Optimisation de l'internalisation de nanoparticules cœur-coquille Fe₃O₄-Au pour l'endocytose ciblée dans les cellules de cancer colorectal

Résumé

Les nanoparticules (NPs) cœur-coquille magnétite (Fe₃O₄)-or (Au) possèdent des propriétés magnétiques et optiques uniques. Combinées avec des moieties biologiques, ces NPs peuvent offrir de nouvelles stratégies pour des applications biomédicales, telles que l'administration de médicaments et le ciblage du cancer. Ici, nous présentons une méthode efficace pour l'absorption cellulaire contrôlable de systèmes NP cœur-coquille magnétiques combinés avec des moieties biologiques. La vimentine, qui est la protéine structurale, a été biochimiquement confirmée pour affecter puissamment la phagocytose. De plus, la vimentine affecte l'internalisation de matériaux exogènes dans les cellules même sous multiples inhibitions de moieties biologiques. Dans cette étude, nous démontrons la performance d'internalisation cellulaire de NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au avec modification de surface utilisant une combinaison de moieties biologiques. La photofluorescence des NPs marquées à la vestimentine est restée inchangée sous tests d'inhibition multiples, indiquant que les NPs étaient minimalement influencées par la nystatine, la dynasore, la cytochalasine D, et même l'anticorps (Ac) Muc1. Par conséquent, ce résultat indique que l'Ac Muc1 peut cibler des molécules spécifiques et contrôler l'endocytose spécifique. De plus, nous montrons la possibilité de contrôler l'endocytose spécifique dans les cellules de cancer colorectal.

Introduction

Les nanomatériaux ont ouvert de nouvelles voies pour le diagnostic clinique et la thérapeutique. En particulier, les nanoparticules (NPs) sont l'un des outils les plus importants et ont été utilisées dans des applications telles que les biosenseurs, le diagnostic, et les systèmes d'administration de médicaments ciblés. Pour les applications biomédicales, les NPs sont généralement composées de matériaux organiques entourant la surface sur des matériaux de cœur. Les matériaux de cœur, qui consistent en matériaux magnétiques, matériaux semi-conducteurs, ou d'autres types de matériaux, ont des propriétés physicochimiques utiles, et la surface organique externe fournit une stabilité chimique et une fonctionnalité aux NPs. Pour les applications dans les systèmes de ciblage biologique, non seulement les propriétés physicochimiques mais aussi la surface organique externe, qui sont biofonctionnalisées pour le ciblage, sont des paramètres critiques. Des exemples de moieties de ciblage pour la fonctionnalisation sont les anticorps ou ligands spécifiques à une cible. Selon les matériaux biofonctionnalisés sur la surface externe, les mécanismes d'endocytose des NPs sont déterminés. Le mécanisme qui permet aux NPs d'entrer dans les cellules a fait l'objet de nombreux travaux de recherche récents en raison de leur importance dans les applications de nanomédecine.

En particulier, les NPs magnétiques ont été largement utilisées dans de nombreuses applications de ciblage de sites spécifiques, incluant le tri cellulaire, l'IRM, l'isolement d'ADN, l'administration de médicaments, le traitement par hyperthermie, et le ciblage du cancer. Parmi diverses NPs magnétiques, les nanocristaux de magnétite ont été les plus largement utilisés dans les applications biomédicales en raison de leur biocompatibilité et stabilité chimique. Bien que de nombreux efforts aient été consacrés aux applications biomédicales utilisant des NPs magnétiques, il subsiste encore certains problèmes critiques tels que la bonne dispersibilité en solution aqueuse, la fonctionnalité, et la biocompatibilité. Pour surmonter ces problèmes, de nombreuses études se sont concentrées sur la modification de surface des NPs en utilisant une variété de groupes fonctionnels (par exemple, groupes carboxyle et amine). Cependant, l'attachement des groupes fonctionnels à la surface des NPs de magnétite est un processus long et laborieux. Donné ce fait, les NPs magnétiques de type cœur-coquille recouvertes d'Au sont attractives car la surface d'Au peut se lier facilement aux biomolécules et matériaux organiques.

