Étude quantitative de l'internalisation des nanoparticules de PLGA dans les cellules cancéreuses du larynx et immunitaires pour améliorer l'administration de médicaments

Résumé

La traduction clinique des nanomédecines à base de poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) reste limitée, notamment en raison d'une faible efficacité d'administration due à la phagocytose non spécifique par les phagocytes. L'interaction entre nanoparticules, cellules cancéreuses et cellules immunitaires demeure mal comprise. Cette étude réalise une investigation quantitative de l'internalisation cellulaire de particules fluorescentes de PLGA (100 nm, 500 nm et 1 µm) sur des cellules de carcinome laryngé, en présence ou non de monocytes/macrophages, en monoculture et en co-culture. Les particules de PLGA à des concentrations de 5 à 20 µg/mL présentent une excellente biocompatibilité, sauf pour les tailles 500 nm et 1 µm à 20 µg/mL qui réduisent légèrement la viabilité cellulaire. L'observation microscopique montre que les trois tailles sont efficacement internalisées par les deux types cellulaires ; cependant, l'examen quantitatif par fluorescence révèle que l'indice d'internalisation des cellules cancéreuses (fluorescence intracellulaire moyenne par cellule cancéreuse normalisée par macrophage) chute drastiquement en co-culture pour toutes les tailles (1,35–1,05 ; 1,50–0,59 ; 1,4–0,47 respectivement pour 100 nm, 500 nm et 1 µm). L'analyse en cytométrie de flux confirme cette réduction de l'indice d'internalisation des cellules cancéreuses en co-culture, tout en montrant un nombre de particules plus élevé par macrophage. Par ailleurs, la formation de cellules géantes multinucleées par fusion des macrophages augmente après traitement par PLGA, une piste potentielle pour l'administration tumorale de médicaments. Dans l'ensemble, ces résultats apportent de nouveaux éclairages sur l'interaction nanoparticules-cellules immunitaires-cellules cancéreuses, facilitant l'application de nanovecteurs à base de PLGA pour le traitement du carcinome laryngé.

Introduction

Le cancer figure parmi les premières causes de mortalité mondiale, avec environ 10 millions de décès en 2018. Le carcinome laryngé est la deuxième malignité la plus fréquente parmi les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (CETC), comptabilisant environ 180 000 nouveaux cas et 95 000 décès en 2018. Actuellement, des médicaments ciblés sont développés comme option thérapeutique face aux limites des traitements traditionnels (chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie). Les efforts scientifiques s'intensifient pour améliorer le ciblage et l'efficacité des médicaments tout en réduisant les effets secondaires, via le développement de nanovecteurs innovants (microneedles), de médicaments anticancéreux personnalisés et de systèmes d'administration ciblée par anticorps thérapeutiques.

Les nanovecteurs sont largement utilisés pour encapsuler des agents anticancéreux (cisplatine, paclitaxel, docétaxel) afin d'améliorer leur solubilité aqueuse, biodisponibilité et stabilité. En général, l'administration de médicaments par nanoparticules permet d'acheminer une large gamme de substances (protéines, anticorps, vaccins, acides nucléiques) vers des zones spécifiques du corps, chez l'animal et l'homme. Toutefois, l'effet de perméabilité et de rétention accrues (EPR) entraîne une efficacité de ciblage très variable selon les types de cancer. Des données récentes suggèrent que le dépôt de nanovecteurs (ici des nanoparticules d'or) dans les tumeurs dépend préférentiellement de la transcytose, un transport transcellulaire biologique impliquant endocytose, transfert vésiculaire et exocytose. Ces résultats contradictoires sur les mécanismes d'administration ciblée soulignent l'importance cruciale de comprendre les bases de l'interaction cellulaire avec les nanomédecines, en combinant multiples stratégies expérimentales : cultures cellulaires in vitro, cultures tissulaires ex vivo et études animales in vivo.

