Nanoparticules de mPEG chargées d'icariine : protection renforcée contre la cardiotoxicité induite par LPS dans les cellules H9c2

Résumé

L'icariine (ICA), un glycoside de flavonol issu d'Epimedium, présente des propriétés cardioprotectrices, antioxydantes et anti-inflammatoires mais souffre d'une faible solubilité dans l'eau, d'une élimination rapide et d'une faible biodisponibilité orale. Nous avons synthétisé un conjugué hydrophile de polyéthylène glycol monométhyl éther (mPEG) (mPEG‑ICA) via une estérification médiée par l'anhydride succinique, et avons ensuite encapsulé l'ICA libre dans le polymère par dialyse pour former des nanoparticules (NP) chargées d'ICA (ICA‑loaded mPEG‑ICA NPs). La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT‑IR) et la résonance magnétique nucléaire protonique (¹H‑RMN) ont confirmé la conjugaison réussie. La diffusion dynamique de la lumière (DLS) a révélé un diamètre hydrodynamique moyen de 220 ± 13,7 nm avec un potentiel ζ de +2,30 ± 1,33 mV, tandis que la microscopie électronique à transmission (MET) a montré une morphologie sphérique uniforme. Dans le tampon phosphate (PBS) à pH 7,4, les nanoparticules ont libéré 52,8 ± 1,7 % d'ICA sur 72 h ; à pH 6,8, la libération s'est accélérée à 75,7 ± 0,2 % en 48 h. In vitro, les NP ont préservé la viabilité des cellules H9c2, réduit la fuite de lactate déshydrogénase (LDH) et inhibé l'apoptose induite par le lipopolysaccharide (LPS). De plus, les niveaux d'ARNm des cytokines pro-inflammatoires TNF‑α, IL‑1β et IL‑6 ont été nettement supprimés. Ces résultats démontrent que les NP ICA‑chargées mPEG‑ICA offrent une plateforme nanomédecine prometteuse pour atténuer les lésions myocardiques médiées par le LPS.

Introduction

Le remodelage cardiaque suite à une lésion myocardique est largement piloté par une signalisation inflammatoire soutenue, particulièrement via TNF‑α, IL‑1β, IL‑6 et IL‑18. Ces cytokines déclenchent un stress oxydatif, l'activation des fibroblastes et l'apoptose des cardiomyocytes, compromettant finalement la fonction cardiaque. L'icariine (C₃₃H₄₀O₁₅) a été largement rapportée pour exercer des effets immunomodulateurs, antioxydants et anti-apoptotiques dans des modèles précliniques, pourtant son potentiel thérapeutique est limité par l'hydrophobicité, l'élimination systémique rapide et une absorption orale médiocre. Les systèmes de nanovecteurs — tels que les micelles, liposomes et nanoparticules polymériques — ont émergé comme des stratégies efficaces pour améliorer la solubilité des médicaments, prolonger le temps de circulation et atteindre une délivrance ciblée au tissu cardiaque inflammé, en tirant parti de l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR).

Le polyéthylène glycol monométhyl éther (mPEG) offre une hydrophilie, une biocompatibilité et une immunogénicité minimale supérieures au PEG linéaire. En attachant covalentement l'ICA au mPEG‑COOH par une liaison ester, nous créons un amphiphile hydrophile‑hydrophobe capable d'auto-assemblage en nanoparticules. La liaison ester est labile à l'acide, permettant une libération pH‑sensible de l'ICA au microenvironnement légèrement acide (pH ≈ 6,8) caractéristique du myocarde inflammé. Cette étude détaille la synthèse du mPEG‑ICA, l'encapsulation de l'ICA en nanoparticules, la caractérisation physico-chimique, le profil de libération in vitro et l'évaluation de l'efficacité cardioprotectrice contre les lésions induites par LPS dans les cellules H9c2.

