Étude in vitro de l'influence des nanoparticules Au sur les lignées cellulaires HT29 et SPEV

Contexte

La production et l'étude des nanoparticules d'or (AuNPs) ont non seulement un potentiel élevé pour une large application thérapeutique de l'or [1, 2], mais les ont également rendues adaptées à des applications biomédicales spécifiques telles que les thérapies cibles [3, 4]. Des rapports récents ont démontré que l'utilisation des AuNPs offre une opportunité pour de nouvelles thérapies antitumorales avec un risque réduit de développement de résistance. Ainsi, plusieurs études ont prouvé l'activité antitumorale des nanoparticules contre le cancer du sein, du foie, de l'estomac, du colon, du poumon [5, 6].

Il est connu que les nanoparticules (NP) peuvent moduler le destin cellulaire, induire ou empêcher des mutations, initier la communication cellule-cellule et moduler la structure cellulaire [7, 8]. De plus, les AuNPs ont des avantages par rapport aux autres NPs métalliques en raison de leur biocompatibilité et de leur activité antitumorale [8,9,10,11,12]. Les effets cytotoxiques et génotoxiques des AuNPs sont associés à leur forme, taille, charge, concentration, temps d'interaction, etc. [12,13,14]. Ainsi, des informations sur leur toxicité potentielle et leurs effets sur la santé humaine sont nécessaires pour l'utilisation des nanomatériaux en milieu clinique.

Actuellement, malgré le grand succès de la thérapie ciblée, le problème de la délivrance sélective d'AuNPs dans le tissu cible reste non résolu. Certaines études ont noté des taux différents d'absorption des NP par les cellules épithéliales d'origine différente [15, 16]. Pourtant, les recherches pour expliquer ce phénomène font défaut, même si elles peuvent aider à atteindre un ciblage sélectif des AuNPs. Des différences anatomiques ou physiologiques entre différents épithéliums pourraient expliquer les différences dans les taux d'absorption et de transport des AuNP. En particulier, le taux d'absorption peut être influencé par les propriétés de la membrane plasmique des cellules et la liaison des nanoparticules aux glycoprotéines et protéoglycanes de la surface cellulaire, ainsi que par la capacité des cellules pour le transport vésiculaire [17]. Ainsi, compte tenu de l'impossibilité d'une interaction exclusivement sélective des nanoparticules avec les cellules cibles, l'étude comparative des caractéristiques de leur interaction avec les cellules normales et oncogènes afin d'éviter les conséquences indésirables de la thérapie anticancéreuse est d'actualité [8,9,10].

Bien que les modèles in vivo soient précieux pour évaluer la toxicité biologique des nanoparticules, les modèles de culture cellulaire sont très utiles pour les études physiologiques et toxicologiques précliniques. Actuellement, les cultures cellulaires sont largement utilisées dans divers domaines de la biologie, de la médecine, de la médecine vétérinaire et de la biotechnologie. L'utilisation de cultures cellulaires permet d'explorer des processus biologiques difficiles et parfois impossibles à étudier au niveau des organismes. Un rôle important des cultures cellulaires est joué en biotechnologie dans la production de nombreux vaccins, systèmes de test et substances biologiquement actives. Les cultures cellulaires sont utilisées pour diagnostiquer des maladies d'étiologies diverses, en tant qu'objets de test lors de l'essai de nouveaux agents pharmacologiques, thérapeutiques et cosmétiques, ainsi que d'additifs alimentaires [18].

Dans ce travail sur des modèles de culture cellulaire, nous avons essayé d'examiner les caractéristiques des effets des AuNPs des cellules épithéliales d'origine continue et oncogène. La culture monocouche de cellules épithéliales SPEV (lignée épithéliale de rein épithélial embryonnaire porcin) et de cellules HT-29 (lignée cellulaire de carcinome du côlon) peut être considérée comme un modèle de tissus épithéliaux normaux et cancéreux lorsqu'une thérapie anti-tumorale avec AuNPs est appliquée. Plusieurs tests de cytotoxicité traditionnels, y compris l'adhésion, la prolifération, la nécrose/apoptose et les sphéroïdes multicellulaires ont été utilisés pour valider la cytotoxicité cellulaire des AuNP.

