Préparation de nanoparticules mPEG-ICA chargées en ICA et leur application dans le traitement des dommages cellulaires H9c2 induits par le LPS

Introduction

La réponse inflammatoire participe à l'ensemble du processus pathologique du remodelage ventriculaire et est la principale raison du remodelage rationnel de la cardiopathie après une lésion cardiaque [1, 2]. Ces cytokines pro-inflammatoires, qui comprennent le facteur de nécrose tumorale (TNF)-a, l'IL-1β, l'IL-6 et l'IL-18, entraînent des lésions myocardiques et un remodelage pathologique à long terme [3]. Lorsque les cardiomyocytes sont endommagés, ils peuvent également libérer des DAMP (modèles moléculaires liés aux blessures), tels que le HMGBI, pour activer les cellules endothéliales afin d'exprimer les récepteurs des chimiokines, générer des facteurs inflammatoires et induire une nécrose ou une apoptose des cardiomyocytes [4, 5]. De plus, le HMGB favorise l'accumulation de cellules inflammatoires, telles que les macrophages et les neutrophiles, dans le cœur endommagé par le biais de CXCL12/CXCR4, aggravant la charge cardiaque et les blessures [5]. Par conséquent, le blocage de l'activation de la réponse inflammatoire peut être utilisé comme une stratégie efficace pour réduire le remodelage pathologique du cœur.

Icariin (ICA C₃₃ H₄₀ O₁₅ ) est un composé liposomique extrait de l'herbe médicinale chinoise epimedii [6]. Des études approfondies ont montré que l'ICA est encourageant en tant qu'agent immunorégulateur, cardioprotecteur, antioxydant, anti-inflammatoire et anti-apoptotique [7, 8]. Malgré les propriétés positives de l'ICA, divers facteurs limitent son application, notamment une faible solubilité aqueuse, une courte demi-vie et une faible biodisponibilité orale [9]. Les nanocarriers sont devenus une nouvelle stratégie pour améliorer l'efficacité ciblée, l'anti-inflammation et la protection cardiaque ; en outre, les nanocarriers peuvent surmonter les inconvénients de l'ICA [10, 11].

Récemment, les chercheurs se sont concentrés sur les systèmes d'administration de médicaments [12]. Divers nanosupports ont été développés, tels que les micelles [13], les liposomes [14] et les nanotubes de carbone [15]. Pour réduire la mortalité et la morbidité des maladies cardiovasculaires, il est urgent de concevoir une nouvelle forme de nanodosage chargeant suffisamment d'ACI et ayant des propriétés de libération ciblée.

Pour surmonter les limitations de l'application de l'ICA, nous avons utilisé l'éther monométhylique de polyéthylène glycol (mPEG) comme support [16, 17]. Le mPEG est un dérivé du polyéthylène glycol, qui a des propriétés chimiques stables et une hydrophilie plus forte que le PEG [18]. Cependant, comme l'activité hydroxyle terminale du mPEG est très faible, le mPEG, en tant que nanomatériau chargé de médicament, doit subir une activation hydroxyle. Par conséquent, nous avons utilisé l'ICA comme extrémité hydrophobe et le mPEG carboxyle formé par l'estérification du mPEG et de l'anhydride succinique comme extrémité hydrophile pour la connexion chimique. La liaison ester formée peut accélérer le clivage dans des conditions acides.

Les nanoparticules présentent des avantages uniques dans l'administration de médicaments insolubles [19], de médicaments polymères [20] et de thérapie génique [21]. Semblables au tissu tumoral, les sites inflammatoires myocardiques ont des fonctions de perméabilité et de rétention (EPR) similaires [22]. Des nanoparticules d'une taille d'environ 200 nm peuvent pénétrer à travers l'espace interstitiel pour enrichir le médicament [23]. Les NPs mPEG-ICA ont été préparées à un stade précoce, confirmant leur rôle dans l'ischémie myocardique, mais en raison de l'absence d'ICA de charge, elles n'ont pas pu obtenir le meilleur effet [24]. Par conséquent, un nouveau type de nanoparticule mPEG-ICA chargée d'ICA préparée par la combinaison de la synthèse chimique et du piégeage physique peut non seulement améliorer la solubilité dans l'eau et la charge médicamenteuse de l'ICA, mais également prolonger le temps de libération prolongée des nanopréparations dans l'inflammation du myocarde et améliorer efficacement la biodisponibilité des médicaments, obtenant le meilleur effet du traitement ciblé des dommages cellulaires H9c2 induits par le LPS avec l'ICA. Nous avons étudié la libération d'ICA à partir de NPs mPEG-ICA chargées d'ICA dans des solutions PBS à pH 7,4 et 6,8. De plus, pour étudier l'effet des nanoparticules de mPEG-ICA sur l'inflammation myocardique, nous avons utilisé un lipopolysaccharide (LPS) pour induire des cellules H9C2 afin d'établir un modèle inflammatoire externe, détecté la viabilité cellulaire, le taux d'apoptose et l'expression de l'ARNm des cytokines pro-inflammatoires, puis étudié la effet pharmacodynamique des nanoparticules de mPEG-ICA chargées en ICA dans le processus d'inflammation du myocarde.