De nombreux nanovecteurs (liposomes, nanoparticules d'albumine, de silice, PLGA) sont employés cliniquement contre divers cancers dont le carcinome laryngé. Les nanoparticules polymères (micelles, PLGA) présentent un fort potentiel biomédical grâce à leurs formulations polyvalentes, leur auto-assemblage, leur forte capacité de charge et leur biocompatibilité. Par exemple, des nanovecteurs PLGA PEGylés chargés de doxorubicine et de vert d'indocyanine permettent une chimio-photothérapie synergique du cancer du sein. De même, des micelles chargées de cisplatine montrent une excellente activité anticancéreuse sur des tumeurs orthotopiques de CETC (lignes SAS-L1 et HSC-2) in vitro et in vivo. Bien que plusieurs nanovecteurs polymères (PLGA, micelles) soient approuvés cliniquement ou en essais, beaucoup d'autres sont en investigation préclinique sur lignées de cancer de la tête et du cou et modèles xénogreffés animaux. La réponse immunitaire de l'hôte aux nanovecteurs est déterminante : une fois dans l'organisme, ils sont inévitablement reconnus par le système immunitaire. Les macrophages, première ligne de défense cellulaire, se spécialisent dans la neutralisation et l'élimination d'allergènes, microorganismes et particules étrangères (ex. nanovecteurs) par phagocytose et activation immunitaire subséquente. La plupart des nanovecteurs novateurs échouent à cibler spécifiquement les tumeurs in vivo à cause de leur accumulation efficace dans le système phagocytaire mononucléaire (MPS), comme les cellules de Kupffer dans le foie et les macrophages de la pulpe splénique. Comprendre les mécanismes d'internalisation des nanoparticules par les cellules immunitaires (monocytes, macrophages) est donc crucial, car il détermine la durée de vie des nanovecteurs dans les tissus et fluides biologiques. Les systèmes de co-culture in vitro attirent une attention croissante en nanomédecine et toxicologie pour mieux refléter les conditions in vivo. Ces systèmes reproduisent fidèlement des états tissulaires sains ou pathologiques et sont utilisés avec fiabilité dans les études d'internalisation cellulaire et d'absorption de médicaments. L'utilisation de modèles de co-culture cellules cancéreuses-cellules immunitaires offre une plateforme adaptée pour sonder les voies et mécanismes d'internalisation de ces nanomatériaux, facilitant la conception de nanovecteurs mieux ciblés vers les cellules cancéreuses tout en réduisant la phagocytose. Il est donc essentiel de déterminer l'efficacité et le devenir des nanoparticules dans les cellules cancéreuses en présence de cellules immunitaires. La plupart des nanovecteurs sont conçus avec des diamètres de 50–200 nm pour exploiter l'effet EPR et prolonger la circulation sanguine, tandis que les plus grosses particules (> 500 nm) sont efficacement éliminées par le MPS. Le PLGA, nanovecteur approuvé par la FDA, en trois tailles (100, 500, 1000 nm) a été sélectionné pour étudier les capacités d'internalisation des cellules UM-SCC-17A (ligne classique de carcinome épidermoïde laryngé) et THP-1 (ligne monocytaire humaine aiguë). Plusieurs études in vitro ont utilisé des nanovecteurs PLGA pour administrer des médicaments et tuer des cellules de CETC en monoculture ; cette étude est la première à sonder simultanément l'efficacité et le mécanisme d'internalisation des nanoparticules par les cellules immunitaires et cancéreuses du larynx en modèle de co-culture avec différentes tailles de PLGA, fournissant une base fondamentale pour le développement de nanomédecines sûres par conception pour la thérapie des CETC.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Trois types de particules de PLGA commercialisées (Sigma-Aldrich) de tailles différentes (100 nm, 500 nm, 1000 nm) ont été utilisés. Toutes étaient chargées en fluorophores verts (excitation/émission 460/500 nm). Reçues sous forme de poudre, elles ont été suspendues dans l'eau distillée à 10 mg/mL. Les diamètres hydrodynamiques et potentiels zêta ont été mesurés par diffusion dynamique de la lumière (DLS) sur un Malvern Zeta Sizer Nano. Les suspensions mères ont été diluées 1:100 dans 80 µL d'eau distillée pour le DLS. Trois mesures répétées par particule ont été effectuées selon les recommandations du fabricant.