Méthodes

Culture des cellules SPEV

Les cellules SPEV ont été cultivées dans des flacons en plastique dans du DMEM (Sigma, USA) avec 5% FCS (v /v ) (HyClone, USA) supplémenté en pénicilline/streptomycine (PAA, Autriche) et amphotéricine B (5 μg/ml) (5% CO₂ , 95% d'humidité) comme rapporté par [19]. La concentration d'ensemencement était de 0,5 à 2 × 10 ⁴ cellules/cm ² . Le milieu de culture a été remplacé tous les 2 jours. Les cellules ont été repiquées à 100 % de confluence [20]. La lignée cellulaire SPEV s'est développée et a préservé la structure morphologique initiale de la monocouche au cours de passages en série sans preuve de dégénérescence cellulaire en culture.

Culture des cellules HT29

Les cellules HT29 ont été cultivées dans des flacons en plastique (Nunc, Danemark) dans du milieu RPMI-1640 (Sigma, USA) avec 10 % de FCS (v /v ) (HyClone, USA) supplémenté avec 2 mM de L-glutamine (Sigma, USA) et 40 mg/ml de gentamycine (Sigma, USA) dans des conditions standard (5% CO₂ , 95% d'humidité) [21]. La densité cellulaire optimale était de 0,5 à 4,0 × 10 ⁴ cellules /cm ² . Les cellules nous ont été gracieusement fournies par la Banque de lignées cellulaires de tissus humains et animaux de l'Institut RE Kavetsky de pathologie expérimentale, d'oncologie et de radiobiologie NAS d'Ukraine.

Manipulations avec AuNPs

Les AuNP ont été aimablement fournies par l'Institut de biochimie et de physiologie des plantes et des micro-organismes de l'Académie des sciences de Russie. Les AuNPs ont été synthétisés par la méthode du citrate [22]. La taille moyenne des nanoparticules était de 15 nm. La concentration initiale d'or était de 57 μg/ml. Les résultats de la microscopie électronique à fond noir, l'image des AuNPs 15 nm et les spectres d'extinction des AuNPs 15 nm (b) sont présentés sur la Fig. 1 (Fig. 1a ; note––diagramme de la distribution des tailles) [23]. Les AuNPs ont été introduites dans les cellules par diffusion passive à 37 °C. Les concentrations étudiées étaient de 1, 3, 6 et 12 μg/ml. Les cellules sans AuNP dans les mêmes conditions ont été prises comme témoins.

Résultats de la microscopie électronique à fond noir, a image de 15 nm AuNPs (note––diagramme de la distribution des tailles), b spectres d'extinction des AuNPs de 15 nm

Cellules d'adhérence et de prolifération

L'état morphofonctionnel des cultures cellulaires a été jugé par les propriétés adhésives et l'activité proliférative. Les propriétés adhésives des cellules SPEV et HT29 ont été évaluées visuellement à l'aide d'un microscope inversé; le nombre de cellules collées et aplaties a été compté 30, 60, 120, 180 et 1440 min après le début de la culture.

La dynamique de prolifération des cellules SPEV et HT29 a été étudiée pendant 1 à 4 jours. Pour examiner l'augmentation du nombre de cellules dans les cultures étudiées aux termes de l'enquête, elles ont été enzymatiquement (1:1 (solution de trypsine à 0,25% :EDTA, PAA)) détachée du plastique et le nombre de cellules a été compté. Le nombre total de cellules cultivées a été compté par la méthode traditionnelle dans la chambre de Goryaev.