En particulier, les propriétés magnétiques des NPs cœur magnétique-coquille Au permettent la séparation magnétique, augmentent la résolution en imagerie IRM, et peuvent être appliquées à la thérapie par hyperthermie. De plus, les propriétés de liaison chimique supérieures de l'or sont avantageuses pour construire des systèmes d'administration à médiation par récepteur pour le ciblage spécifique du cancer.

Au cours des dernières décennies, de nombreux chercheurs ont rapporté des systèmes d'administration à médiation par récepteur pour le ciblage du cancer. Le ciblage à médiation par récepteur des cellules cancéreuses est une forme de ciblage actif. Le choix de la cible est la clé pour un ciblage actif efficace, et les cibles doivent être surexprimées sur la membrane extracellulaire. La plupart des chercheurs ont utilisé des anticorps monoclonaux pour le traitement du cancer, et l'effet thérapeutique pourrait être grandement augmenté lorsque les thérapies par anticorps monoclonaux sont combinées avec la chimiothérapie conventionnelle. Malgré le succès de la thérapie par anticorps monoclonaux, les anticorps monoclonaux présentent plusieurs limitations dans le ciblage du cancer. Leur grande taille (environ 150 kDa) est un obstacle majeur pour la pénétration tumorale, et leur faible stabilité et faible solubilité entravent leur utilisation généralisée. La direction inhomogène de leur attachement sur le vecteur de ciblage est aussi considérée comme un obstacle à la liaison non spécifique. Pour produire des anticorps avec une pénétration tumorale améliorée, une large gamme de formats d'anticorps ont été conçus et testés. En dehors des anticorps classiques, un format d'anticorps unique est présent dans les espèces de la famille des Camelidae. Les anticorps à chaîne lourde (HCAbs) se produisent naturellement dans le sang périphérique et le lait de ces espèces. Les fragments de liaison à l'antigène de tels HCAbs sont composés d'un seul domaine, le domaine variable de chaîne lourde (VH) de l'HCAb camelidé (VHH). Le VHH, obtenu par recombinant après clonage et expression dans des bactéries ou champignons, est appelé nanobody. Il a un poids moléculaire de 11–15 kDa et est le plus petit anticorps parmi tous les mAbs. Non seulement leur petite taille les rend potentiellement adaptés comme sondes de ciblage contre des antigènes dans des localisations isolées, mais leur extrémité terminale facilement modifiable est attrayante pour l'application dans le ciblage du cancer.

La livraison efficace des NPs avec un ciblage approprié et l'internalisation des cellules sont aussi des facteurs importants dans le système d'administration. Il a été rapporté que la vimentine joue un rôle important comme composante de l'attachement de pathogènes et des voies d'entrée intracellulaire. Le silence de l'expression du gène de la vimentine inhibe la phagocytose, tandis que la vimentine clivée est un signal qui augmente significativement la phagocytose. Par conséquent, neutraliser la résistance à la phagocytose cellulaire causée par la vimentine à la surface cellulaire est important pour une livraison efficace des nanoparticules.

Dans cette étude, nous investiguons les voies d'endocytose de NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au marquées au nanobody modifiées avec des espaceurs PEG (polyéthylène glycol) de différentes longueurs. La vimentine, qui est connue pour avoir un fort effet sur la phagocytose par des expériences biochimiques, a été comparée comme contrôle, et il a été confirmé qu'elle agit efficacement sur l'internalisation cellulaire des NPs. De plus, la Muc1, qui est une glycoprotéine de surface cellulaire et surexprimée dans divers cancers, tels que pancréatique, sein, poumon, et estomac, est utilisée comme biomarqueur de ciblage du cancer. Nous avons confirmé l'internalisation efficace des NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au et les méthodes de ciblage contrôlable vers les cellules cancéreuses par la voie d'endocytose à médiation par récepteur Muc1 dans les cellules coliques.