Cultures cellulaires UM-SCC-17A et THP-1 et exposition aux particules

La lignée de carcinome laryngé humain UM-SCC-17A et la lignée monocytaire/macrophagique humaine THP-1 (Sigma-Aldrich, USA et Shanghai Hengya Biotechnology, Chine) ont servi à construire le modèle in vitro. Les cellules UM-SCC-17A et THP-1 étaient cultivées respectivement en DMEM ou RPMI-1640 supplémentés de 10 % FBS (Gibco, Allemagne) et 1 % pénicilline-streptomycine (Gibco, Allemagne) à 37 °C, 5 % CO₂. Les cellules THP-1 étaient exposées à 100 nM de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (Sigma, USA) pendant 72 h avant ensemencement pour se différencier en macrophages. Les deux lignées étaient passagées à la trypsine-EDTA 0,5 % tous les 3 jours, avec vérification quotidienne de la morphologie.

Les cellules étaient ensemencées en plaques 24 puits à 0,1 × 10⁶ cellules/puits pour monocultures (tests WST-1 et LDH) ou sur lames de verre pour microscopie de fluorescence. Pour la co-culture, les UM-SCC-17A étaient d'abord ensemencées à 50 000/puits overnight, puis 50 000/puits de THP-1 étaient ajoutés. Les particules étaient suspendues dans 500 µL du milieu de culture respectif (monoculture) ou d'un mélange 1:1 des deux milieux (co-culture) et exposées 24 h à des concentrations finales de 5, 10, 20 µg/mL (WST-1, LDH) ou 10 µg/mL (microscopie). Pour la cytométrie de flux (FACS), l'ensemencement se faisait en plaques 12 puits à 250 000 cellules/puits (ou 125 000 de chaque type en co-culture), avec 1 mL de milieu overnight puis exposition 24 h à 10 µg/mL.

Test de viabilité cellulaire (WST-1)

La viabilité était déterminée par le kit réactif de prolifération cellulaire WST-1 (Roche, Allemagne) selon le protocole du fabricant. La solution WST-1 était diluée 1:10 dans le milieu approprié. Après exposition, le surnageant était éliminé et les cellules incubées 30 min à 37 °C avec 500 µL de solution de travail WST-1. Les échantillons étaient centrifugés 10 min à 14 000 tr/min pour éliminer les particules. L'absorbance (DO) était mesurée à 450 nm sur un Infinite®F200 (Tecan, USA). Les valeurs étaient corrigées par soustraction du blanc (solution WST-1 seule) et les viabilités relatives comparées au contrôle non traité.

Test de fuite membranaire (LDH)

La libération de lactate déshydrogénase (LDH) était mesurée par un kit de détection de cytotoxicité (Roche, Allemagne) pour évaluer la cytotoxicité des particules PLGA. Le surnageant était prélevé 24 h post-exposition, centrifugé 10 min à 14 000 tr/min, dilué 1:10 dans 200 µL de milieu complet. Le contrôle positif correspondait à la libération totale de LDH par incubation avec 0,2 % Triton X-100 à 37 °C pendant 15 min, dilué 1:50. Les échantillons étaient incubés 30 min à température ambiante avec 100 µL de solution de travail LDH, puis la réaction stoppée par 50 µL HCl 1 %. L'absorbance à 492 nm était mesurée (Infinite®F200, Tecan) et les concentrations relatives de LDH calculées selon :
Relative LDH concentration = (sample OD – blank OD) / (positive control OD – blank OD) × 5 × 100 %.