Matériaux et méthodes

Instruments expérimentaux

Les instruments analytiques clés comprenaient une balance électronique JA302, un évaporateur rotatif RE52CS‑1, un agitateur magnétique 78HW‑1, un séchoir à soufflerie 101‑OA, un spectromètre FT‑IR NEXUS670, un spectrophotomètre UV‑Vis, un MET Glacios, un dispersateur ultrasonique JP‑010S, un système qPCR en temps réel, un analyseur de fluorescence enzymatique, un microscope inversé Olympus, un microscope à fluorescence Leica, et un incubateur CO₂ Thermo.

Réactifs expérimentaux

Les réactifs de grade analytique provenaient de fournisseurs commerciaux : Icariine (95 %, 1 g, DL070208), LPS (55 mg, Sigma, Z06J9Y52452), mPEG‑Me (250 g, Sigma, MKBT7172), dichlorométhane (500 mL, Sinopharm), 4‑diméthylaminopyridine (100 g, Aladdin), N‑hydroxysuccinimide (100 g, Ruiyong), kit de synthèse cDNA FastKing (Tiangen), kit d'apoptose Biyuntian, kit qPCR SYBR Green (QIAGEN), entre autres.

Synthèse du mPEG‑COOH

Le mPEG (5 g), l'anhydride succinique (0,40 g) et le DMAP (0,50 g) ont été réagis dans 50 mL de dichlorométhane à 60 °C pendant 2 h sous reflux. Le mélange a été évaporé, et le solide blanc résultant a été purifié par dialyse (PMCO 2 kDa) contre l'eau pendant 48 h. Le produit lyophilisé a donné le mPEG‑COOH.

Synthèse du polymère mPEG‑ICA

Le mPEG‑COOH (0,37 g) a été activé avec NHS (0,024 g) et DMAP (0,026 g) dans 10 mL de DMSO sec, puis réagi avec 100 mg d'ICA (dissous dans 5 mL de DMSO sec) sous azote à température ambiante pendant 48 h. Après dialyse extensive contre l'eau et lyophilisation, le polymère mPEG‑ICA a été obtenu.

Préparation des nanoparticules chargées d'ICA (NP)

Le mPEG‑ICA (5 mg) a été dissous dans 2 mL de DMSO et mélangé avec 5 mg d'ICA dans du DMSO, suivi de l'ajout de 5 mL d'eau distillée. Après 15 min d'agitation à température ambiante, le mélange a été dialysé (PMCO 3500 Da) pendant 24 h avec changements d'eau fréquents, puis filtré pour donner les NP ICA‑chargées mPEG‑ICA.

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

Les échantillons ont été mélangés avec du KBr, pressés en pastilles, et scannés de 4000 à 4400 cm⁻¹ pour confirmer les transformations des groupes fonctionnels.

Spectre de résonance magnétique nucléaire protonique

Les échantillons ont été dissous dans DMSO‑d₆ et analysés sur un spectromètre RMN 500 MHz pour confirmer les déplacements chimiques cohérents avec l'estérification.

Spectre UV‑Vis

Une courbe d'étalonnage de l'ICA à 270 nm a été générée ; les concentrations de polymère et de nanoparticules ont été quantifiées à l'aide de cette courbe.

Caractérisation des NP ICA‑chargées mPEG‑ICA

Détection par diffusion dynamique de la lumière

La distribution de taille des particules et le potentiel ζ ont été mesurés avec un Zetasizer 3000hs après lyophilisation et redispersion dans l'eau ; chaque échantillon a été analysé en triplicat.

Observation de la morphologie par MET

Une suspension de NP à 1,0 mg/mL a été déposée sur des grilles de cuivre recouvertes de carbone, colorée avec 2 % d'acide phosphotungstique, et imagerie à 80 kV.

Mesure de la stabilité

Les NP ont été lyophilisées avec 5 % de mannitol, redispersées dans l'eau, et la taille/PDI surveillées pour évaluer la stabilité de stockage.

