Cibler les cellules endothéliales avec des nanoparticules GaN/Fe multifonctionnelles

Contexte

Ces dernières années, de nombreux efforts ont été déployés pour lutter contre le cancer et les maladies apparentées à l'aide de la nanotechnologie. L'une des approches les plus courantes est basée sur des nanoparticules qui peuvent être exploitées comme vecteurs de médicaments [1, 2]. Cette approche, cependant, a des limites liées à la nécessité de revêtir les nanoparticules de ligands de reconnaissance pour l'adsorption des médicaments et la liaison covalente, ou causées par la nécessité d'encapsuler les médicaments dans les nanoparticules. Une approche thérapeutique alternative consiste à utiliser des nanoparticules pour la thérapie cellulaire directe, c'est-à-dire pour cibler des sites dans le but de traiter la maladie biologiquement [3]. Par exemple, des cellules endothéliales chargées de nanoparticules magnétiques pourraient être guidées vers des sites de lésion artérielle au moyen d'un champ magnétique appliqué. En plus des applications thérapeutiques, le guidage cellulaire assisté par nanoparticules peut également être utile pour la séparation cellulaire in vitro et le revêtement cellulaire de constructions tridimensionnelles [4]. Dans cet article, nous démontrons que les cellules endothéliales absorbent des nanoparticules à base de GaN/Fe et que ce phénomène peut être utilisé pour contrôler la distribution spatiale des cellules in vitro.

Méthodes

Synthèse de nanoparticules

De fines couches de GaN ont été cultivées sur des nanoparticules de ZnO alliées à du Fe₂ O₃ par HVPE en deux étapes. Initialement, la couche de nucléation a été déposée à 600°C pendant 5 min. Par la suite, la température a été augmentée à 800 °C et maintenue à cette température pendant 10 minutes. Le deuxième régime de température est nécessaire pour la décomposition du cœur de ZnO et l'amélioration de la qualité cristalline du GaN. La croissance de GaN a été décrite en détail par notre groupe précédemment [5, 6]. Bref, nous avons utilisé du gallium métallique, de l'ammoniac (NH₃ ) gaz, chlorure d'hydrogène (HCl) gaz et hydrogène (H₂ ) comme gaz vecteurs. Dans le processus de croissance de GaN, le HCl, NH₃ , et H₂ les débits étaient respectivement de 20, 600 et 3 500 sccm.

Culture cellulaire

Les cellules endothéliales aortiques porcines ont été isolées des aortes en grattant doucement la couche de cellules endothéliales avec un scalpel. Les cellules ont été cultivées dans un incubateur standard à 37 °C avec 5% de CO₂ dans EGM™-2 (Endothelial Growth Factor Medium 2, Lonza). La division des cellules a été réalisée avec TrypLE™ Select(1X) (Gibco®). Pour toutes les expériences, des cellules entre les passages 3 et 8 ont été utilisées. Les cellules ont été marquées avec la protéine de fluorescence verte (GFP) par transduction lentivirale comme décrit ailleurs [7].

Dosage XTT

Le test XTT a été démarré 24 h après le changement de milieu lorsqu'un nouveau milieu supplémenté en nanoparticules a été ajouté. Le milieu de culture a ensuite été remplacé par du milieu EGM2 frais avec réactif XTT dans un rapport de 2:1. Le réactif XTT est constitué de 0,1 ml de réactif de couplage électronique dans 5 ml de XTT. Après 4 h d'incubation à 37 °C avec 5% de CO₂ , l'absorbance a été mesurée sur un lecteur de plaques multimode Paradigm.

Comptage de cellules

Après 2 jours d'incubation de cellules avec différentes concentrations de nanoparticules, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min, lavées avec du PBS et colorées avec du DAPI (1 :7500 dilué dans du PBS) pendant 10 min. Un champ de vision aléatoire a été photographié à partir de six puits indépendants avec une caméra haute résolution installée sur un microscope à fluorescence (Zeiss). Le logiciel assisté par ordinateur DotCount v1.2 [8] a été utilisé pour quantifier le nombre relatif de cellules dans chaque puits et comparé au témoin.

Microscopie électronique à transmission

La microscopie électronique à transmission a été réalisée après incubation des cellules avec des nanoparticules pendant 1 jour. Une fois que les cellules ont atteint 50 % de confluence, le milieu de culture a été remplacé par un milieu additionné de 50 g/ml de nanoparticules de GaN/Fe et les cellules ont été incubées pendant 24 autres heures. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, fixées dans 2 % de glutaraldéhyde et 2 % de formaldéhyde à température ambiante pendant 2 h, puis incubées pendant une nuit à 4 °C. Les échantillons ont été lavés dans du cacodylate de sodium 0,1 M et post-fixés dans 1% d'OsO₄ dans du cacodylate de sodium 0,1 M pendant 1 h. Après fixation, les échantillons ont été déshydratés dans une série d'acétone gradué et inclus dans EPON. La polymérisation a été réalisée pendant 2 jours à 60°C. Des sections minces d'environ 50 nm d'épaisseur ont été recueillies sur des grilles à fentes en cuivre revêtues de formvar et colorées avec 4 % d'acétate d'uranyle et de citrate de plomb. Les sections cellulaires ont été étudiées en détail à l'aide d'un microscope électronique à transmission FEI Tecnai 20 à une tension d'accélération de 200 kV.

