Effets de nanoparticules d'or 15 nm sur prolifération, apoptose et formation de sphéroïdes dans cellules HT29 carcinome colon et SPEV rein embryonnaire

Résumé

Les modèles de culture cellulaire fournissent une plateforme fiable pour évaluer la toxicité potentielle des nanomatériaux et disséquer leur impact mécanistique sur la biologie du cancer. Ici, nous évaluons comment des nanoparticules d'or (AuNP) de 15 nm stabilisées au citrate influencent deux lignées épithéliales d'origine distincte : la lignée continue de rein embryonnaire porcin SPEV et la lignée de carcinome colorectal humain HT29. L'exposition à des concentrations d'AuNP de 1 à 12 µg mL⁻¹ a permis de surveiller l'adhésion cellulaire, la prolifération, l'apoptose/nécrose et la capacité à former des sphéroïdes multicellulaires. Nous avons trouvé que 6-12 µg mL⁻¹ d'AuNP réduisaient significativement la prolifération cellulaire et augmentaient les populations apoptotiques/nécrotiques précoces et tardives dans les deux lignées. Inversement, de faibles doses d'AuNP (1-3 µg mL⁻¹) stimulaient la formation de sphéroïdes, alors que des doses plus élevées exerçaient des effets cytotoxiques et anti-cohésifs en culture en suspension. Ces résultats soulignent le rôle dual dose-dépendant des AuNP et soutiennent leur exploration continue comme stratégie anticancéreuse ciblée.

Contexte

Les nanoparticules d'or (AuNP) sont prisées pour leur biocompatibilité, propriétés optiques et potentiel thérapeutique émergent sur un spectre de tumeurs, incluant cancers du sein, foie, gastrique, côlon et poumon [5-6]. Les traits physicochimiques uniques des AuNP — taille, forme, charge de surface et concentration — gouvernent leur absorption cellulaire, distribution et effets biologiques [12-14]. Bien que de nombreuses études se concentrent sur l'efficacité anticancéreuse des AuNP, un profilage toxicologique complet dans des modèles cliniquement pertinents reste essentiel pour une translation sûre.

La livraison ciblée d'AuNP au tissu tumoral reste un défi ; des taux d'absorption différentiels ont été rapportés parmi cellules épithéliales de diverses origines [15-16]. Des variations dans la composition membranaire, l'expression de glycoprotéines et la capacité endocytique sous-tendent probablement ces différences, soulignant le besoin d'études comparatives dans lignées épithéliales normales et malignes [17].

Les essais en culture cellulaire offrent un environnement contrôlé pour disséquer les réponses cellulaires aux AuNP, informant à la fois les évaluations de sécurité et l'optimisation thérapeutique. Dans cette étude, nous avons comparé les effets d'AuNP sur une lignée rénale embryonnaire normale (SPEV) et une lignée de carcinome colorectal (HT29) en utilisant des tests d'adhésion, prolifération, apoptose/nécrose et formation de sphéroïdes.

Méthodes

Culture des cellules SPEV

Les cellules SPEV étaient maintenues en DMEM (Sigma, USA) supplémenté avec 5 % FCS (HyClone, USA), pénicilline/streptomycine (PAA, Autriche) et amphotéricine B (5 µg mL⁻¹). Les cellules étaient ensemencées à 0,5-2 × 10⁴ cellules cm⁻² et cultivées en 5 % CO₂ à 95 % humidité. Le milieu était rafraîchi toutes les 48 h, et les passages effectués à la confluence, préservant la morphologie monocouche à travers les passages.

Culture des cellules HT29

Les cellules HT29 étaient cultivées en RPMI-1640 (Sigma, USA) avec 10 % FCS, 2 mM L-glutamine et 40 mg mL⁻¹ gentamicine (Sigma, USA). La densité de travail était 0,5-4 × 10⁴ cellules cm⁻². Les cellules provenaient de la Banque de Lignées Cellulaires à l'Institut RE Kavetsky de Pathologie Expérimentale, Oncologie et Radiobiologie, NAS d'Ukraine.

Manipulation avec AuNP

Les AuNP étaient synthétisées par la méthode de réduction au citrate [22] et fournies par l'Institut de Biochimie et Physiologie des Plantes et Microorganismes, Académie des Sciences de Russie. Les particules avaient en moyenne 15 nm de diamètre, avec une concentration stock de 57 µg mL⁻¹. La microscopie électronique à champ noir et les spectres d'extinction confirmaient la distribution de taille (Fig. 1). Les cellules étaient traitées avec 1, 3, 6 ou 12 µg mL⁻¹ AuNP pendant 24-48 h ; les cultures non traitées servaient de témoins.

Tests d'adhésion et prolifération

L'adhésion était quantifiée en comptant les cellules aplaties à 30, 60, 120, 180 et 1440 min après ensemencement, au microscope inversé. La prolifération sur 1-4 jours était évaluée par détachement trypsine-EDTA et comptage en chambre de Goryaev. Données exprimées en moyenne ± ES.

Évaluation apoptose/nécrose

Après 4 jours d'exposition aux AuNP, les cellules étaient colorées Annexin-V et 7-AAD et analysées par cytométrie de flux (FACS Calibur, BD). Résultats traités avec WinMDI v2.8.