Matériaux et méthodes

Instruments expérimentaux

Les éléments suivants ont été utilisés :balance électronique JA302 (Shanghai Suzhan Metrology instrument Co., Ltd.); évaporateur rotatif RE52CS-1 (Usine d'instruments biochimiques de Shanghai Yarong); agitateur magnétique à affichage numérique à température constante 78HW-1 (Hangzhou instrument Motor Co., Ltd.); séchoir électrique 101-OA (Tianjin Telester instrument Co., Ltd.); Spectromètre infrarouge à transformée de Fourier NEXUS670 (Neliko Co., Ltd.); Spectrophotomètre UV-Vis (Beijing Leiboteke instrument Co., Ltd.); microscopie électronique à transmission (TEM Glacios); oscillateur à bain d'eau pour instrument d'extraction dispersive par ultrasons JP-010S (Chine Jiemeng Co., Ltd.); instrument de PCR quantitative à fluorescence en temps réel; instrument d'étiquetage enzymatique multifonctionnel; microscope inversé (société Olympus) microscope à fluorescence (Leica, Heidelberg, Allemagne); incubateur de cellules à dioxyde de carbone (société Thermo).

Réactifs expérimentaux

Les éléments suivants ont été utilisés :nom du réactif pureté/spécification/numéro de lot de production (fabricant) :Icariin (95%/1 g/DL070208 Sahn Chemical Technology Co., Ltd.); lipopolysaccharide (Modèle 055-100 g/Z06J9Y52452 B5 25 mg Sigma Co., Ltd.); éther monométhylique de polyéthylèneglycol (Analytical Pure/250 g/MKBT7172 V, Sigma Co., Ltd.); dichlorométhane (Analytical Pure/500 ml/20171103 Sinopharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); 4-diméthylaminopyridine (Analytical Pure/100 g/L170741 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); N-hydroxysuccinimide (réactif biologique/100 g/RA328L758 Shanghai Ruiyong Biotechnology Co., Ltd.); Méthode en une étape FastKing pour éliminer le premier brin du kit prémélangé de synthèse d'ADNc génomique (Tiangen Biotechnology Co., Ltd.); kit de détection d'apoptose (Biyuntian); Kit quantitatif SYBR Green fluorescence (société QIAGENGmbH).

Synthèse de mPEG-COOH

Le mPEG (5,00 g), l'anhydride succinique (SA, 0,40 g) et la 4-diméthylaminopyridine (rapport molaire 1 :1,5/1,5, 0,50 g) ont été pesés et placés dans un ballon à fond rond de 250 ml. Cinquante millilitres de dichlorométhane ont été ajoutés, chauffés au reflux et agités à 60 °C pendant 2 h. Le dichlorométhane a été éliminé par un évaporateur rotatif à 35 °C pendant une demi-journée, et un solide blanc a été obtenu, qui a été maintenu à température ambiante et à pression atmosphérique pendant une demi-journée jusqu'à ce qu'aucun résidu d'éther n'apparaisse. La poudre a été dissoute dans 50 mL d'eau distillée secondaire et dialysée dans un sac de dialyse de 2 kDa pendant 48 h avec l'eau constamment remplacée. La SA dissoute a été retirée et la substance non dissoute a été filtrée. Le mPEG carboxylé (mPEG-COOH) a été obtenu par lyophilisation du filtrat et pesée.

Synthèse du polymère mPEG-icariine

mPEG-COOH (0,37 g), N -hydroxy succinimide (0,024 g) et 4-diméthylaminopyridine (0,026 g) ont été pesés dans un ballon à fond rond de 250 ml, puis 10 ml de diméthylsulfoxyde déshydraté (DMSO) ont été ajoutés comme solvant et agités à température ambiante pendant la moitié par jour pour activer le groupe carboxyle. Ensuite, 100 mg d'étalon Icariin ont été placés dans un petit tube et 5 ml de DMSO dont l'eau avait été retirée ont été ajoutés pour dissoudre complètement l'étalon. Ensuite, l'échantillon standard a été ajouté au ballon à fond rond et agité pendant 48 h sous la protection d'azote gazeux à température ambiante. Après dialyse continue avec de l'eau distillée secondaire, l'échantillon standard ne contenait pas de DMSO et nous avons confirmé l'élimination du DMSO par UV. Ensuite, le matériau dialysé a été lyophilisé dans un lyophilisateur sous vide pendant 48 h pour obtenir un produit jaune clair, à savoir le polymère mPEG-ICA.

Préparation de nanoparticules (NP) mPEG-ICA chargées en ICA

Le mPEG-ICA (5 mg) a été pesé dans un petit tube, dissous dans 2 mL de DMSO puis agité dans de l'eau à 37 °C pendant 5 min. Cinq milligrammes d'ICA ont été dissous dans une quantité appropriée de DMSO et placés dans un petit bécher, et mPEG-ICA a été lentement ajouté et dissous dans le DMSO, et 5 ml d'eau distillée ont été ajoutés. La solution a ensuite été agitée sur un agitateur magnétique à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, le réactif a été dialysé dans un sac de dialyse 3500 et dialysé dans de l'eau pendant 24 h, au cours desquelles l'eau a été constamment changée, le solvant DMSO a été dialysé propre et les nanoparticules de mPEG-ICA chargées en ICA ont été obtenues après filtration.