Résultats et discussion

Des nanoparticules magnétiques multifonctionnelles ont été fabriquées en faisant croître une couche de GaN sur des nanoparticules sacrificielles de ZnO alliées à du Fe₂ O₃ . Après croissance de la couche de GaN par épitaxie en phase vapeur d'hydrure (HVPE), le cœur de ZnO est décomposé. Les nanoparticules chimiquement stables résultantes consistent principalement en une enveloppe de GaN avec des propriétés magnétiques attribuables à la diffusion d'atomes de fer dans le GaN déposé ainsi qu'à la présence d'atomes de Fe dans le film mince de ZnO allié à Fe₂ O₃ sur la surface interne de la coque GaN. Ces nanoparticules ont été étudiées en microscopie électronique. Après le processus de croissance HVPE de GaN, les nanoparticules monocristallines avec des tailles transversales allant de 20 à 100 nm restent spatialement séparées (Fig. 1). Les résultats de la caractérisation par diffraction des rayons X et spectroscopie Raman (Fig. 1c, d) des nanoparticules avant et après croissance de GaN démontrent la décomposition du noyau de ZnO et la formation de nanoparticules de GaN. Les analyses chimiques des nanoparticules réalisées en utilisant l'analyse par rayons X à dispersion d'énergie (EDX) confirment la croissance de la couche de GaN et la décomposition du noyau de ZnO (Fig. 1e, f). Notez que le matériau résultant affiche une concentration relativement élevée (environ 50 %) de Fe par rapport aux nanoparticules initiales.

Analyse de nanoparticules. un Image MEB de nanoparticules de GaN cultivées sur des nanoparticules sacrificielles de ZnO alliées à du Fe₂ O₃ . b Image MET des nanoparticules GaN/Fe résultantes. c Modèle XRD du ZnFe₂ initial O₄ nanoparticules et résultantes GaN/ZnFe₂ O₄ nanoparticules. d Spectres Raman des nanoparticules initiales et résultantes après croissance de GaN. e Analyse EDX de ZnO allié avec Fe₂ O₃ nanoparticules. f Analyse EDX des nanoparticules résultantes après la croissance de la couche de GaN

Des nanoparticules à base de GaN/Fe ont été incubées avec des cellules endothéliales aortiques porcines primaires. Comme cela a été montré précédemment, les nanoparticules de GaN sont tolérées par les cellules endothéliales à des concentrations inférieures à 100 μg/ml [5]. Pendant le processus d'incubation, les cellules endothéliales absorbent la majorité des nanoparticules dans le milieu de culture environnant tout en maintenant la migration et la prolifération cellulaires. Néanmoins, nous avons remarqué une certaine diminution du nombre de cellules viables avec une augmentation de la concentration de nanoparticules dans les milieux de culture. Cette tendance est confirmée par les résultats du test XTT présentés sur la figure 2.

Impact des nanoparticules sur la viabilité cellulaire. Réduction de XTT dépendante de la concentration mesurée après 1 jour de cellules incubées avec différentes concentrations de nanoparticules. Le nombre de cellules comptées à la fin du test XTT est exprimé par rapport aux cellules non traitées. Les valeurs sont exprimées en moyennes ± écart type de deux expériences indépendantes avec six répétitions

Pour comprendre comment les nanoparticules de GaN/Fe interagissent avec les cellules et pour identifier leur localisation dans les cellules, nous avons effectué une analyse morphologique approfondie en utilisant la microscopie électronique à transmission (MET). Après incubation de cellules endothéliales aortiques porcines avec 50 μg/ml de nanoparticules pendant 1 jour, les nanoparticules se sont avérées être localisées dans des vésicules à l'intérieur des cellules (Fig. 3a). Aucune nanoparticule n'a été trouvée dans le cytoplasme ou dans le noyau cellulaire. Le processus d'absorption des nanoparticules est présenté sur la figure 3b–d. La plupart des nanoparticules sont absorbées par les cellules par l'une des voies d'absorption classiques, à savoir par la micropinocytose, l'endocytose médiée par la clathrine ou l'endocytose médiée par la cavéoline [9]. Le processus d'internalisation dépend du type de cellule et de l'environnement cellulaire local ainsi que des propriétés physicochimiques de la particule elle-même (par exemple, la taille, la forme, la charge de surface). Dans le cas des cellules endothéliales, il a été rapporté que l'endocytose médiée par la cavéoline avait une plus grande influence sur l'absorption des nanoparticules que d'autres mécanismes en raison de l'abondance de la cavéoline dans ce type cellulaire [10, 11].