Matériaux et Méthodes

Matériaux

Acétate d'or (III) (Au(OOCCH₃)₃, 99,9 %) a été obtenu d'Alfa Aesar. D'autres produits chimiques incluant l'acétylacétonate de fer (III) (Fe(acac)₃, 99,9 %), 1,2-hexadécanediol (C₁₄H₂₉CH(OH)CH₂(OH), 90 %), poly(éthylène glycol)-bloc-poly(propylène glycol)-bloc-poly(éthylène glycol) (PEG-PPG-PEG), et éther octyle (C₈H₁₇OC₈H₁₇, 99 %) ont été achetés chez Sigma-Aldrich et utilisés tels que reçus. Alpha-pyridyl-2-disulfid-omega-carboxy succinimidyl ester poly(éthylène glycol) (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K, et 10K) a été acheté chez Nanocs. Bicarbonate de sodium, WST-1, chlorpromazine, nystatine, cytochalasine D, dynasore, brefeldine A (BFA), monensine, et bleu de trypan ont été achetés chez Sigma-Aldrich. Cy3 et Cy7.5 ont été achetés chez Lumiprobe. Anti-Muc1 Ac a été acheté chez Abcam Inc. (Cambridge, MA). Tampon phosphate salin (PBS), milieu Eagle modifié de Dulbecco, et sérum bovin fœtal ont été achetés chez Invitrogen Corp.

Synthèse des NPs Cœur-Coquille Fe₃O₄-Au

Les NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au ont été synthétisées via une méthode de nanoémulsion. Le processus synthétique pour les NPs cœur-coquille consiste en deux étapes : (1) formation des NPs de cœur Fe₃O₄ et (2) revêtement de la coquille Au sur les NPs magnétiques. Dans la première étape, les NPs de Fe₃O₄ ont été préparées à partir d'une solution mixte de Fe(acac)₃ (0,1766 g ou 0,5 mmol), 1,2-hexadécanediol (0,6468 g ou 2,5 mmol), et copolymère de bloc (poly(oxyde d'éthylène)-poly(oxyde de propylène)-poly(oxyde d'éthylène) ; PEO-PPO-PEO) (0,4 ~ 1,2 g) dans l'éther octyle. La solution mixte a été chauffée à 300 °C pour réduire le précurseur de Fe. La formation des NPs de cœur Fe₃O₄ a été complétée par le refroidissement de la solution chauffée. Le second processus a été conduit continuellement sans aucun processus de purification après la formation du cœur magnétique. Les précurseurs d'Au (0,2338 g ou 0,62 mmol) et 1,2-hexadécanediol (0,88 g, 3,4 mmol) ont été ajoutés dans l'émulsion consistant en NPs de Fe₃O₄, et puis la solution mixte a été chauffée à 230 °C. Après refroidissement à température ambiante, l'émulsion a été précipitée par centrifugation et les NPs cœur-coquille ont été séparées.

Construction du Vecteur d'Expression de l'Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 Recombinant

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été réalisée en utilisant l'amorce forward 5′-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3′ et l'amorce reverse 5′-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3′. Le produit PCR a été digéré avec EcoRI et XhoI et purifié sur gel en utilisant le kit QIA quick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Le produit PCR purifié a été cloné dans pET-23a digéré EcoRI/XhoI (Novagen, Darmstadt, Allemagne). Escherichia coli (E. coli) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) a été transformé avec la construction résultante par choc thermique et sélectionné sur plaques d'agar LB contenant 100 μg/ml ampicilline (Duchefa Biochemie, Haarlem, Pays-Bas).

Expression et Purification de la Protéine Recombinante

Pour exprimer et purifier la protéine anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinante, des souches E. coli BL21 (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) ont été transformées avec pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Les bactéries ont été cultivées dans un bouillon LB contenant de l'ampicilline (100 μg/ml). L'expression de la protéine a été induite par l'isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Pays-Bas) à une concentration finale de 0,4 mM pendant 5 h à 37 °C. Les pellets bactériens ont été resuspendus dans un tampon de lyse (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0 ; 300 mM NaCl) suivis de sonication sur glace pendant 10 min. Les lysats soniqués ont été centrifugés à 20 000×g pendant 20 min à 4 °C et soumis à la résine Ni-NTA His·Bind (Peptron, Daejeon, Corée). Les protéines marquées His qui étaient liées à la résine ont été élues avec un tampon d'élution (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0 ; 300 mM NaCl ; 150 mM imidazole). La protéine purifiée a été séparée sur gel SDS-PAGE à 15 %.