Détermination du chargement du médicament et de l'efficacité d'encapsulation

Le chargement du médicament (EE%) et l'efficacité d'encapsulation (LC%) ont été calculés à partir de l'absorbance UV‑Vis en utilisant les formules : EE = masse du médicament dans les NP / masse totale des NP × 100 % ; LC = masse du médicament dans les NP / masse initiale du médicament × 100 %.

Libération du médicament in vitro

Les NP ont été placées dans 25 mL de PBS (pH 7,4 ou 6,8) à 37 °C avec agitation à 100 tr/min. Des échantillons (2 mL) ont été prélevés à intervalles définis, remplacés par du milieu frais, et analysés par UV‑Vis à 270 nm. La libération cumulative (%) a été calculée à l'aide de l'équation standard.

Expérience de test cellulaire

Les cellules de cardiomyoblastes de rat H9c2 ont été cultivées dans DMEM + 10 % FBS à 37 °C/5 % CO₂. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (10⁴ cellules/puits) pour les tests de viabilité, LDH, apoptose et qPCR.

Traitement cellulaire avec LPS ou nanoparticules d'ICA

Les cellules ont été divisées en cinq groupes : (1) contrôle (sans traitement), (2) LPS (10 µg/mL) pendant 24 h, (3) ICA (20 µM) + LPS, (4) polymère mPEG‑ICA (20 µM) + LPS, (5) NP ICA‑chargées mPEG‑ICA (20 µM) + LPS.

Test MTT

Après 24 h de traitement, 0,5 mg/mL de MTT a été ajouté pendant 4 h. Le formazan a été dissous dans le DMSO et l'absorbance mesurée à 570 nm.

Libération de lactate déshydrogénase (LDH)

L'activité LDH dans les surnageants de culture a été quantifiée à l'aide d'un kit commercial ; l'absorbance lue à 490 nm.

Coloration Hoechst 33342

La morphologie nucléaire a été examinée après 15 min de coloration avec Hoechst 33342 (1 µg/mL) et imagerie sous microscope à fluorescence. Indice d'apoptose = noyaux apoptotiques / noyaux totaux × 100 %.

Test TUNEL

La fragmentation de l'ADN a été détectée à l'aide d'un kit TUNEL ; les noyaux apoptotiques ont été comptés comme fluorescence verte par rapport aux noyaux totaux colorés au DAPI.

Cytométrie de flux pour détecter l'apoptose

Une double coloration Annexin V‑FITC/PI a été réalisée ; les populations apoptotiques précoces et tardives ont été quantifiées par cytométrie de flux.

Transcription inverse quantitative par chaîne de polymérase (RT‑qPCR)

L'ARN a été extrait avec TRIzol, rétro-transcrit, et amplifié sur un système Bio‑Rad CFX96 en utilisant SYBR Green. L'expression des gènes TNF‑α, IL‑1β, IL‑6 et actine (gène de référence) a été normalisée à l'actine. Les séquences d'amorces sont listées dans le manuscrit original.

Résultats et discussion

Spectres FTIR et ¹H RMN

Les spectres FT‑IR ont affiché des absorptions carbonylées d'ester caractéristiques à 1700 et 1740 cm⁻¹, confirmant la conjugaison réussie. Le ¹H‑RMN a révélé des signaux hydroxyles phénoliques à 12,6 ppm, des protons aromatiques à 7,5 ppm, et des protons méthylènes de la chaîne PEG à 3,5 ppm, confirmant la présence des moieties ICA et mPEG.

Taille des particules, potentiel zêta et MET

Les NP polymères de base avaient une moyenne de 145 ± 15,2 nm (PDI = 0,277), tandis que les NP chargées d'ICA s'étendaient à 220 ± 13,7 nm (PDI = 0,119). Les potentiels zêta passaient de +0,44 ± 0,26 mV à +2,30 ± 1,33 mV au chargement, indiquant une stabilité colloïdale améliorée. Les images MET ont confirmé une morphologie sphérique uniforme (Figure 2).