Microscopie de fluorescence

Les cellules étaient visualisées par coloration Hoechst pour localiser les particules. Après 24 h d'exposition, lavages PBS (×3), fixation 10 min au formaldéhyde 4 % à température ambiante, puis incubation 30 min avec 200 µL de solution de coloration (Hoechst 1:1000, BSA 1 % dans PBS). Les lames étaient retournées sur une lame porte-objet avec une goutte d'agent anti-fading DAKO. Quatre canaux optiques étaient utilisés : champ clair (morphologie), DAPI (noyaux), GFP (particules). Les temps d'exposition du canal particules étaient enregistrés pour homogénéiser l'intensité de fluorescence. Les particules intracellulaires étaient quantifiées par intensité de fluorescence sur zones aléatoires via ImageJ. L'indice d'internalisation comparait monocultures et co-cultures : l'intensité fluorescente moyenne (MFI) des particules internalisées était calculée sur ~50 cellules par type, comme la différence entre l'intensité totale (I_total) et l'autofluorescence (I_auto) d'une zone de même taille sans particule. L'indice d'internalisation des cellules cancéreuses = MFI(UM-SCC-17A) / MFI(THP-1) en monoculture ou co-culture.

Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Le FACS quantifiait l'internalisation des trois particules. Après 24 h, les cellules étaient lavées (PBS ×3), décollées à la trypsine-EDTA 0,5 % (4 min, 37 °C), réaction stoppée par 2 mL milieu complet, suspension transférée en tube verre, centrifugée 5 min à 300 × g, 4 °C. Le culot était résuspendu dans 200 µL PBS et maintenu sur glace. Les cellules vivantes étaient gatées (FSC-A vs SSC-A). En co-culture, les cellules étaient analysées sur canal APC vs FSC-A pour séparer UM-SCC-17A des macrophages selon la taille. 30 000 cellules par échantillon étaient analysées, l'intensité de fluorescence moyenne par cellule calculée et normalisée entre particules. Parallèlement, le surnageant, les tampons de lavage (×3 pour éliminer les particules de surface) et les cellules (digestion trypsique) étaient collectés pour mesurer l'intensité fluorescente sur lecteur de microplaques (Infinite®F200, Tecan). Ainsi, le pourcentage de particules internalisées par cellule était déterminé : ex. ~30 000 particules exposées par cellule (puits 12, 250 000 cellules total) à 5 µg de PLGA 100 nm → ~13 000 particules internalisées par cellule (~43 % de la dose). Ce pourcentage permettait de calculer le nombre de particules en co-culture pour chaque type cellulaire en FACS.

Quantification de la fusion cellulaire

La fusion des macrophages en cellules géantes multinucleées (CGM) était définie comme une cellule géante contenant ≥2 noyaux dans un cytoplasme normal, identifiable simultanément en champ clair et fluorescence après coloration. Le pourcentage de fusion = (nombre de noyaux dans les CGM, comptage manuel) / (nombre total de cellules, comptage automatisé ImageJ).

Analyse statistique

Le logiciel GraphPad V8.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) a servi pour l'analyse statistique et la visualisation. Après ANOVA à un facteur, la méthode de Holm-Sidak (comparaisons multiples) ou test t (deux groupes) était appliquée. Toutes les expériences étaient réalisées en triplicatas indépendants, données présentées en moyenne ± écart-type. Significativité : p < 0,05 (*) et p < 0,01 (**).

Résultats et discussion

Caractérisation des particules de poly(acide lactique-co-glycolique)

Les micrographies de fluorescence des particules PLGA (Fig. 1a,b,c) montrent une intensité fluorescente robuste sans diminution significative sur 14 jours (Fichier supplémentaire 1: S1), indiquant une distribution de taille homogène et une grande stabilité de la fluorescence. Selon le fournisseur, les tailles mesurées par DLS sont ~80,6 ± 19,3 nm (100 nm), ~542,6 ± 128,3 nm (500 nm), ~951,9 ± 237,5 nm (1 µm) (Fig. 1d,e,f). Les potentiels zêta moyens sont −20,6 ± 5,3 ; −17 ± 4,6 ; −16,5 ± 3,5 avec indices de polydispersité de 0,057, 0,056, 0,062 respectivement, confirmant une monodispersité élevée. Toutes les particules étaient vortexées et soniquées 5 min en bain d'eau pour éliminer l'agrégation. De petits pics à ~4–6 µm (3–4 %) persistaient pour 100 nm et 1 µm dus à une agrégation résiduelle inévitable.