Images MET prises à partir d'une seule cellule endothéliale incubée avec des nanoparticules de GaN/Fe. un Distribution des nanoparticules dans les vésicules cellulaires. b –d Le processus d'absorption des nanoparticules dans les vésicules. Flèches rouges indiquent des nanoparticules qui apparaissent plus sombres en MET en raison de la densité atomique élevée par rapport aux milieux biologiques

En raison de l'incorporation susmentionnée d'une quantité élevée de Fe, les nanoparticules résultantes présentent un ferromagnétisme, ainsi qu'une piézoélectricité inhérente au matériau semi-conducteur GaN [12, 13]. Ces deux propriétés fondamentales peuvent être utilisées pour l'activation à distance de certains processus dans les nanoparticules et/ou leur guidage contrôlé et leur distribution spatiale dans des milieux pertinents. Les propriétés piézoélectriques peuvent être utilisées pour induire une polarisation électrique dans les nanoparticules de GaN par, par exemple, un champ ultrasonore appliqué. De cette façon, on peut transmettre des signaux électriques aux cellules pour activer ou inhiber des processus cellulaires spécifiques. Quant aux propriétés magnétiques conférées par la teneur en Fe, elles permettent d'atteindre une visualisation dynamique et un contrôle de la position spatiale des cellules. Pour démontrer expérimentalement cette dernière possibilité, les cellules endothéliales ont été incubées dans du milieu EGM™-2 additionné de 50 μg/ml de nanoparticules de GaN/Fe pendant 3 jours (jusqu'à 70-80% de confluence cellulaire). Par la suite, les cellules ont été détachées de la surface et remises en suspension dans EGM™-2. Notez que le détachement des cellules avec TrypLE™ Select et la centrifugation n'ont ni affecté la viabilité cellulaire ni entraîné la libération de nanoparticules des cellules (données non présentées). Immédiatement après l'ensemencement, les cellules ont été incubées dans un incubateur standard à 37 °C sous 5% de CO₂ , où la plaque de culture a été placée sur des aimants permanents. La figure 4 montre la distribution des cellules endothéliales chargées de nanoparticules en présence et en l'absence d'un champ magnétique. La figure 4a représente des cellules chargées de nanoparticules incubées en l'absence de champ magnétique, tandis que sur la figure 4b, les cellules endothéliales sans nanoparticules sont incubées dans un champ magnétique. Ces images montrent une distribution aléatoire des cellules dans les deux cas. L'incubation de cellules chargées de nanoparticules dans un gradient de champ magnétique conduit à une distribution prédéfinie des cellules dans certaines zones, conformément à la carte du champ magnétique. La figure 4c représente des cellules dans la plaque de culture après 1 jour d'incubation dans le champ magnétique généré par sept aimants circulaires en néodyme de terres rares d'un diamètre de 5 mm et d'une épaisseur de 1 mm. La figure 4d illustre la distribution des cellules après incubation dans le champ magnétique généré par un seul aimant en forme d'anneau d'un diamètre de 7 mm et d'une épaisseur de 1 mm. Dans les deux cas, les aimants ont été placés sous la plaque de culture.

Guidage de cellules endothéliales chargées de nanoparticules à l'aide d'un champ magnétique. Le groupe de contrôle montre la distribution spatiale de a cellules endothéliales ciblées avec des nanoparticules et incubées en l'absence de champ magnétique et b cellules endothéliales sans nanoparticules incubées dans un champ magnétique. c , d La distribution des cellules endothéliales ciblées avec des nanoparticules après 1 jour d'incubation dans un champ magnétique

Conclusions

Nous avons démontré pour la première fois que les nanoparticules à base de GaN/Fe présentant des propriétés magnétiques sont captées par les cellules endothéliales et stockées dans des vésicules. Les cellules endothéliales chargées de nanoparticules de GaN/Fe peuvent être guidées de manière contrôlée à l'aide de champs magnétiques appliqués. Ces résultats ouvrent de nouvelles possibilités pour l'ingénierie des tissus tridimensionnels in vitro ou pour le ciblage des cellules in vivo vers les sites de lésion tissulaire. Parallèlement à cela, la présence dans les cellules de nanoparticules de GaN aux propriétés piézoélectriques inhérentes ouvre la voie à la stimulation électrique à distance des processus biologiques cellulaires. Cette approche prometteuse est à l'étude dans nos laboratoires.

Abréviations

EDX :

Analyse par rayons X à dispersion d'énergie

EGM™-2 :

Facteur de croissance endothélial moyen

Fe :

Fer

Fe₂ O₃ :

Oxyde de fer (III)

GaN :

Nitrure de gallium

GFP :

Protéine de fluorescence verte

H₂ :

Hydrogène

HCl :

Chlorure d'hydrogène

NH₃ :

Ammoniac

OsO₄ :

Tétroxyde d'osmium

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

SEM :

Microscopie électronique à balayage

TEM :

Microscopie électronique à transmission

XRD :

Diffraction des rayons X

ZnO :

Oxyde de zinc