Processus apoptotiques/nécrotiques

Les processus apoptotiques et nécrotiques dans les cellules SPEV et HT29 exposées aux AuNPs ont été étudiés en 4 jours avec les colorants Annexin-V (BD, USA), 7-Amino-Actinomycin (7AAD) (BD) en utilisant un FACS Calibur Becton-Dickinson. Les résultats ont été analysés avec le logiciel WinMDI v.2.8.

Sphéroïdes multicellulaires

Les sphéroïdes multicellulaires (MS) ont été générés pour estimer l'impact in vitro des AuNPs sur la migration et le potentiel d'agrégation des cellules étudiées. Le système modèle sphéroïde (3-D) des cellules SPEV et HT29 a été cultivé par la méthode conventionnelle, qui a été rapportée par [24] et modifiée dans notre laboratoire [25]. En bref, les suspensions cellulaires ont été comptées en utilisant du bleu trypan et un nombre égal de cellules (5 × 10 ⁴ cellules/cm ² ) ont été plantés dans un milieu de culture complètement supplémenté. La génération de MS a été obtenue en manipulant une culture cellulaire avec 0,24 % de carboxy-méthyl-cellulose (CMC) dans des plaques à 24 puits recouvertes d'agar à 1 % avec rotation (80 tr/min) pendant 24 h. Après cela, la culture cellulaire 3-D a été maintenue dans des conditions standard. Pour étudier la dépendance de la taille et du nombre de MS sur la concentration d'AuNP, des MS ont été générés en présence d'AuNP. Une autre culture a été menée pendant 48 h avec une rotation constante des plaques. À l'étape suivante, des micro-images photographiques ont été réalisées par méthode de fond noir avec un microscope Carl Zeiss Stemi 2000. La morphologie de la SEP a été étudiée à l'aide du programme Axio Vision Release 4.7 (Zeiss). Ce programme permet de mesurer les dimensions géométriques des agrégats cellulaires. Ensuite, le volume de tous les MS, qui se trouvaient dans les fichiers, a été calculé. Il a été utilisé avec la formule suivante :V = 0.4 × a × b ² , où a et b ––diamètres géométriques des MS [24]. Pour l'analyse statistique, tous les agrégats de cellules ont été regroupés par taille de 1 × 10 ^-4 mm ³ à 1 × 10 ⁻² mm ³ avec un incrément de 1 × 10 ⁻³ mm ³ . Le nombre de MS et la médiane des volumes de MS ont été estimés pour chaque groupe.

Analyse statistique

Une analyse monofactorielle de la variance et du t de Student ont été utilisés pour le traitement statistique des données avec le progiciel Statistica 8. Le seuil de significativité était de 0,05. Les résultats sont présentés sous forme de moyennes et d'erreurs standard (M ± SE).

Résultats

Effet des AuNPs sur l'adhésion des cellules SPEV et HT-29

L'adhésion cellulaire est un indicateur de l'état fonctionnel des cellules et elle est nécessaire à la poursuite de la croissance de la culture. Lorsque l'adhésion s'est terminée, les cellules se sont aplaties et ont acquis une morphologie appropriée. Les propriétés adhésives des cellules SPEV sont présentées sur la figure 2.

Dynamique d'adhésion des cellules SPEV après exposition des AuNPs, *p ≤ 0,05 est significatif par rapport au témoin

