Nanoparticules d'or modifiées par 6-mercaptopurine et peptide dérivé de la rage améliorent la prolifération et la névrite des cellules neurales SH-SY5Y

Résumé

La neurorégénération exige des biomatériaux capables de stimuler la prolifération neuronale et l'extension axonale. Nous présentons ici une nouvelle plateforme neurophile : des nanoparticules d'or (AuNPs) fonctionnalisées avec la 6-mercaptopurine (6MP) et un peptide pénétrant les neurones (RDP). Lorsque des cellules neuroblastomes humaines SH-SY5Y ont été exposées aux conjugués 6MP-AuNPs-RDP, l'activité métabolique et la longueur des neurites ont augmenté nettement par rapport aux témoins. Important, les cellules récupérées après cryopréservation ont conservé ces avantages de croissance, indiquant une tolérance robuste au nanomatériau. Ces résultats soutiennent le développement des 6MP-AuNPs-RDP comme nanomatériau neurophile sûr et efficace.

Contexte

La promotion efficace de la prolifération neuronale et de la croissance des neurites est une pierre angulaire des stratégies régénératives pour les troubles neurodégénératifs tels que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et l'accident vasculaire cérébral (1–4). La chimie de surface des biomatériaux peut moduler la morphologie cellulaire, la prolifération et la différenciation, offrant une voie prometteuse vers des agents neurophiles (5,6). Les nanoparticules d'or (AuNPs) sont devenues attractives dans les applications biomédicales grâce à leur synthèse aisée, leur polyvalence de surface, leur faible toxicité et leur biocompatibilité (7,8). Des travaux antérieurs ont démontré que des nanobâtons d'or combinés à une exposition laser de faible puissance pouvaient allonger les neurites de cellules NG108-15 jusqu'à 25 µm (9).

La 6-mercaptopurine (6MP) est un médicament anti-inflammatoire qui se lie aux AuNPs via des liaisons Au–S, permettant la fonctionnalisation (10). Bien que les 6MP-AuNPs aient été utilisés pour la détection quantitative de médicaments (11), leurs effets cellulaires restent inexplorés. Nous avons donc étudié les 6MP-AuNPs et un peptide ciblant les neurones (RDP) dans le modèle de neuroblastome humain SH-SY5Y, choisi pour sa grande sensibilité environnementale et sa pertinence pour les études de biomatériaux neuronaux.

Méthodes / Expérimental

Synthèse du conjugué 6MP-AuNPs-RDP

Des AuNPs de 20 nm recouverts de citrate ont été préparés par la réduction classique de Turkevich de HAuCl₄·3H₂O (0,01 %) avec du citrate de sodium (38,8 mM). La 6MP (0,046 nM) et les AuNPs (0,33 mM) ont été incubées 5 h à température ambiante, puis centrifugées à 17 000 g pendant 30 min. Le culot a été lavé trois fois à l'eau déionisée. Pour la modification par RDP, le peptide (0,023 nM) a été co-incubé avec le mélange AuNP/6MP sous conditions identiques. Un peptide brouillé marqué FAM (FAM-SP) a servi de témoin. Les particules ont été resuspendues dans 0,1 M NaOH (pH 9,0), filtrées (0,22 µm) et stockées à 4 °C.

Caractérisation des particules

Les spectres UV/Vis ont été enregistrés avec un Shimadzu UV-2450. La distribution de taille et le potentiel zêta ont été mesurés par Malvern Zetasizer Nano ZS après dilution. La microscopie électronique à transmission (MET, Shimadzu) a confirmé la morphologie sphérique.

Culture cellulaire

Les cellules SH-SY5Y ont été maintenues en DMEM/F-12 (1:1) supplémenté avec 10 % FCS, 100 U/mL pénicilline et 100 µg/mL streptomycine à 37 °C, 5 % CO₂.

Test d'internalisation cellulaire

Des cellules (5 × 10⁴ cellules/puits) ont été incubées avec 0,25 µg/mL de 6MP-AuNPs-RDP ou 6MP-AuNPs-SP marqués FAM pendant 2 h. La microscopie de fluorescence (Olympus) et la spectrofluorimétrie (Hitachi) ont quantifié l'internalisation.

Impact sur la croissance neuronale

Pour la prolifération, les cellules ont été ensemencées à 5 × 10⁵ cellules/puits et traitées avec 0–1,0 µg/mL de 6MP-AuNPs-RDP pendant 24 h. Les comptages cellulaires (compteur automatisé Bio-Rad) et l'activité métabolique MTT (490 nm) ont été évalués. La longueur des neurites a été mesurée après 3 jours de traitement quotidien à 0,25 µg/mL en utilisant ImageJ. Des boîtes de Petri enduites en surface (3,5 cm) ont aussi été préparées pour évaluer l'extension des neurites sur une couche de nanoparticules.