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

Des quantités appropriées de polymères standard ICA, mPEG-COOH et mPEG-ICA ont été broyées en poudre dans un mortier d'agate, mélangées avec des quantités appropriées de poudre de KBr sèche et broyées en poudres fines. Après avoir pressé les comprimés, le mélange a été balayé dans un spectromètre infrarouge de Fourier avec une plage de balayage de 4 000 à 4 400 cm/mol ⁻¹ , et ses spectres infrarouges ont été enregistrés. ICA et mPEG-COOH ont été utilisés pour la caractérisation des matériaux, et le polymère mPEG-ICA a été utilisé pour la caractérisation du produit.

Spectre de l'hydrogène par résonance magnétique nucléaire

Les polymères ICA, mPEG-COOH et mPEG-ICA ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO-d6) et chargés dans le tube d'échantillon, qui a été inséré dans le rotor. Ensuite, l'échantillon a été placé sur un spectromètre à résonance magnétique nucléaire à 500 MHz, et les paramètres d'échantillonnage ont été définis.

Spectre UV-Vis

L'étalon Icariin (4,0 mg) a été ajouté à une fiole jaugée de 25 ml, avec du méthanol ajouté à l'échelle, puis agité et dissous jusqu'à ce qu'il soit clarifié. Ensuite, des aliquotes de 0,3 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL et 2,5 mL de solution étalon d'icariine ont été mesurées avec précision dans des fioles jaugées de 25 mL, et du méthanol a été ajouté pour ajuster le volume. Les valeurs d'absorbance des solutions ont ensuite été mesurées sur un spectrophotomètre ultraviolet à une longueur d'onde de 270 nm (longueur d'onde d'absorption maximale), avec du méthanol comme témoin à blanc. Les données ont été enregistrées pour générer une régression linéaire.

Le polymère mPEG-ICA (4,3 mg) a été pesé avec précision dans une fiole jaugée de 25 ml, avec du méthanol ajouté à l'échelle. La solution a été agitée jusqu'à ce qu'elle soit dissoute et clarifiée. Ensuite, une solution d'échantillon de 2,0 ml a été mesurée avec précision trois fois et dissoute dans une fiole jaugée de 25 ml, le volume étant ajusté avec du méthanol. Les valeurs d'absorbance des solutions ont ensuite été mesurées sur un spectrophotomètre ultraviolet à une longueur d'onde de 270 nm (longueur d'onde d'absorption maximale), avec du méthanol comme témoin à blanc, et les données ont été enregistrées trois fois, avec la moyenne prise. Ensuite, la teneur en icariine a été calculée.

Les nanoparticules de mPEG-ICA chargées d'ICA préparées selon la méthode ci-dessus ont été placées dans un flacon de capacité de 25 ml, du méthanol a été ajouté à l'échelle et le flacon a été agité jusqu'à ce que la solution soit dissoute et clarifiée. Ensuite, une solution d'échantillon de 2,0 ml a été mesurée avec précision trois fois et dissoute dans une fiole jaugée de 25 ml, le volume étant ajusté avec du méthanol. Les valeurs d'absorbance des solutions ont ensuite été mesurées sur un spectrophotomètre ultraviolet à une longueur d'onde de 270 nm (longueur d'onde d'absorption maximale), avec du méthanol comme témoin à blanc, et les données ont été enregistrées trois fois, avec la moyenne prise. Les données ont été collectées pour calculer la teneur moyenne en ICA des nanoparticules mPEG-ICA chargées en ICA.

Caractérisation des NP mPEG-ICA chargés ICA

Détection dynamique de diffusion de la lumière

Un granulomètre à diffusion dynamique de la lumière (DLS ; Le zetasizer 3000hs, Malvern instruments, Malvern, Royaume-Uni) a été utilisé pour mesurer la distribution granulométrique et le potentiel des NPs mPEG-ICA chargées en ICA. Les NPs mPEG-ICA nouvellement préparées et chargées en ICA ont été lyophilisées et redispersées dans de l'eau distillée, versées dans une tasse colorimétrique puis placées dans un pool d'échantillons d'analyseur de taille de particules à diffusion dynamique de la lumière pour la détection. Chaque échantillon a été analysé trois fois.

Observation sur la morphologie par MET

La solution de mPEG-ICA NPs chargée en ICA (1,0 mg/mL) a été déposée sur un treillis en cuivre avec un film de carbone et un papier filtre pour sécher. La grille a été placée dans le séchoir et de l'acide phosphotungstique à 2 % (p/p) a été ajouté et laissé sécher naturellement pendant 10 min. Ensuite, les caractéristiques morphologiques des NPs mPEG-ICA chargées en ICA ont été observées à une tension accélérée de 80 kV par microscopie électronique à transmission.