Modification des NPs Cœur-Coquille Fe₃O₄-Au

L'OPSS-PEG-NHS à diverses longueurs (2, 5, et 10 K) a été dissous dans 0,1 M bicarbonate de sodium pour l'activation des groupes thiol. L'OPSS-PEG-NHS activé a été ajouté à la solution de NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au synthétisées et agité pendant 12 h à 4 °C. Les groupes thiol de l'OPSS-PEG-NHS activé ont été liés covalentement à la surface d'Au des NPs cœur-coquille. Ensuite, une solution de nanobody (0,25 mg/ml) a été ajoutée aux NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au PEGylées pendant 12 h à 4 °C. Les groupes amines des dix queues de lysine (K) à l'extrémité terminale ont été liés covalentement aux groupes NHS de l'OPSS-PEG-NHS à pH 8,3. Le Cy3 et le Cy7.5 ont été marqués sur les groupes amines résiduels du nanobody.

Courbe d'Internalisation

Les cellules CT26 ont été ensemencées à 5 × 10³ cellules par puits dans une plaque à 96 puits à fond transparent et incubées dans 250 μl de milieu de culture pendant 24 h à 37 °C en 5 % CO₂ dans l'obscurité. Le milieu a été retiré, et 250 μl de milieu de culture frais contenant 50 μg/ml de NPs Fe₃O₄-Au marqués Cy3 et PEG-Cy3 ou PEG-nanobody-Cy3 marqués ont été ajoutés à chaque puits. Les cellules ont été incubées davantage pour différentes périodes (0, 10, 20, 30, 60, 120, et 360 min). Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec PBS pour éliminer les NPs libres, et la fluorescence de chaque puits a été mesurée avec le bleu de trypan comme quenceur de fluorescence imperméable à la membrane par SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA). Chaque expérience a été réalisée avec des quantités égales de NPs (50 μg/ml) et répétée trois fois.

Test d'Inhibition

Les cellules CT26 ont été ensemencées à 5 × 10³ cellules par puits dans une plaque à 96 puits à fond transparent et incubées dans 250 μl de milieu pendant 24 h à 37 °C en 5 % CO₂ dans l'obscurité. Le milieu a été retiré et 250 μl de milieu de culture frais contenant soit 20 μg/ml chlorpromazine (CPZ), 50 μg/ml nystatine, 20 μg/ml cytochalasine D, 25 μg/ml dynasore, 20 μg/ml BFA, 140 μg/ml monensine, ou 5 μM anti-Muc1 Ac ont été ajoutés, et les cellules ont été incubées pendant 1 h.

Le milieu a été retiré à nouveau, et 250 μl de milieu de culture contenant 50 μg/ml de NPs Fe₃O₄-Au marqués Cy3, NPs PEG-Cy3 marqués, NPs PEG-nanobody-Cy3 marqués, ou NPs vimentine-Cy3 marqués a été ajouté.

Après 1 h à 37 °C et 5 % CO₂, les cellules ont été lavées trois fois avec PBS pour éliminer les NPs libres, et la fluorescence a été mesurée avec le bleu de trypan comme quenceur de fluorescence imperméable à la membrane par SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA). Chaque expérience a été réalisée avec des quantités égales de NPs (50 μg/ml) et répétée quatre fois.

Résultats et Discussion

Les NPs cœur-coquille ont été synthétisées par une méthode publiée. Les observations par microscopie électronique en transmission (MET) en Fig. 1a, b montrent que les NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au étaient sphériques avec un diamètre moyen de 13,5 nm et une distribution de taille étroite. L'augmentation par rapport aux ~ 8,5 nm du NP de cœur (Fe₃O₄) provient du revêtement d'une coquille Au d'épaisseur ~ 2,5 nm sur la surface du cœur, résultant en un NP cœur-coquille. Une image MET à haute résolution avec analyse de transformée de Fourier rapide (TFR) du NP cœur-coquille Fe₃O₄-Au est incluse dans l'Information Supplémentaire Fig. S1.