Après 1 h de culture de cellules SPEV avec des AuNP à 1, 3 et 6 μg/ml, le nombre de cellules adhérées était inférieur à la valeur témoin. Le pourcentage de cellules aplaties dans les échantillons avec AuNPs pour ces concentrations ne différait pas significativement du contrôle. L'adhésion a été ralentie après 1 h d'incubation avec des AuNP à 12 μg/ml. Le nombre de cellules adhérées par centimètre carré a été réduit de 1,8 fois par rapport au témoin. Cette tendance à l'adhérence a persisté pendant toutes les périodes d'essai. Après 24 h d'observation, le nombre de cellules adhérentes était 1,3 fois plus faible par rapport au témoin. Dans le même temps, l'incubation d'AuNPs à de faibles concentrations (1 et 3 μg/ml avec des cellules tumorales (HT29) n'a eu aucun effet significatif sur la quantité de cellules adhésives. L'augmentation de la concentration d'AuNP à 6 et 12 μg/ml a conduit à une diminution de la nombre de cellules tumorales dans la fraction adhésive dans 1,16 et 1,28 fois, respectivement, (Fig. 3) Les données obtenues peuvent être influencées par plusieurs processus. L'un est l'effet cytostatique/cytotoxique des AuNPs sur la fraction d'adhésion de la tumeur et lignées cellulaires embryonnaires, ce qui conduit à la mort cellulaire, au passage à l'apoptose ou à la nécrose. L'autre processus est la réduction de l'adhésion cellulaire, sous l'influence des AuNPs et le transfert des cellules dans la fraction en suspension. Notamment, les deux processus peuvent être réalisés simultanément, et chacun peut contribuer à la diminution du nombre de cellules vivantes dans la fraction d'adhésion.

Dynamique d'adhésion des cellules HT29 après exposition des AuNPs, *p ≤ 0,05 est significatif par rapport au témoin

Effet des AuNPs sur la prolifération des cellules SPEV et HT-29

L'effet des AuNPs dans la plage de concentration de 1 à 12 μg/ml sur les processus de prolifération en culture cellulaire SPEV a été étudié (Fig. 4). Aux jours 2 à 4 de la culture avec des AuNPs à 1, 3 et 6 μg/ml, le nombre de cellules ne différait pas significativement du contrôle. Au jour 4 de la culture avec des AuNPs à 3 et 6 μg/ml, cet indice a diminué de 1,15 et 1,23 fois, respectivement, par rapport au témoin. Une réduction du nombre de cellules de 1,5 fois (jours 2 et 3) et de 1,15 fois au jour 4 de la culture avec des AuNPs à 12 μg/ml a été observée dans la culture SPEV par rapport au témoin. Ainsi, la concentration d'AuNP, 12 μg/ml, a ralenti la croissance cellulaire au cours de la période observée.

Prolifération des cellules SPEV après exposition des AuNPs, *p ≤ 0,05 est significatif par rapport au témoin

L'effet des AuNPs à des concentrations de 1 à 12 μg/ml sur le nombre de cellules HT 29 dans une culture monocouche est illustré à la Fig. 5. Au cours des 3 premiers jours d'incubation, le nombre de cellules dans le contrôle et en présence des AuNPs n'était pas statistiquement différent. Au 4ème jour de culture, il a été noté une diminution dose-dépendante du nombre de cellules en culture 2D. Ainsi, après 4 jours de culture, pour de faibles concentrations d'AuNPs (1 et 3 μg/ml), le nombre de cellules HT 29 n'est pas significativement différent par rapport au témoin. Mais à des concentrations d'AuNP plus élevées (6-12 μg/ml), le nombre de cellules HT29 était inférieur à celui du contrôle 1,33 et 1,44 fois, respectivement.

Prolifération des cellules HT29 après exposition des AuNPs, *p ≤ 0,05 est significatif par rapport au témoin

Effet des AuNP sur les processus apoptotiques/nécrotiques dans les cellules SPEV et HT-29

Les cellules SPEV et HT-29 en présence d'AuNPs ont été cultivées pendant 4 jours dans les conditions standard. La culture de cellules SPEV et HT29 avec des AuNP à 1 et 3 μg/ml et les indices de processus apoptotiques/nécrotiques ne différaient pas significativement du contrôle (tableaux 1 et 2).