Mesure de la stabilité

Les NPs mPEG-ICA préparées chargées d'ICA ont été lyophilisées avec 5 % de mannitol dans un lyophilisateur sous vide pendant 48 h, puis les nanoparticules lyophilisées ont été redissoutes dans de l'eau bidistillée pour détecter les changements dans la taille de leurs particules et leur valeur PDI. .

Détermination de la charge médicamenteuse et de l'efficacité de piégeage

Une solution de 1,8 ml de mPEG-ICA NP chargée d'ICA a été mesurée avec précision dans une fiole jaugée de 10 ml, 0,2 ml de DMSO a été ajouté et une échographie a été réalisée pendant 2 minutes. L'absorbance de la solution a été déterminée à 270 nm, et le polymère mPEG-ICA avec le même solvant a été utilisé comme blanc. L'absorbance de l'échantillon déterminé a été substituée dans l'équation de la courbe standard et la teneur en Icariine a été calculée. Dans le DMSO/H₂ O = 1/9 système de solvant, l'équation de quasi-courbe de l'Icariin a été mesurée à 270 nm, et la charge en médicament (EE %) et l'efficacité de piégeage (LC %) des nanoparticules ont été calculées.

• Charge de médicament (EE%) = masse de nanoparticules de médicament/masse totale de nanoparticules de charge de médicament × 100 %

• Taux d'encapsulation (LC%) = masse de médicament en nanoparticules/dosage × 100%.

Libération de médicaments in vitro

Cinq millilitres d'ICA libre, de polymère mPEG-ICA et de NPs mPEG-ICA chargés d'ICA ont été placés dans des sacs de dialyse (3500 kDa), qui ont été fixés aux deux extrémités et dialysés dans 25 mL de PBS (milieu de libération) sous 37 °C et Vibration ultrasonore à 100 tr/min (pH = 7,4). Deux millilitres ont été retirés dans des périodes de temps prédéterminées (Tn, n = 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 et 72 h) et remplacé par une nouvelle solution du même volume. Une spectrophotométrie UV-Vis a été réalisée pour déterminer l'absorbance du dialysat à 270 nm aux différents instants. Le rapport en pourcentage de la libération d'ICA a été calculé comme décrit, et trois échantillons ont été mesurés pour calculer la libération moyenne de médicament. La teneur en dialysat a été déterminée par la méthode de la courbe standard et le test de libération a été répété 3 fois in vitro.

La formule de libération du médicament est Q % = (C _n × V + V _n Σ ⁿ _{t =0} C _i )/(W_NP × LC%), où W est le poids de NP, LC% est la charge médicamenteuse des nanoparticules, C _n est la concentration de l'échantillon à Tn, V est le produit total du milieu de libération (25 mL), Vn est le poids de l'échantillon (2 mL) et C _i est T _i (i = 0, 0.5, 1, …., n h ,V ₀ = C ₀ = 0).

Libération des NP mPEG-ICA-ICA dans différents supports de diffusion

Deux millilitres de solution de mPEG-ICA NP chargée d'ICA ont été placés dans un sac de dialyse (4-88 kDa, valeur seuil de poids moléculaire) et placés dans une solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,4 et pH 6,8 (milieu de libération PBS, 37 °C, 25 ml). Ensuite, 2 mL de milieu de libération ont été collectés pour l'échantillonnage et remplacés par une nouvelle solution du même volume à des intervalles prédéterminés (Tn, n = 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 et 48 h). L'absorbance du dialysat à 270 nm aux différents temps a été déterminée par spectrophotométrie UV-Vis. Le rapport en pourcentage de la libération d'ICA a été calculé et trois échantillons ont été mesurés pour calculer la libération moyenne de médicament.

Expérience de test cellulaire

H9c2 (rat H9c2), une lignée de myoblastes ventriculaires de rat, a été achetée auprès de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire de Shanghai, Chine. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM contenant 10 % de sérum bovin foetal (Gibco, USA) à 37 °C dans un CO₂ -atmosphère contenant. Les cellules H9c2 étaient généralement inoculées dans une boîte de culture de 10 cm [25]. Lorsque les cellules ont atteint environ 80 %, elles ont été repiquées avec 0,25 % de trypsine (Gibco). Ensuite, les cellules ont été ensemencées dans les boîtes de culture correspondantes ou des plaques à 96 puits pour les études suivantes.

Traitement cellulaire avec LPS ou ICA-nanoparticules

Les cellules H9c2 ont été divisées en cinq groupes comme suit :(1) groupe témoin :en utilisant un milieu de culture normal, (2) groupe LPS :les cellules ont été traitées avec 10 mg/L de LPS pendant 24 h ; (3) groupe ICA :les cellules ont été traitées avec 20 μmol/L d'ICA (1:1000, DMSO) et 10 mg/L de LPS pendant la même durée, (4) groupe polymère mPEG-ICA :les cellules ont été traitées avec 20 μmol /L de polymère mPEG-ICA et la même concentration finale de LPS pour la même durée; (5) Groupe mPEG-ICA NPS chargé en ICA :les cellules ont été traitées avec 20 μmol/L de mPEG-ICA NP chargés en ICA et 10 mg/L de LPS, les autres conditions étant identiques à celles du groupe ci-dessus.