Le produit fabriqué dans un solvant organique a été purifié par séparation magnétique et transféré dans l'eau. Les NPs cœur-coquille étaient bien dispersées et stables dans l'eau sans aucune modification de surface, grâce aux copolymères de bloc résiduels présents sur les NPs.

La Figure 1c et d montrent les NPs en solution aqueuse avant et après l'application d'un champ magnétique externe. Sous un champ magnétique externe, les NPs cœur-coquille passent rapidement d'une dispersion homogène (Fig. 1c) à une solution claire et transparente (Fig. 1d). La bande d'absorption des NPs cœur-coquille a été investiguée par spectrométrie UV-Vis. Comme montré en Fig. 1e, un pic d'absorbance apparaît à ~ 530 nm, indiquant la présence d'Au à la surface des NPs. Comme l'échantillon a été purifié, les résultats optiques démontrent la formation de la structure cœur-coquille.

Les boucles d'hystérésis magnétique ont été obtenues par mesures d'échantillon vibrant pour investiguer les propriétés magnétiques du cœur Fe₃O₄ et des NPs cœur-coquille. Les deux NPs montraient un comportement superparamagnétique avec une coercivité proche de 0 Oe à température ambiante (Fig. 1f). Comme rapporté dans des travaux précédents, la susceptibilité des NPs cœur-coquille était plus élevée que celle des NPs de magnétite, ce qui pourrait être partly dû aux effets de proximité et configurations spatiales uniques. De plus, les aimantations de saturation des NPs de cœur et des NPs cœur-coquille sont ~ 37 emu/g et ~ 21 emu/g à 10 kOe, respectivement. La différence dans Ms provient de l'existence d'un composant non magnétique (Au) dans les NPs cœur-coquille.

Le gène VHH 5-24 K10 a été cloné in-frame pour produire pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 après amplification PCR (Fig. 2a). La protéine recombinante a été exprimée dans E. coli BL21 transformé avec pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 après induction par IPTG et purifiée par résine Ni-NTA His·Bind. L'anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinant a été facilement exprimé dans E. coli comme une protéine soluble de 18 kDa. D'une culture de 1 L, nous avons obtenu 1 ± 0,5 mg d'anti-Muc1-VHH 5-24 K10 recombinant purifié.

La protéine purifiée a été vérifiée par gel SDS-PAGE à 15 %. La coloration au bleu de Coomassie de la protéine purifiée a révélé qu'elle était > 95 % pure (Fig. 2b). Les NPs Fe₃O₄-Au synthétisées ont été modifiées en trois étapes, à savoir PEGylation, marquage d'anticorps, et marquage de colorant (Fig. 2c). Après chaque étape de modification, le potentiel zêta a été mesuré pour confirmer la modification réussie. Le Tableau 1 montre l'effet de la modification sur les potentiels zêta correspondants. Le potentiel zêta des NPs cœur-coquille nues était de −19,8 ± 6,68 mV. La PEGylation des NPs a été réalisée en utilisant l'OPSS-PEG-NHS. Pour produire une série de nanocomplexes avec différentes tailles, l'OPSS-PEG-NHS avec diverses longueurs (2K, 5K, et 10K) a été utilisé.