Évaluation de la viabilité et de la cytotoxicité cellulaires

Grâce à leur biocompatibilité et biodégradabilité supérieures, les particules PLGA sont approuvées par la FDA et l'Agence européenne des médicaments pour applications biomédicales. Elles sont utilisées en clinique et largement en préclinique comme nanovecteurs. Cependant, leur efficacité de ciblage et thérapeutique est entravée, au moins partiellement, par le système immunitaire. Par exemple, la forte phagocytose par les cellules de Kupffer hépatiques limite fortement l'accès des nanovecteurs au site tumoral. Il est donc vital de développer des modèles in vitro avancés pour étudier l'interaction cellules cancéreuses-cellules immunitaires-particules et mieux mimer la situation in vivo d'administration de médicaments. UM-SCC-17A est une lignée unique de carcinome épidermoïde laryngé isolée d'un spécimen primaire. Or, les données sur son efficacité d'internalisation in vitro en co-culture (ex. co-incubation macrophages-cellules cancéreuses) restent insuffisantes, un point à combler pour améliorer la prédiction des réponses in vivo. De plus, la taille et l'enrobage de surface influencent la capacité d'administration aux tumeurs solides, sites malades et cellules cancéreuses in vivo et in vitro. Trois tailles de PLGA ont donc été appliquées aux cellules UM-SCC-17A pour étudier l'effet de la taille sur l'internalisation et la distribution intracellulaire en monoculture et co-culture.

La viabilité cellulaire a été déterminée par WST-1 sur monocultures THP-1 et UM-SCC-17A, et co-culture des deux. Aucun décès cellulaire évident n'est observé avec 100 et 500 nm PLGA à toutes concentrations testées. En revanche, 500 nm et 1 µm PLGA à 20 µg/mL réduisent significativement la viabilité des UM-SCC-17A en monoculture (Fig. 2a). La viabilité des THP-1 n'est pas affectée significativement par les trois PLGA à 5–20 µg/mL (≥ 95 % vs contrôle non traité = 100 %, Fig. 2b). En co-culture, la viabilité n'est pas modifiée par 100 et 500 nm PLGA aux trois doses, mais chute significativement avec 1 µm PLGA à 20 µg/mL (Fig. 2c).

L'évaluation de la cytotoxicité par dosage LDH mesure la fuite membranaire via la LDH extracellulaire. Sa libération dans le surnageant signe une lésion membranaire irréversible. Malgré une légère augmentation de LDH aux doses élevées de 1 µm PLGA sur UM-SCC-17A en monoculture, aucune cytotoxicité nette n'est observée même à 20 µg/mL (Fig. 3a). De même, les trois tailles de PLGA à toutes doses n'induisent pas de libération LDH significative sur THP-1 en monoculture (Fig. 3b), cohérent avec la viabilité. En co-culture, toutes les particules à toutes concentrations montrent une excellente biocompatibilité vis-à-vis des deux cellules (Fig. 3c). Globalement, la gamme de tailles 100 nm–1 µm couvre les tailles typiques de nanovecteurs (50–200 nm : liposomes, micelles, dendrimères, polymères, minicellules) et les particules submicroniques (500 nm, voies de clairance pulmonaire similaires aux NP 10–100 nm) et microniques (1 µm). Aucune cytotoxicité évidente n'est observée sur THP-1 et/ou UM-SCC-17A en monoculture et co-culture, sauf pour 500 nm et 1 µm PLGA à la plus haute concentration sur UM-SCC-17A et co-culture (mais > 85 % survie), indiquant leur adéquation pour les systèmes d'administration de médicaments.