Analyse statistique

Les données (n = 4) sont exprimées en moyenne ± SEM et analysées par ANOVA à un facteur avec le test de Dunnett (SPSS 13.0). p < 0,05 désigne la significativité.

Résultats

Apparence et propriétés physicochimiques des nanoparticules

Les AuNPs présentaient une couleur rouge ; à l'addition de 6MP, la solution s'est assombrie, formant un précipité bleu-noir après 5 h. La dissolution à pH 9,0 a donné une solution rose, qui a re-précipité à pH 7,4. La DLS a révélé un diamètre moyen de 20,5 nm pour les 6MP-AuNPs et 24,6 nm pour les 6MP-AuNPs-RDP ; les potentiels zêta étaient de −37,2 mV et −25,8 mV respectivement (figure 2c,d). La MET a confirmé la morphologie sphérique.

Internalisation cellulaire améliorée via RDP

À pH 7,4, les 6MP-AuNPs-RDP s'agrègaient moins et montraient une plaque péricellulaire proéminente, alors que les 6MP-AuNPs formaient des agrégats étendus (figure 3a). L'imagerie de fluorescence montrait un signal intracellulaire fort pour les 6MP-AuNPs-RDP comparé à un signal faible pour les 6MP-AuNPs-SP (figure 3b-d), indiquant que le RDP augmente nettement l'internalisation des nanoparticules.

Promotion de la prolifération et de l'activité métabolique

Les 6MP-AuNPs et 6MP-AuNPs-RDP ont tous deux augmenté le nombre de cellules et l'absorbance MTT de manière dose-dépendante ; les effets étaient plus forts pour les particules conjuguées au RDP (figure 4a,b). Le RDP seul n'altérait pas la croissance.

Amélioration de la croissance des neurites

Après 24 h d'exposition à 1,0 µg/mL de particules, les cellules traitées avec 6MP-AuNPs-RDP présentaient des neurites significativement plus longs que les témoins et les 6MP-AuNPs (figure 5a,b). Le RDP seul n'avait pas d'effet. Appliqué comme revêtement de surface, les 6MP-AuNPs-RDP accéléraient l'extension des neurites et facilitaient l'internalisation dans tout le cytoplasme et le noyau (figure 6d,e).

Effet de la cryopréservation

Des cellules pré-traitées avec 1,0 µg/mL de 6MP-AuNPs-RDP ont conservé une prolifération et une longueur de neurites accrues après décongélation, démontrant une tolérance robuste au stockage cryogénique (figure 7a-c).

Discussion

Les données confirment que les 6MP-AuNPs-RDP combinent la biocompatibilité des nanostructures d'or avec la capacité d'internalisation neuronale du RDP et les propriétés de promotion de croissance du groupe purine exposé de la 6MP. Le comportement acide-base du conjugué (pI ≈ 7,8) s'aligne avec le pH physiologique, réduisant l'agrégation dans les milieux de culture. Le RDP médie probablement l'endocytose via les récepteurs GABA ou nicotiniques à l'acétylcholine, cohérent avec des études antérieures sur les nanoparticules fonctionnalisées par peptides (15–19). Les groupes purines exposés à la surface des nanoparticules pourraient activer les voies MAPK/ERK et PI3K/Akt, régulateurs clés de la différenciation neuronale et de la croissance des neurites (21–23). Important, les cellules SH-SY5Y tolèrent l'exposition répétée et la cryopréservation, soulignant le profil de sécurité de la plateforme.

Conclusions

Les nanoparticules d'or fonctionnalisées avec la 6-mercaptopurine et le peptide dérivé de la rage RDP constituent un nanomatériau neurophile puissant qui favorise la prolifération neuronale et l'extension des neurites tout en maintenant la biocompatibilité. Ces résultats soutiennent le développement futur des 6MP-AuNPs-RDP pour des stratégies thérapeutiques en neurorégénération.

Abréviations

6MP

6-Mercaptopurine

AD

Maladie d'Alzheimer

AuNPs

Nanoparticules d'or

DLS

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM

Milieu modifié de Dulbecco pour Eagle

DMSO

Diméthylsulfoxyde

FCS

Sérum de veau fœtal

MTT

3-(4,5-Diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromide

PD

Maladie de Parkinson

RDP

Peptide dérivé du virus de la rage

TEM

Microscopie électronique à transmission