Après PEGylation, les potentiels zêta ont été réduits (−44,9 ± 8,19 mV, −40,7 ± 7,88 mV, et −39,6 ± 8,74 mV pour 2K, 5K, et 10K respectivement). Intéressant, après marquage du nanobody, les potentiels zêta ont clairement augmenté (−38,5 ± 5,61 mV, −23,3 ± 8,61 mV, et −31,8 ± 7,37 mV pour 2K, 5K, et 10K respectivement). Après marquage du colorant, les potentiels zêta ont aussi augmenté (−12,5 ± 7,25 mV, −17,7 ± 3,94 mV, et −10,6 ± 4,72 mV pour 2, 5, et 10K respectivement). Le potentiel zêta des NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au nues était de −19,8 ± 6,68 mV. Après PEGylation, le potentiel zêta a été réduit à environ −40 mV. Ces résultats indiquent que les molécules de PEG étaient bien liées covalentement à la coquille Au des NPs cœur-coquille car les molécules de PEG ont des groupes fonctionnels N-hydroxysuccinimide chargés négativement. Pendant ce temps, le potentiel zêta a augmenté après marquage du colorant au nanobody (−38,5 ± 5,61 mV pour NP-PEG2K-nanobody et −12,5 ± 7,25 mV pour NP-PEG2K-nanobody-colorant). Ce résultat est raisonnable car le nanobody recombinant a dix queues de lysine à l'extrémité terminale. Chaque type de nanobody a été catégorisé par mesure du potentiel zêta, et pour déterminer la liaison d'anticorps sur le nanobody, nous avons mesuré la fluorescence pour chaque type de nanobody.

Comme montré en Fig. 3, nous avons confirmé que tous les types de nanoparticules et nanobodies ont une bonne absorption cellulaire et internalisation en l'absence de restrictions d'inhibiteur. Une courbe d'internalisation cellulaire a été obtenue à partir de cellules incubées en présence de 50 μg/ml de NPs Fe₃O₄-Au marqués Cy3, NPs PEG-Cy3 marqués, et NPs PEG-nanobody-Cy3 marqués pour différentes périodes (entre 0 et 360 min) après retrait du milieu, lavage des NPs libres, et finalement mesure de la fluorescence totale des cellules avec bleu de trypan (Fig. 3). Selon le résultat de mesure d'intensité de fluorescence, nous pouvons déterminer que les NPs étaient internalisées dans les cellules dans 1 h (Fig. 3a). L'intensité de fluorescence du NP a atteint un maximum dans 1 h, et l'intensité de fluorescence a diminué progressivement après avoir atteint un état stable. Même s'il y a une légère différence de temps selon la présence d'Ac, l'intensité de fluorescence par temps de culture n'était pas significativement différente du résultat des NPs nues (Fig. 3b). Comme montré en Fig. 3c, il a été confirmé que l'effet de l'Ac, en utilisant l'Ac hétérogène de la Muc1 et de la vimentine, était négligeable dans l'absorption cellulaire et l'internalisation des NPs.

Avec le test WST-1, la viabilité (%) des cellules CT26 mucineuses selon la concentration et la modification de surface des NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au a été estimée suivant divers temps d'exposition (Fig. 4a, b). La viabilité des cellules CT26 n'a pas montré de différences significatives suivant 24 h et 48 h d'exposition, soit avec des doses variables, soit après modification de surface des NPs. La viabilité cellulaire était supérieure à 90 % sur les NPs Fe₃O₄-Au nues (Fig. 4a) et les NPs modifiées en surface (Fig. 4b).

La Figure 5 indique que les NPs entraient dans les cellules CT26 mucineuses via diverses voies d'endocytose (voies médiées par clathrine, médiées par caveoles, et phagocytose/macropinocytose). Intéressant, la Fig. 5b montre que l'anti-Muc1 Ac affectait aussi principalement l'endocytose des NPs PEG-nanobody-Cy3 marquées. Pour comprendre la voie d'internalisation des NPs, nous avons essayé d'inhiber les voies d'endocytose avec des inhibiteurs chimiques spécifiques (Fig. 5). Les voies d'endocytose sont bien connues pour être divisées en trois types : endocytose médiée par clathrine, endocytose médiée par caveoles, et macropinocytose/phagocytose.

Dans cette étude, les inhibiteurs ont été utilisés comme première approche pour investiguer l'internalisation des NPs marquées au nanobody. CPZ (inhibiteur d'endocytose médiée par clathrine), nystatine (inhibiteur d'endocytose médiée par caveoles), dynasore (inhibiteur de dynamine), cytochalasine D (inhibiteur de phagocytose/macropinocytose), BFA (destructeur d'appareil de Golgi), monensine (inhibiteur de lysosome), ou anti-Muc1 Ac (compétiteur spécifique récepteur/transporteur) ont été incubés avec les cellules pendant 1 h. CPZ, nystatine, dynasore, et cytochalasine D affectaient l'endocytose des NPs (Fig. 5a).