Capacités d'internalisation cellulaire du PLGA en monoculture et co-culture

La Figure 4 montre la morphologie cellulaire (4a,d,g), noyaux et NP 100 nm (4b,e,h), et images fusionnées grossies (4c,f,i) en monoculture et co-culture. Aucune particule n'est observée dans les cellules témoins non traitées (Fichier supplémentaire 1: S2). De gros agrégats de NP 100 nm PLGA sont visibles dans le cytoplasme des macrophages en monoculture (Fig. 4c). Les UM-SCC-17A en monoculture montrent une excellente internalisation des NP 100 nm PLGA, avec fluorescence verte intense à l'intérieur de la membrane (Fig. 4f). Pour mieux illustrer l'accumulation intracellulaire dans THP-1 ou UM-SCC-17A et les particules extracellulaires en co-culture, des superpositions champ clair-fluorescence ont été utilisées (Fichier supplémentaire 1: S3). En co-culture, les deux types cellulaires sont différentiables par morphologie et taille en champ clair : macrophages ronds et petits, cellules cancéreuses grandes et allongées. Cependant, les cellules cancéreuses montrent une ingestion insuffisante due à la forte internalisation des NP 100 nm PLGA par les macrophages. Cela est attendu car les macrophages sont des cellules immunitaires efficaces et spécifiques pour la phagocytose d'agents étrangers. Les Figures 5 et 6 montrent l'analyse qualitative pour 500 nm et 1 µm PLGA. Notons que les morphologies cellulaires ne sont pas altérées après traitement par les différentes tailles à 10 mg/mL (Fig. 4a,d,g ; Fig. 5a,d,g ; Fig. 6a,d,g). Les NP 500 nm et 1 µm PLGA montrent une fluorescence plus forte dans les UM-SCC-17A seules (Fig. 5e,f ; Fig. 6e,f) que dans les THP-1 seules (Fig. 5b,c ; Fig. 6b,c). En co-incubation (Fig. 5h,i ; Fig. 6h,i), une diminution nette du signal dans les cellules cancéreuses est observée, l'intensité fluorescente des particules y étant inférieure à celle des macrophages. Les macrophages phagocytosent rapidement et efficacement tous les types de particules, privant les cellules cancéreuses d'une internalisation suffisante en co-culture. Pour quantifier l'effet de la phagocytose sur la capacité d'internalisation des cellules cancéreuses selon la taille des PLGA, une analyse optique semi-quantitative a été réalisée. L'intensité de fluorescence des particules était calculée sur ~50 cellules porteuses de particules par type pour obtenir une valeur moyenne, et l'indice d'internalisation des cellules cancéreuses = intensité intracellulaire moyenne par cellule cancéreuse normalisée par macrophage (Fig. 7). En monoculture, l'indice pour 100 nm PLGA était ~1,34 ± 0,19, indiquant que les cellules cancéreuses ont internalisé plus de particules que les macrophages. Cela s'explique par la viscosité élevée des particules PLGA et la taille plus grande des cellules cancéreuses laryngées. De même, 500 nm et 1 µm PLGA étaient fortement internalisés par les cellules cancéreuses avec indices ~1,5 ± 0,25 et ~1,4 ± 0,31 respectivement. En co-culture, les indices pour les grosses particules chutaient drastiquement (0,59 ± 0,12 et 0,47 ± 0,10). Pour 100 nm PLGA, les capacités d'internalisation des deux types cellulaires devenaient identiques après 24 h en co-culture. Ces résultats suggèrent que l'ingestion des particules par cellules cancéreuses et macrophages pourrait dépendre de voies d'internalisation différentes en monoculture vs co-culture. De plus, la présence de macrophages réduit l'internalisation des PLGA par les cellules cancéreuses, particulièrement pour les grosses particules, un phénomène observé in vivo dans les études d'administration de nanomédecines.