La culture avec des AuNPs à 6-12 μg/ml a augmenté le pourcentage de cellules d'Annexine V+/7AAD+, d'Annexine V−/7AAD+ et d'Annexine V+/7AAD et a réduit le pourcentage de cellules vivantes. Le nombre d'Annexine V ⁺ /7AAD ⁺ Le nombre de cellules SPEV était supérieur à la valeur de contrôle de 7,8 ± 0,7 % (p ≤ 0,05) avec 12 μg/ml d'AuNPs. Le nombre d'Annexine V ⁺ /7AAD ⁺ Les cellules HT 29 étaient supérieures de 3,2 ± 0,4 % à la valeur de contrôle (p ≤ 0,05) avec 6 μg/ml d'AuNPs et de 4,8 ± 0,6% (p ≤ 0,05) avec 12 μg/ml d'AuNPs.

Effet des AuNP sur la génération de sphéroïdes multicellulaires à partir de cellules SPEV et HT29

Pour déterminer la dépendance de la taille et du nombre de sphéroïdes multicellulaires (MS) sur la concentration d'AuNP, des MS ont été générés à diverses concentrations d'AuNP pendant 48 h. Nos données ont démontré la capacité variée des cellules HT29 et SPEV à former des sphéroïdes multicellulaires dans les mêmes conditions du microenvironnement (Figs. 6 et 7).

Nombre et volume de cellules MS SPEV après incubation avec AuNPs, #p ≤ 0,01 (pour le nombre d'EM) ; **p ≤ 0,01 (pour le volume de MS)

Nombre et volume de cellules MS HT29 après incubation avec AuNPs. #p ≤ 0,01 (pour le nombre d'EM) ; **p ≤ 0,01 (pour le volume de MS)

Donc, si les échantillons témoins de cellules HT29 pendant 48 h formaient des sphéroïdes de volume moyen 5,19 × 10 ⁻³ mm ³ , le volume sphéroïde moyen des cellules SPEV était de 0,79 × 10 ⁻⁵ mm ³ . Dans le même temps, l'influence des AuNPs sur les cellules HT29 et SPEV avait la même tendance. La présence d'AuNPs dans le microenvironnement cellulaire a stimulé la formation de sphéroïdes multicellulaires dans les deux cultures. Ainsi, lorsque la concentration d'AuNP était de 1 et 3 μg/ml, le volume de MS pour SPEV augmentait respectivement de 9,7 et 7,4 fois par rapport au témoin (Fig. 6), les mêmes concentrations d'AuNP ont également stimulé un volume croissant de MS pour HT29 par 1,4 et 1,2 fois, respectivement (Fig. 7).

Une augmentation supplémentaire de la concentration d'AuNP a conduit à une diminution du volume moyen de MS dans les deux cultures. L'élévation de la concentration d'AuNP de 1 à 12 μg/ml a diminué le volume des MS HT29 de 7,18 × 10 ⁻³ mm ³ à 4,24 × 10 ⁻³ , en 1,69 fois, selon le contrôle. Quant au SPEV, lorsque la concentration d'AuNPs a été augmentée de 1 à 12 μg/ml, le volume de MSs a diminué de 7,69 à 4,58 × 10 ^-5 mm ³ , en 1,68 fois, selon le contrôle. Cependant, l'augmentation de la concentration d'AuNP coïncide avec la réduction du volume des MS et est corrélée à l'augmentation du nombre de sphéroïdes en culture de cellules HT29 (Figs. 6 et 7). Le nombre de MS HT29 est passé de 3 à 10 par champ de vision à une concentration d'AuNP de 1 à 12 μg/ml. Dans le même temps, le nombre de SPEV MS est passé de 32 à 19, respectivement.