La moiety de ciblage est la clé du succès du ciblage du cancer, qui est exceptionnellement important dans la thérapie du cancer. Pour le ciblage, une modification de surface efficace est très importante pour augmenter l'efficacité thérapeutique et limiter les effets secondaires. Les NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au marquées au nanobody ont été fabriquées avec succès à partir des NPs synthétisées et du nanobody recombinant. Le Tableau 1 montre clairement que chaque étape de modification a été réalisée avec succès.

La viabilité cellulaire est l'un des éléments essentiels pour l'application biologique des nanomatériaux. Les viabilités cellulaires étaient supérieures à 90 % sur les NPs cœur-coquille nues et les NPs modifiées (Fig. 4a, b). Ces résultats impliquent que les NPs Fe₃O₄-Au nues et les NPs modifiées ne causaient pas de cytotoxicité significative dépendante de la concentration et de la modification et que les NPs modifiées étaient adaptées pour l'application biologique.

Les études d'efficacité d'internalisation et d'effet d'inhibiteur des NPs fournissent des informations importantes pour comprendre les mécanismes par lesquels les NPs entrent dans les cellules. Les NPs PEGylées étaient relativement lentement internalisées dans les cellules comparées aux NPs nues, mais les NPs marquées au nanobody étaient internalisées dans les cellules légèrement plus vite que les NPs nues (Fig. 3a, b). Comme la PEGylation est une méthode de modification de surface bien connue pour prévenir l'internalisation des NPs, la tendance d'internalisation des NPs PEGylées est facilement expliquée. De plus, le nanobody a induit l'endocytose des NPs. Pour vérifier la spécificité du nanobody, nous avons confirmé le taux d'internalisation des NPs marquées à l'anticorps vimentine. Intéressant, les NPs marquées à l'anticorps vimentine ne favorisaient pas l'internalisation cellulaire (Fig. 3c).

Ces résultats indiquent que le nanobody peut efficacement induire l'internalisation des nanomatériaux dans les cellules CT26 mucineuses et impliquent que la tendance d'internalisation peut être contrôlée avec une modification spécifique de la membrane externe des NPs. De plus, les mécanismes de l'endocytose des NPs marquées au nanobody ont été clairement montrés via les tests d'inhibition et l'imagerie par microscopie confocale. La photofluorescence des NPs marquées au nanobody et des NPs non marquées montraient des valeurs décroissantes similaires quand cultivées avec CPZ, nystatine, ou dynasore (Fig. 5a, b). CPZ, nystatine, et dynasore jouent un rôle en inhibant respectivement l'endocytose médiée par clathrine, l'endocytose médiée par caveoles, et la dynamine, qui est une grande GTPase impliquée dans le bourgeonnement et la scission des vésicules naissantes des membranes parentes. Par conséquent, les valeurs de photofluorescence dans les deux cas ont diminué rapidement car la dynamine est étroitement liée à la production de vésicules pour l'endocytose médiée par clathrine et par caveoles. Comme montré en Fig. 5a, les NPs non marquées (Fig. 5a) et les NPs marquées au nanobody (Fig. 5b) montraient des diminutions rapides de photofluorescence.