Formation de sphéroïdes multicellulaires

Pour générer des sphéroïdes, 5 × 10⁴ cellules cm⁻² étaient ensemencées en plaques 24 puits revêtues de 1 % agar et cultivées en 0,24 % carboxyméthyl-cellulose (CMC) avec rotation 80 tr/min. Les sphéroïdes étaient formés 24 h, puis maintenus 48 h supplémentaires en présence d'AuNP. La taille et le nombre de sphéroïdes étaient mesurés par microscopie champ noir et analysés avec Axio Vision 4.7, calculant le volume via V = 0,4 × a × b² (a, b = diamètres). Les agrégats étaient groupés par volume (1 × 10⁻⁴–1 × 10⁻² mm³) pour déterminer volumes médians et comptages.

Analyse statistique

Les données étaient analysées par ANOVA à un facteur et test t de Student (Statistica 8). Significativité fixée à p ≤ 0,05, présentée comme moyenne ± ES.

Résultats

Adhésion des cellules SPEV et HT29

La Figure 2 illustre l'impact des AuNP sur l'adhésion SPEV. Après 1 h, 1, 3 et 6 µg mL⁻¹ AuNP réduisaient les comptages de cellules adhérentes vs témoin, avec 12 µg mL⁻¹ causant une diminution 1,8 fois qui persistait sur 24 h. Les cellules HT29 montraient une tendance similaire : faibles concentrations effets négligeables, alors que 6 et 12 µg mL⁻¹ réduisaient l'adhésion de 1,16 et 1,28 fois respectivement (Fig. 3).

Prolifération des cellules SPEV et HT29

La Figure 4 montre que 1-6 µg mL⁻¹ AuNP n'altéraient pas la prolifération SPEV jours 2-4, alors que 12 µg mL⁻¹ réduisait les comptages jusqu'à 1,5 fois (Fig. 4). La prolifération HT29 restait inchangée jusqu'à jour 3 ; au jour 4, 6 et 12 µg mL⁻¹ abaissaient les comptages de 1,33 et 1,44 fois respectivement (Fig. 5).

Induction apoptose/nécrose

Les faibles doses AuNP (1-3 µg mL⁻¹) n'altéraient pas significativement les profils Annexin-V/7-AAD dans les deux lignées (Tableaux 1-2). À 6-12 µg mL⁻¹, SPEV et HT29 montraient des populations apoptotiques/nécrotiques précoces et tardives augmentées. Pour SPEV, 12 µg mL⁻¹ augmentait les cellules Annexin-V⁺/7-AAD⁺ de 7,8 % (p ≤ 0,05) ; pour HT29, 6 et 12 µg mL⁻¹ augmentaient cette fraction de 3,2 % et 4,8 % respectivement.

Formation de sphéroïdes

Les Figures 6 et 7 montrent comment les AuNP modulent nombre et volume des sphéroïdes. Les sphéroïdes témoins HT29 avaient une moyenne de 5,19 × 10⁻³ mm³, tandis que SPEV 0,79 × 10⁻⁵ mm³. 1-3 µg mL⁻¹ AuNP amplifiaient le volume sphéroïdes SPEV de 9,7 et 7,4 fois, et HT29 de 1,4 et 1,2 fois. L'augmentation de concentration à 12 µg mL⁻¹ réduisait le volume dans les deux lignées (HT29 : 7,18 → 4,24 × 10⁻³ mm³ ; SPEV : 7,69 → 4,58 × 10⁻⁵ mm³) tout en augmentant le nombre de sphéroïdes HT29 de 3 à 10 par champ et diminuant SPEV de 32 à 19.

Discussion

Nos données confirment un profil cytotoxique dose-dépendant des AuNP 15 nm dans cellules SPEV et HT29. Concentrations 6-12 µg mL⁻¹ inhibaient la prolifération, augmentaient l'apoptose/nécrose et perturbaient la cohésion cellulaire en suspension, comme en témoignent taille et nombre de sphéroïdes altérés. La sensibilité accrue de HT29 (6 µg mL⁻¹) relative à SPEV (12 µg mL⁻¹) s'aligne avec des rapports antérieurs d'absorption différentielle et perturbation cytosquelettique par AuNP [27-30].

Mécanistiquement, les AuNP peuvent interférer avec les complexes d'adhésion focale, moduler la dynamique d'actine et déclencher le stress oxydatif mitochondrial — voies culminant en arrêt du cycle cellulaire et mort cellulaire programmée [31-34]. L'effet anti-cohésif aux doses élevées reflète probablement la perturbation des jonctions cellule-cellule, menant à une fragmentation accrue des sphéroïdes.

Bien que les résultats in vitro soient prometteurs, une validation in vivo est essentielle pour confirmer l'efficacité thérapeutique et la sécurité. Néanmoins, notre étude fournit un référentiel rigoureux pour la conception de stratégies anticancéreuses basées AuNP exploitant leur double capacité à inhiber la croissance tumorale et moduler les microenvironnements cellulaires.

Conclusions

Les AuNP 15 nm exhibent des effets clairs, concentration-dépendants sur cellules SPEV normales et HT29 malignes : prolifération réduite, apoptose/nécrose accrue, dynamique de sphéroïdes altérée. Faibles doses (1-3 µg mL⁻¹) favorisent la formation de sphéroïdes, tandis que doses élevées (6-12 µg mL⁻¹) exercent des actions cytotoxiques et anti-cohésives. Ces résultats soutiennent l'investigation future des AuNP comme modalité anticancéreuse ciblée, avec attention à l'optimisation de dose pour bénéfice thérapeutique maximal et toxicité hors-cible minimale.