Les données obtenues (Figs. 6 et 7) démontrent que les AuNPs sont capables d'influencer les interactions cohésives dans le système de cellule à cellule. Nos données montrent que de petites concentrations d'AuNPs (1 à 3 μg/ml) ont stimulé la formation de sphéroïdes multicellulaires des cellules embryonnaires et tumorales. Cependant, des concentrations plus élevées d'AuNP (6-12 μg/ml) ont eu des effets cytotoxiques et anti-cohésifs sur les cellules en suspension. Ce processus a contribué à la formation d'un plus grand nombre de MS HT29 avec le volume moyen diminué. Comme pour le SPEV, la forte concentration d'AuNPs peut avoir un effet cytostatique qui réduit le nombre de cellules dans la fraction adhésive et le nombre de MS en suspension. Auparavant, les auteurs avaient signalé que les nanoparticules de carbone réduisaient l'adhésion des cellules au substrat, stimulaient le transfert cellulaire dans la suspension et conduisaient à la formation de sphéroïdes multicellulaires [25, 26]. Dans la littérature, il existe des données sur la capacité de l'AuNP à briser la structure des microfilaments d'actine/myosine et à diminuer la prolifération, l'adhésion et la différenciation cellulaires [27]. Nos données ont confirmé cette hypothèse.

Discussion

Nous avons évalué les effets des AuNPs sur la prolifération, la nécrose/apoptose et la formation de sphéroïdes multicellulaires des cellules épithéliales d'origine continue et oncogène. Il a été montré que les AuNPs à 6-12 μg/ml réduisaient le nombre de cellules SPEV et HT29 et augmentaient le nombre de cellules aux stades précoces et tardifs de l'apoptose et de la nécrose. Les faibles concentrations d'AuNPs stimulent la formation de sphéroïdes multicellulaires par les cellules HT29 et SPEV. Cependant, des concentrations plus élevées d'AuNP ont à la fois des effets cytotoxiques et anti-cohésifs sur les cellules en suspension. La grande sensibilité à l'action des AuNPs a été démontrée par la lignée de HT29 (6 μg/ml) par rapport aux cellules SPEV (12 μg/ml.)

Les effets des AuNPs sur la morphologie cellulaire et le cytosquelette n'ont reçu que récemment plus d'attention, et le mécanisme sous-jacent et les conséquences à venir n'ont pas été étudiés en profondeur [28,29,30]. À cet égard, il est important que tous les nouveaux types d'AuNP évaluent leur voie d'absorption endocytaire et leur localisation intracellulaire en fonction du temps. Pour différents types d'AuNPs, les effets ont été décrits comme dépendants de la concentration d'AuNP intracellulaire et transitoires, où après des divisions cellulaires récurrentes, les concentrations d'AuNP intracellulaires diminuent de façon exponentielle et les effets ne sont plus observés. En outre, la possible fuite endosomale des AuNPs doit être évaluée. Comme les défauts du cytosquelette ont été décrits comme étant clairement dépendants des concentrations d'AuNP, une large gamme de concentrations de particules doit être testée afin d'essayer d'évaluer la capacité de charge cellulaire maximale sans aucun effet. De plus, comme le cytosquelette est également impliqué dans de nombreuses voies de signalisation intracellulaire, il reste à étudier si la perturbation du cytosquelette induite par les AuNP entraîne des effets secondaires [31].

Les NP ayant certaines dimensions physiques, le volume intracellulaire qu'elles occupent peut entraîner des altérations de la morphologie cellulaire ou affecter la structure du réseau du cytosquelette cellulaire [28, 29, 31]. Les effets ultérieurs peuvent également être dus aux exigences élevées de la pose NP sur la manière endocytique cellulaire. Les AuNPs ont été décrites comme ayant un effet profond sur la morphologie de plusieurs types de cellules, telles que les cellules pulmonaires du carcinome humain A549 [32]. Les AuNP ont également été décrites comme ayant un effet dépendant de la concentration sur les fibrilles d'actine des fibroblastes dermiques humains [33, 34]. Mironava et al. [35, 36] ont en outre montré que les filaments du cytosquelette étaient perturbés en fonction du temps d'exposition, de la concentration et de la taille des NP, bien que les niveaux d'expression de la protéine actine ou -tubuline ne soient pas affectés.