MTT

La viabilité cellulaire des nanoparticules ICA contre les lésions des cardiomyocytes induites par le LPS a été déterminée par MTT. En bref, les cellules H9c2 ont été traitées avec du LPS et différentes nanoparticules ICA pendant 24 h. Après cela, les cellules ont été colorées avec du MTT à une concentration finale de 0,5 mg/mL pendant 4 h à 37 °C, puis 150 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été ajoutés pour dissoudre les cristaux thyroïdiens. La densité optique a été mesurée à 570 nm dans un lecteur de microplaques (*/SpectraMax i3 Molecular Devices, Afghanistan).

Libération de lactate déshydrogénase (LDH)

Pour étudier l'effet de la nano-ICA sur les dommages de H9c2 induits par le LPS, nous avons évalué la libération de LDH dans le milieu de culture. Brièvement, selon les traitements correspondants pendant 24 h, le milieu de culture a été collecté, et la LDH a été détectée conformément au protocole du LDH Detection Kit (Beyotime Biotechnology). Enfin, la valeur de DO a été mesurée à 490 nm avec un spectromètre.

coloration Hoechst 33 258

La coloration Hoechst 33 258 a été utilisée pour observer la morphologie nucléaire par microscopie à fluorescence. Après traitement, les cellules H9c2 ont été lavées deux fois avec du PBS, fixées dans du tampon paraformaldéhyde à 4 % (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie), rincées avec du PBS et colorées avec Hoechst 33 258 à 37 °C pendant 15 min [26]. Après coloration, les aspects morphologiques nucléaires ont été immédiatement observés au microscope à fluorescence (Leica, Heidelberg, Allemagne). Indice d'apoptose = nombre de noyaux apoptotiques/noyaux totaux × 100%.

Test TUNEL (dUTP nick-end labelling)

Pour la détection de l'intégrité de l'ADN des cellules H9c2, nous avons adopté la technique TUNEL. Les cellules H9c2 ont été cultivées dans une plaque de culture à 24 puits. Après traitement, ils ont été lavés 3 fois avec du PBS et fixés avec du polyformaldéhyde à 4 % pendant 30 min [27]. Ensuite, 1% de Triton X-100 a été ajouté pendant 5 minutes pour augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire. Ensuite, les cellules ont été colorées avec un kit de détection en une étape TUNEL (Beyotime Biotechnology) selon les instructions, et l'apoptose cellulaire a été observée avec un microscope à fluorescence. Le taux d'apoptose de chaque groupe est exprimé en pourcentage de noyaux fluorescents verts (TUNEL-positif) par rapport aux noyaux totaux (bleu) (les noyaux sont colorés au DAPI) [28].

Cytométrie en flux pour détecter l'apoptose

Pour étudier plus avant les effets de différentes nanoparticules ICA sur l'apoptose cellulaire induite par le LPS, nous avons utilisé la méthode de double coloration Annexine V-FITC/PI pour analyser le taux d'apoptose. Après le traitement H9c2 comme décrit ci-dessus, les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans 195 μL de tampon de liaison contenant 10 µL d'Annexine V-FITC et 5 µL de PI, puis incubées pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité. Après centrifugation à 1500 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C, le tampon de coloration a été aspiré et les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et remises en suspension dans 100 µL de PBS. Enfin, les échantillons ont été mesurés par cytomètre en flux.

Reverse transcription quantitative amplification en chaîne par polymérase (RT-qPCR)

La RT-qPCR a été utilisée pour détecter les niveaux d'expression de l'ARNm des marqueurs inflammatoires, notamment le TNF-α, l'IL-1β et l'IL-6. Après que les cellules H9c2 aient été traitées pendant 24 h, l'ARN total a été extrait à l'aide de TRIzol comme décrit précédemment et mesuré à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop™ One/OneC micro ultraviolet-visible (Thermo, ND-ONEC-W, USA). L'ADNc a été synthétisé à l'aide d'un kit ExScript RT, et l'amplification a été réalisée sur une machine de PCR quantitative fluorescente (BIO-RAD CFX96 Touch*) avec le réactif SYBR Green dans les conditions suivantes :95 °C pendant 5 min, 95 °C pendant 30 s, 58 °C pendant 30 s, et un total de 28 cycles. Les amorces utilisées dans cette étude sont les suivantes :

Actine : :

Avant 5′ GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′ ;

Inverser 5′-TTGATGTCACGCACGATTT-3′ ;

TNF-α : :

Avant 5′TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3′ ;

Inverser 5′-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3′ ;

IL-1β : :

Avant 5′GGATGATGACGACCTGCTA 3′ ;

Inverser 5′-CACTTGTTGGCTTATGTTCTG3′

IL-6 : :

Avant 5′TGCCTTCTTGGGACTGAT-3′ ;

Inverser 5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3′.

La quantité de chaque gène cible a été normalisée à celle du gène d'actine. Les expériences ont été répétées en triple.

