiques substance noire. Ardeshir et al. : transplantation CSM tissu adipeux rat atténue rotations apomorphine modèles MP. Différent transplantation tissu mésencéphale fœtal ou progéniteurs neuronaux dopaminergiques, HADSC effets thérapeutiques principalement effets paracrines, non substitution tissus lésés. CSM = promoteurs immunomodulation, neuroprotection, différenciation neuronale, effets médiatisés sécrétome CSM. Résultats cohérents ; indiquent nouveaux traceurs USPIO-PAA/PEG n'interfèrent pas effets neuroprotection HADSC.

Conclusions

Développement nouveaux traceurs USPIO-PAA/PEG : haute efficacité internalisation cellulaire, excellente biocompatibilité, capacités traçage IRM long terme. HADSC marquées USPIO-PAA/PEG tracées IRM 3 semaines post-transplantation. HADSC marquées atténuent significativement troubles comportementaux modèles MP et augmentent neurones dopaminergiques substance noire. Développement traceur USPIO-PAA/PEG peut fournir outil prometteur recherche et application cellules souches.