Le type de cellule utilisé est également d'une grande importance car différents types de cellules, même étroitement liés, peuvent réagir assez différemment pour le même type de nanomatériaux [37, 38]. De préférence, les types de cellules qui sont les plus impliqués dans les (futures) applications biomédicales des NP doivent être testés (par exemple, les cellules épithéliales, endothéliales), ou plusieurs cellules qui sont dérivées des différentes couches germinales. Lors de l'étude des effets cytotoxiques, l'utilisation de types de cellules cancéreuses doit être minimisée, car ceux-ci peuvent conduire à des résultats aberrants [39]. Les cellules cancéreuses ont plusieurs caractéristiques spécifiques et des voies de signalisation intracellulaires altérées qui sont destinées à réguler positivement la prolifération et à maintenir la viabilité cellulaire, ce qui les rendra moins sujettes à certains effets cytotoxiques médiés par les NP.

À notre avis, la liaison des AuNP aux groupes fonctionnels de surface (par exemple, les protéines transmembranaires) des cellules peut être réversible ou irréversible, entraînant des lésions structurelles temporaires ou permanentes [40, 41]. Les implications potentielles des changements dans les propriétés biomécaniques (par exemple, la dureté et l'élasticité), l'adhésivité et les propriétés électriques de surface des cellules sont perceptibles. Ainsi, les changements de dureté ou d'élasticité sont susceptibles d'influencer la flexibilité structurelle de la surface, la production d'énergie mécanique pour la division cellulaire et la motilité cellulaire. Quant à l'adhésivité, le microenvironnement cellulaire est normalement composé d'une matrice extracellulaire avec des molécules spécifiques qui permettent aux cellules d'adhérer à leur environnement [42]. La charge de surface joue sans aucun doute un rôle important dans les interactions entre les cellules et leur environnement.

Les autres auteurs ont également signalé que les NP sont préférentiellement localisées dans les mitochondries et provoquent un stress oxydatif ainsi qu'une potentialisation des dommages structurels [40]. Un article récent de Pan et al. décrit que les AuNPs de 1,4 nm induisent une nécrose via un stress oxydatif et des dommages mitochondriaux dans les cellules Hela [43]. L'accumulation de nanoparticules dans le milieu cellulaire lors de la biodégradation est dangereuse car elle peut perturber les organites et même provoquer des mutations génétiques.

Les changements survenant dans les cellules au cours de l'apoptose sont similaires pour la plupart des types cellulaires. Dans les cellules apoptotiques, il y a des changements dans la composition lipidique de la membrane plasmique :la phosphatidylsérine est transférée de la partie cytoplasmique de la bicouche vers le côté externe, provoquant l'activation de la cascade de caspases, la condensation de la chromatine et le désordre de la chaîne de transport d'électrons dans les mitochondries et éventuellement l'arrêt de la synthèse d'ATP. La mort cellulaire programmée peut être déclenchée par des stimuli physiologiques médiés par des récepteurs résultant de troubles génétiques, d'une exposition à des facteurs chimiques ou physiques ainsi que par d'autres changements dans les cellules. Nous avons observé cet effet avec 6 à 12 μg/ml d'AuNP.

Les agrégats multicellulaires (sphéroïdes, corps embryoïde) représentent un niveau intermittent entre les cellules en croissance monocouche et la culture tissulaire. Les sphéroïdes sont un modèle objectif de la croissance et de l'organisation tridimensionnelles des cellules, des interactions de cellule à cellule et de l'influence des conditions microenvironnementales, par exemple, la concentration d'AuNP, sur l'intensité de la prolifération ainsi que sur l'adhésivité cellulaire et la formation de microagrégats. La formation de SEP est une méthode de culture bien établie tant pour les lignées cellulaires tumorales que embryonnaires [24, 44, 45]. Dans notre travail, la formation et la croissance de sphéroïdes sont obtenues en ajoutant de la CMC dans le cadre d'une matrice extracellulaire artificielle et d'un revêtement de surface par de la gélose à 1% qui a inhibé l'adhésion cellulaire à la surface et stimulé l'agrégation cellulaire. Dans ces conditions, la culture MS peut être réalisée jusqu'à ce que les agrégats forment une nécrose centrale, due à une croissance de masse cellulaire limitée ou à une différenciation spontanée des cellules embryonnaires.