En particulier, les NPs marquées au nanobody affichaient des valeurs de photofluorescence significativement plus basses dans CPZ, nystatine, et dynasore. De plus, nous avons confirmé que les NPs non marquées étaient plus fortement affectées que les NPs marquées au nanobody quand appliquées à la cytochalasine D, qui est une toxine perméable aux cellules qui bloque la polymérisation des filaments d'actine pour la phagocytose. Ces résultats impliquent que les NPs non marquées étaient internalisées à travers de multiples mécanismes tels que l'endocytose médiée par clathrine, l'endocytose médiée par caveoles, et la phagocytose. Par conséquent, l'internalisation cellulaire des NPs marquées au nanobody dépend de l'endocytose médiée par clathrine et par caveoles. De plus, la quantité d'absorption cellulaire des NPs marquées au nanobody était réduite considérablement quand les cellules étaient cultivées avec l'anticorps Muc1 (Fig. 5b). Ce résultat indique que l'anticorps Muc1 libre joue un rôle comme compétiteur du nanobody sur les NPs modifiées en s'attachant à la membrane cellulaire CT26 et que l'anticorps Muc1 joue une partie importante dans l'internalisation cellulaire des NPs modifiées. Particulièrement, les NPs marquées à l'anticorps vimentine montraient des différences évidentes comparées aux NPs marquées au nanobody en termes de capacité d'inhibition. La photofluorescence des NPs marquées à la vimentine est restée inchangée sous tests d'inhibition multiples, indiquant que les NPs étaient minimalement influencées par la nystatine, la dynasore, la cytochalasine D, et même l'Ac Muc1. Ce phénomène pourrait être une preuve de l'efficacité de la vimentine, qui a été biochimiquement confirmée pour affecter puissamment la phagocytose. Par conséquent, ce résultat indique que l'Ac Muc1 peut cibler des molécules spécifiques et peut contrôler l'endocytose spécifique.

Comme montré en Fig. 6, des résultats analogues ont été obtenus quand les cellules étaient traitées avec des NPs cœur-coquille nues marquées Cy7.5 et NPs PEG-nanobody marquées, indiquant une absorption cellulaire similaire dans les deux cas en l'absence d'inhibition par dynasore. L'inhibition par dynasore induisait une internalisation cellulaire distinctement plus faible des NPs PEG-nanobody marquées comparées aux NPs nues (Fig. 6b, rangée du bas). Ces résultats impliquent qu'il y a deux mécanismes d'endocytose, qui sont l'endocytose non spécifique des NPs nues et l'endocytose restreinte des NPs marquées au nanobody via la molécule de dynamine. Une fois que le nanobody s'attache à la membrane cellulaire externe, les NPs marquées au nanobody pourraient facilement passer à travers la membrane cellulaire à cause de l'activation simultanée des mécanismes médiés par clathrine et caveoles. Par conséquent, nous pourrions supposer que les mécanismes principaux sont l'endocytose médiée par clathrine et par caveoles pour l'internalisation des NPs marquées au nanobody dans les cellules CT26 mucineuses.

Conclusions

Les nanomatériaux pour le ciblage du cancer et l'insertion contrôlable de matériaux exogènes tels que médicaments, gènes, et peptides sont des avancées critiques dans les applications biomédicales. Ces concepts familiers mais créatifs peuvent offrir des stratégies pour de nouvelles méthodes thérapeutiques. Dans cet article, nous avons démontré une absorption cellulaire améliorée des NPs cœur-coquille Fe₃O₄-Au après PEGylation avec l'anticorps Muc1. Les principaux mécanismes d'endocytose des NPs marquées au nanobody ont été démontrés, montrant la possibilité d'endocytose spécifique contrôlable dans les cellules de cancer colorectal. Ces découvertes fournissent un aperçu du ciblage entre les NPs marquées au nanobody et les cellules de cancer colorectal pour aider la conception de vecteurs de ciblage à haute efficacité.

Disponibilité des Données et Matériaux

Toutes les données générées ou analysées pendant cette étude sont incluses dans cet article publié.

Abréviations

Fe₃O₄ :

Magnétite

Au :

Or

NPs :

Nanoparticules

Ac :

Anticorps

HCAbs :

Anticorps à chaîne lourde

VHH :

VH de l'HCAb camelidé

PEG :

Poly(éthylène glycol)

PPG :

Poly(propylène glycol)

PCR :

Réaction en chaîne par polymérase

MET :

Microscopie électronique en transmission

PEO-PPO-PEO :

Poly(oxyde d'éthylène)-poly(oxyde de propylène)-poly(oxyde d'éthylène)

OPSS-PEG-NHS :

Orthopyridyl disulfide PDP PEG ester succinimidyl

BFA :

Brefeldine A

CPZ :

Chlorpromazine