Résultats et discussion

FTIR et H ¹ Spectres RMN

D'après les spectres mPEG-ICA, les pics d'absorption des vibrations d'étirement de deux liaisons ester (–C=O–) étaient à 1700 ⁻¹ et 1740 ⁻¹ cm. Par rapport aux spectres mPEG-COOH, il y avait un pic de vibration d'étirement C=C excessif à 1650 cm ⁻¹ , indiquant que la synthèse d'estérification d'ICA et de mPEG-COOH a réussi à former mPEG-ICA (Fig. 1).

Spectres FTIR de mPEG-ICA (A ), ICA (B ), et mPEG-COOH (C ). H ¹ Spectres d'hydrogène RMN pour mPEG-COOH et mPEG-ICA

À partir du spectre d'hydrogène mPEG-ICA, 12,6 ppm indiquent les groupes hydroxyle phénoliques ICA en raison de la présence de groupes d'électrons à forte absorption -C =O se déplaçant vers le champ faible. Le pic d'hydrogène du cycle benzénique à environ 7,5 ppm et l'aire de pic de 3,5 ppm sont très grands, jugés comme le -CH₂ –O– pic d'hydrogène dans le polymère mPEG. Un grand nombre d'analyses montrent que le signal d'hydrogène alkyle est de 0 à 2 ppm. Par conséquent, on peut conclure que 1,7 ppm est le pic d'hydrogène à double liaison dans l'ICA. Les pics caractéristiques de mPEG-COOH et ICA apparaissent dans les polymères mPEG-ICA, démontrant la synthèse réussie de mPEG-COOH avec ICA (Fig. 1).

Taille des particules, potentiel zêta et TEM

La taille moyenne des particules des nanoparticules de mPEG-ICA est d'environ (145,0 ± 15,2) nm, et la valeur de l'indice de dispersion (PDI) du polymère est (0,277   ± 0,00). La taille des particules de nanoparticules de mPEG-ICA chargées en ICA a légèrement augmenté, jusqu'à environ (220,0 ± 13,7) nm, et le PDI était de (0,119 ± 0,00). Plus le PDI est petit, plus la distribution des NPs mPEG-ICA chargées en ICA est uniforme. Le potentiel zêta des nanoparticules de mPEG-ICA était de (0,439 ± 0,258) mV, et le potentiel zêta des NPs mPEG-ICA chargées en ICA était de (2,30 ± 1,33) mV. La microscopie électronique à transmission a révélé que les nanoparticules de mPEG-ICA chargées en ICA étaient sphériques, de morphologie régulière et de taille relativement uniforme (Fig. 2).

Taille des particules, potentiel zêta et TEM des NPs mPEG-ICA chargées en ICA

Efficacité de chargement et d'encapsulation des médicaments

La teneur en ICA dans les NPs mPEG-ICA chargées en ICA peut être calculée par spectrophotométrie ultraviolette. La courbe standard de concentration d'ICA a été établie et la teneur en ICA dans le polymère a été obtenue en calculant la concentration de médicament sur la base de la courbe standard. Selon les calculs, basés sur l'absorbance du polymère mPEG-ICA (1,2397 ± 0,1024), la teneur en ICA était de (0,4132 ± 0,0359) mg/mL, avec l'absorbance des nanoparticules mPEG-ICA chargées en ICA (1,6289 ± 0,0923), et la la teneur en ICA était de (0,5496 ± ± 0,3234) mg/mL. Calculée selon la formule de la méthode, la charge médicamenteuse du polymère mPEG-ICA était de (16,5 ± ± 0,014) % et le taux d'encapsulation était de (41,3 ± ± 0,036) %; Le contenu de charge en médicament des NP mPEG-ICA chargés en ICA était de (21,9 ± 0,013) %, et le taux d'encapsulation était de (54,9 ± 0,032) % (tableau 1).

Détermination de la stabilité

La taille des particules de nanoparticules de mPEG-ICA chargées en ICA préparées par la méthode de dialyse était de (220,0 ± 13,7) nm, et le PDI était de (0,119 ± 0,000). Après lyophilisation dans 5 % de mannitol pendant 48 h, les nanoparticules peuvent être redissoutes dans l'eau pour former des nanoparticules stables. La taille des particules était de 255 nm, et le PDI était de (0,326 ± 0,00), ce qui était légèrement plus grand que celui des nanoparticules de dialyse (Fig. 3).

Stabilité des NPs mPEG-ICA chargées en ICA

libération du médicament mPEG-ICA-ICA in vitro

Sur la figure 4, la libération d'ICA dépend largement du pH du milieu de libération. Dans le milieu de libération de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4, de l'icariine libre a été libérée (77,21 ± 0,15)% en 12 h et complètement libérée. Étant donné que les NP mPEG-ICA chargées de médicaments à base d'icariine peuvent augmenter la libération de nanoparticules, la libération de médicaments de nanoparticules mPE-ICA libérées à (44,08 ± 0,12)% en 72 h, et les nanoparticules mPEG-ICA chargées en ICA ont atteint (52,80 ± 1,70) %. Des nanoparticules de mPEG-ICA chargées d'ICA ont été placées dans une solution tampon de pH 6,8, et nous avons constaté que la libération de médicaments induite par les nanoparticules atteignait (75,66 ± 0,17) % en 48 h. Cela est probablement dû au fait que certaines NP mPEG-ICA chargées en ICA avaient des NP dépolymérisées ou que les molécules de mPEG-ICA se brisaient dans les NP. Ces observations ont indiqué que la libération d'ICA était plus favorable dans des conditions acides de pH 6,8. Il a également indiqué que les caractéristiques de libération des nanoparticules de mPEG-ICA chargées en ICA étaient bénéfiques pour le traitement local des lésions inflammatoires du myocarde, car les lésions locales conduisent à un foyer avec un environnement faiblement acide.