Dans la littérature, il existe des informations sur l'interaction des AuNPs avec la lignée cellulaire du cancer du côlon et les lignées cellulaires embryonnaires [46, 47]. Selon ces données, l'exposition à des concentrations même très faibles d'AuNP peut avoir un effet néfaste sur les cellules précurseurs neurales embryonnaires humaines et HT29 en insistant sur la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire par apoptose.

Il existe des données publiées selon lesquelles l'effet des AuNPs est basé sur l'accumulation de phase G0/G1, l'épuisement des phases S et G2/M, ainsi que sur des niveaux réduits d'ATP dans les cellules de carcinome épidermoïde buccal humain (HSC-3) [48]. La régulation du cycle cellulaire peut être résolue par la violation des contacts focaux des cellules avec le substrat et le transfert cellulaire vers la fraction en suspension dans la culture 2D et l'inhibition des contacts cellule-cellule dans la jonction lacunaire dans la culture 3D [48,49,50]. En raison de la taille nanométrique des AuNP (près de 15 nm), il ne peut pas s'agir de centres de cohésion pour les cellules. Dans le même temps, l'intercalation des AuNP dans la membrane cellulaire [51], l'influence sur le potentiel zêta des AuNP de la membrane cellulaire [32] et l'influence sur la formation des contacts cellule-cellule/cellule-surface peuvent évidemment déclencher un mécanisme de nécrose/apoptose , effet cytotoxique et arrêt du cycle cellulaire. La violation des contacts focaux des cellules avec le substrat et le transfert cellulaire vers la fraction en suspension est un moyen de régulation du cycle cellulaire [48, 49]. De faibles concentrations d'AuNPs n'ont exercé aucun effet cytotoxique statistiquement significatif sur les cellules. Cependant, des concentrations plus élevées d'AuNP ont à la fois des effets cytotoxiques et anti-cohésifs sur les cellules en suspension. Ce processus a contribué à la formation d'un plus grand nombre de MS avec un volume moyen diminué. Nous supposons que l'AuNP se coince dans les contacts cohésifs des cellules et les compromet. Ainsi, nos expériences sur les effets des AuNPs sur les lignées cellulaires SPEV et HT29 soutiennent leur application ultérieure dans le développement de thérapies anticancéreuses médiées par AuNP.

Bien que de futures études soient nécessaires pour confirmer les effets anticancéreux sur les études animales in vivo. Néanmoins, notre profonde conviction est que si nous connaissons la nature de la substance et son possible influence négative, nous sommes en mesure d'éviter les effets néfastes des AuNP et d'utiliser leur potentiel biotechnologique positif. Notre recherche pourrait être appliquée de manière assez fiable dans des matériaux efficaces pour un contexte de traitement anticancéreux avec un avantage maximal pour la médecine.

Conclusions

Nos résultats soutiennent l'idée que les AuNPs induisent une cytotoxicité dose-dépendante dans les cellules SPEV et HT29. De plus, ce rapport démontre pour la première fois que les AuNPs de 15 nm à des concentrations de 6 à 12 μg/ml ont réduit la prolifération des cellules SPEV et HT29 et augmenté le nombre de cellules aux stades précoces et tardifs de l'apoptose et de la nécrose. En outre, il a été montré que de faibles concentrations d'AuNPs (1 à 3 μg/ml) stimulent la formation de sphéroïdes multicellulaires. Cependant, des concentrations plus élevées d'AuNP ont à la fois des effets cytotoxiques et anti-cohésifs sur les cellules en suspension. La grande sensibilité à l'action des AuNPs a été démontrée par la lignée de HT29 (6 μg/ml) par rapport aux cellules SPEV (12 μg/ml.)