Chargement du médicament et efficacités d'encapsulation

L'analyse UV‑Vis a donné un chargement de 21,9 ± 0,013 % et une efficacité d'encapsulation de 54,9 ± 0,032 % pour les NP chargées d'ICA, surpassant les NP polymères seules (chargement = 16,5 % ; EE = 41,3 %). Ces valeurs sont cohérentes avec la charge thérapeutique souhaitée.

Détermination de la stabilité

Après lyophilisation avec 5 % de mannitol, les NP redispersées ont présenté une augmentation modérée de taille à 255 nm (PDI = 0,326) tout en maintenant une uniformité acceptable, confirmant la stabilité de stockage (Figure 3).

Libération du médicament mPEG‑ICA‑ICA in vitro

Dans le PBS pH 7,4, l'ICA libre a libéré 77,2 % en 12 h, tandis que les NP mPEG‑ICA ont libéré 44,1 % sur 72 h. Les NP chargées d'ICA ont libéré 52,8 % sur 72 h à pH neutre et 75,7 % en 48 h à pH 6,8, reflétant une libération accélérée sensible au pH (Figure 4).

Viabilité des cellules H9C2 et libération de lactate déshydrogénase

Les tests MTT n'ont révélé aucune cytotoxicité de l'ICA, du mPEG‑ICA ou des NP chargées d'ICA à 20 µM. Après exposition au LPS, la viabilité a chuté à 50,0 % (contrôle = 100 %). Le traitement par l'ICA, le mPEG‑ICA et les NP chargées d'ICA a restauré la viabilité à 55,9 %, 61,0 % et 65,4 % respectivement (p < 0,05) (Figures 5, 6).

Les tests LDH ont montré une augmentation significative de la fuite enzymatique après le traitement LPS ; l'ICA, le mPEG‑ICA et les NP chargées d'ICA ont nettement réduit la libération de LDH, avec l'effet le plus prononcé observé pour les NP chargées d'ICA (Figure 7).

Apoptose cellulaire induite par LPS

La coloration Hoechst 33342 a révélé une condensation et une fragmentation de la chromatine dans les cellules traitées par LPS ; les NP chargées d'ICA ont significativement atténué la morphologie apoptotique (Figure 8). Le test TUNEL a quantifié les taux d'apoptose : le LPS a induit 47,6 % d'apoptose, réduite à 35,5 % (ICA), 26,5 % (mPEG‑ICA) et 17,9 % (NP chargées d'ICA). La cytométrie de flux a corroboré ces résultats, montrant une apoptose totale de 35,9 % dans le LPS versus 16,7 % (NP chargées d'ICA) et 19,2 % (mPEG‑ICA) (Figures 9‑10).

ARNm des cytokines inflammatoires dans les cellules H9c2 induites par LPS

La RT‑qPCR a démontré que le LPS augmentait nettement les transcrits de TNF‑α, IL‑1β et IL‑6. Le traitement par l'ICA, le mPEG‑ICA et les NP chargées d'ICA a supprimé ces cytokines, les NP chargées d'ICA atteignant la régulation négative la plus substantielle (Figure 11).

Ces résultats confirment que les NP ICA‑chargées mPEG‑ICA offrent une cardioprotection renforcée en administrant l'ICA directement au myocarde inflammé, réduisant le stress oxydatif, l'apoptose et la production de cytokines pro-inflammatoires.

Conclusion

Nous avons fabriqué avec succès des nanoparticules ICA‑chargées mPEG‑ICA via une approche hybride chimique‑physique qui améliore nettement la solubilité de l'ICA, la capacité de chargement et la libération soutenue, sensible au pH. Dans les cellules H9c2 stimulées par LPS, ces NP ont restauré la viabilité cellulaire, atténué la fuite de LDH, inhibé l'apoptose et supprimé l'expression des cytokines pro-inflammatoires plus efficacement que l'ICA libre ou le polymère seul. Les données soutiennent le potentiel des NP ICA‑chargées mPEG‑ICA comme nanomédecine ciblée pour traiter les lésions cardiaques inflammatoires.