Un Libération d'ICA à partir de NPs mPEG-ICA chargées d'ICA dans du PBS à pH 7,4. B Libération d'ICA à partir de NPs mPEG-ICA chargées d'ICA dans du PBS à pH 7,4 et pH 6,8 à 37 °C in vitro

Viabilité des cellules H9C2 et libération de lactate déshydrogénase

Premièrement, pour observer la cytotoxicité des nanoparticules de mPEG-ICA chargées en ICA, nous avons ajouté un médicament libre (20 µM ICA), des NPs mPEG-ICA et des NPs mPEG-ICA chargés en ICA aux cellules H9c2, et les résultats du MTT n'ont montré aucune cytotoxicité marquée de les nanoparticules (Fig. 5). Ensuite, nous avons examiné plus en détail si elles pouvaient protéger les cellules H9c2 contre les lésions induites par le LPS (Fig. 6). Après un traitement au LPS pendant 24 h, la viabilité cellulaire a été réduite à (50,0 ± 3,22) % (groupe témoin 100 %), où le traitement avec l'ICA, les NPs mPEG-ICA et les NPs mPEG-ICA chargées d'ICA a augmenté de manière significative la viabilité des cellules H9c2 en (55,94 ± 1,06)%, (60,97 ± 2,615)% et (65,36 ± 1,214)%, respectivement (P < 0,05).

Evaluation of the cytotoxicity of ICA nanoparticles on H9c2 cells. Data are expressed as the mean ± SEM of three separate experiments

Evaluation of the effects of ICA nanoparticles on LPS-induced H9c2 cell injury. Cell viability in different groups was measured by MTT assay. Data are the mean ± SME. (**P  < 0.01 vs. con; # P  < 0.05 and, ## P  < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In addition, LDH levels are a marker of cell damage; therefore, we measured the release level of LDH in the culture medium (Fig. 7). LDH levels were increased in the LPS group compared with the normal culture group. Treatment with ICA, mPEG-ICA NPs or ICA-loaded mPEG-ICA NPs reduced the LDH level increase induced by LPS, especially in the ICA-loaded mPEG-ICA NP group. These results showed that ICA nanoparticles could protect cells from LPS.

The effect of ICA nanoparticles on the LDH level induced by LPS in H9c2 cells. Data are the mean ± SD. ***P  < 0.01 versus con; ##P  < 0.01 versus LPS treatment group; *&P  < 0.05 versus LPS + mPEG-ICA group

Cell apoptosis induced by LPS

First, nuclear morphology was detected by Hoechst 33,258 staining (Fig. 8). Nuclear chromatin exhibited condensation, breakage and fragmentation after LPS damage in the LPS group. However, for ICA-loaded mPEG-ICA NP group, the number of apoptotic cells obviously decreased. Moreover, we used TUNEL staining to observe cellular DNA breaks or DNA damage (Fig. 9). The number of apoptotic nuclei in the LPS-induced group was (47.57 ± 3.41)% (P  ˂ 0.0001) compared to (6.47 ± 1.87)% in the normal culture group. After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA, the apoptosis rates decreased to (17.92 ± 3.12)% and (26.54 ± 3.68)% and (35.49 ± 4.25)%, respectively, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly reduced the apoptosis rate compared with mPEG-ICA NPs. In addition, flow cytometric analysis in LPS-induced H9c2 cells showed that (35.93 ± 2.23)% of the cells were in the early and late apoptotic stages (Fig. 10). After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs or mPEG-ICA NPs, the total apoptotic rates were reduced to (16.70 ± 2.77)% and (19.15 ± 3.67)%, respectively. These results were in line with the Hoechst 33,258 staining and TUNEL staining findings and indicated that ICA-loaded mPEG-ICA NPs largely prevented the cells from undergoing apoptosis.

Detection of apoptosis by Hoechst 33,258 staining. A Nuclear morphology in cells stained with Hoechst 33,258. B Quantitative analysis of the apoptosis rate by Hoechst 33,258 staining. Data are the mean ± SEM (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Detection of apoptosis by TUNEL. A Cells with TUNEL and DAPI staining; B apoptosis rate. Data are the mean ± SEM (****P  < 0.0001 vs. con; ###P  < 0.005 vs. LPS; &&P  < 0.01 vs. LPS + mPEG-ICA)

A . Apoptotic rate detected by flow cytometry. H9c2 cells were stained by Annexin V/PI double staining. Q1-LL cells were Annexin V/PI double-negative stained, indicating viable cells; Q1-LR cells were Annexin V-positive and PI-negative stained, indicating early apoptosis; Q1-UR cells were Annexin V/PI double-positive stained, indicating late apoptosis. B . Apoptotic rate (%). Data are the mean ± SME. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 and ##P < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Inflammatory cytokine mRNA in LPS-induced H9c2 cells

Next, we evaluated the effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. After LPS treatment for 24 h in H9c2 cells, the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased. These increases were attenuated by ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA treatment, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs treatment markedly lowed TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression (Fig. 11).

Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA IL-1β in the LPS induced H9c2 cells. (**P  < 0.01 compared with con; #P  < 0.05 compared with LPS; &P  < 0.05 compared with LPS + mPEG-ICA.) (2) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA TNF-α. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS group; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA) (3) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on mRNA IL-6. Data are the mean ± SEM (* P  < 0.05 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In this study, we analyzed the suitability of polymer nanoparticles to load ICA for the treatment of LPS-induced H9c2 cell damage. The synthesis method is highly feasible and has many advantages. First, mPEG is nontoxic and has good biocompatibility [29]. In this study, a chemical bonding method was used to assemble mPEG and ICA into an mPEG-ICA polymer, and then dialysis was used to physically wrap the ICA and form stable nanoparticles [30]. Nanoparticles can significantly improve the water solubility of ICA and can realize the long circulation of nanoparticles in the body [31, 32]. Compared with mPEG-ICA nanoparticles, ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles have many significant advantages. First, their PDI value is smaller, which proves that the particle size distribution is more uniform [33]. Second, the drug loading and encapsulation efficiencies of ICA-loaded mPEG-ICA NPs are both higher than those of mPEG-ICA NPs, making it easier to reach the effective drug concentration of ICA [34]. In a pH 6.8 solution, nanoparticles release more drugs, and an acidic environment may destroy the self-assembly force of nanoparticles and accelerate the cleavage of ester bonds, resulting in faster release of the drug into the medium and effective enrichment of the drug in the inflammation site [35, 36]. Huang et al. used LPS-induced osteoblasts to validate the model to explore the anti-inflammatory mechanism of Icariin. They found that Icariin can significantly upregulate the expression of BMP-2 and Runx2 in LPS-induced osteoblasts, thereby achieving effective therapeutic effects [37]. A study has shown that ICA can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by LPS and reduce collagen formation [38]. In addition, ICA can also inhibit the caspase-1 signaling pathway mediated by the NLRP3 inflammasome and reduce LPS-induced sagging [39]. However, LPS-induced cells cannot effectively absorb ICA. Making ICA nanoparticles can solve this problem well. It may be that ICA is loaded by nanocarriers, greatly increasing its water solubility and allowing it to enter cells through free diffusion. At the same time, studies have shown that nanoparticles can promote cell endocytosis and tissue cell efflux and significantly improve the bioavailability of ICA [40, 41].

The results of the MTT assay and lactate dehydrogenase release experiments showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could effectively alleviate the cell damage induced by LPS, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release ICA from the particles. Furthermore, compared with the mPEG-ICA NPs, ICA-loaded mPEG-ICA NPs could load more ICA and release more easily. We also found that these nanoparticles markedly decreased apoptosis induced by LPS to alleviate the inflammatory response in H9c2 cells. Moreover, the antiapoptotic effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs was better than that of mPEG-ICA NPs and ICA. These results indicated that ICA nanoparticles could protect cardiomyocytes from inflammatory injury.

Inflammatory cytokines are the key factors involved in the development and progression of cardiovascular disease and are markers of the inflammatory response [42, 43]. Some researchers have found that TNF-α, IL-1β and IL-6 were closely related to cardiac function. The addition of these inflammatory cytokines to isolated cardiomyocytes resulted in abnormalities in cardiac function and promoted cardiomyocyte loss [44]. Our RT–qPCR results showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could significantly inhibit the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Therefore, these results implied that the protective effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs may occur through controlling inflammatory cytokines.

Conclusion

ICA-loaded mPEG-ICA NPs are a new type of nanomedicine successfully synthesized through nanotechnology (a combination of chemical synthesis and physical embedding). This process not only converts the hydrophobic drug ICA into water-soluble nanomedicine but also successfully improves the load capacity of ICA. In the weakly acidic solution, the ICA release from ICA-loaded mPEG-ICA NPs was greater than that of the neutral solution, indicating that nanoparticles are meaningful for the treatment of inflammatory cardiovascular diseases. Treatment with ICA nanoparticles effectively protected against LPS-induced H9c2 damage, promoted cell viability and inhibited cell apoptosis. Further experiments demonstrated that the new ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release inflammatory cytokine production.

Availability of data and materials

Not applicable.

Abréviations

mPEG:

Polyethylene glycol monomethyl ether

ICA:

Icariin

FT-IR:

Fourier transform infrared spectroscopy

NMR:

Nuclear magnetic resonance spectroscopy

DLS:

Dynamic light scattering

TEM:

Transmission electron microscope

TNF:

Tumor necrosis factor

EPRs:

Permeability and retention functions

SA:

Succinic anhydride

DMSO:

Dehydrated dimethyl sulfoxide