Quantification de l'internalisation cellulaire par cytométrie de flux

La cytométrie de flux est largement utilisée pour quantifier l'interaction particule-cellule, ex. internalisation taille-dépendante de particules de polystyrène (20–1000 nm) par cellules dendritiques in vivo. Le FACS a servi à analyser le pourcentage de cellules NP-positives et le nombre de particules dans ces cellules en monoculture et co-culture. Le nombre moyen de NP par cellule était calculé via l'intensité de fluorescence totale dans les cellules porteuses normalisée à la fluorescence de la dose totale appliquée. Par ex., ~70 % des PLGA 500 nm étaient déposés dans les cellules cancéreuses, le résidu restant dans le surnageant (Fichier supplémentaire 1: S4). Cette intensité mesurée par lecteur Tecan était comparée aux signaux FACS moyens/totaux (valeurs FITC des populations P5 et P6 Fig. 8) pour estimer le nombre de particules en co-culture. Comme ensemencé, ~50 % des cellules étaient reconnues comme macrophages, le reste comme cellules cancéreuses. On observait ~13 000 particules 100 nm PLGA accumulées dans les cellules cancéreuses et 9 700 dans les macrophages en monoculture (Fig. 8i), cohérent avec la microscopie. Un nombre bien plus faible était internalisé par les cellules cancéreuses monocultivées pour 500 nm (164 ± 30) et 1 µm (45 ± 15), avec un comptage légèrement inférieur dans les macrophages respectifs (Fig. 8i). Ces nombres concordent avec la littérature : ex. moyenne 2 500 NP d'or recouvertes de bromure de cétyltriméthylammonium déposées dans cellules épithéliales, tandis que NP d'or PEGylées n'en avaient que quelques dizaines par cellule. En co-culture, on observe une légère augmentation du nombre de particules 100 nm dans les cellules cancéreuses, malgré une internalisation plus forte par les macrophages. En comparant l'indice d'internalisation monoculture vs co-culture, une réduction ~25 % pour 100 nm PLGA. Les indices chutaient significativement ~2,5 et 3 fois en co-culture pour 500 nm et 1 µm PLGA respectivement (Fig. 8i). Globalement, l'existence de macrophages affecte fortement la capacité d'internalisation des cellules cancéreuses, surtout pour les grosses particules, en excellent accord avec les observations microscopiques.

Actuellement, différentes voies d'internalisation par les cellules cancéreuses selon la taille et la modification de surface des particules sont décrites : endocytose à médiation de clathrine, de caveoles, indépendante de clathrine/caveoles, micropinocytose, macropinocytose. Par ex., des agrégats d'oxyde de fer < 200 nm sont internalisés par cellules MCF-7 via endocytose à clathrine, tandis que les plus gros agrégats passent par macropinocytose. Une autre étude montre que particules de polystyrène neutres 100 nm entrent principalement par macropinocytose, alors que les particules carboxylées préfèrent la voie à clathrine. La phagocytose est la voie classique pour cellules immunitaires (neutrophiles, cellules dendritiques, monocytes/macrophages). Les voies d'internalisation dépendent étroitement de multiples paramètres : taille, composition chimique, modification de surface, protéines du milieu, type cellulaire. Souvent, plusieurs voies participent, ex. endocytose à caveoles, à clathrine et macropinocytose pour NP de chitosane 300–400 nm dans cellules HeLa. Des NP de pullulane modifiées au cholestérol (63 nm) entrent dans cellules HepG2 via macropinocytose et endocytose à clathrine. Plusieurs études montrent que l'internalisation de PLGA implique différentes voies endocytaires, l'endocytose indépendante de clathrine étant la voie principale in vitro. Néanmoins, une fois internalisées, les particules PLGA sont potentiellement piégées dans le système endo-lysosomal (endosomes précoces, de recyclage, tardifs, lysosomes). Notons cependant l'absence d'études sur les mécanismes d'internalisation en systèmes de co- ou tri-culture in vitro, une piste à explorer.

Induction de la fusion cellulaire par les NP de PLGA

De nombreuses preuves montrent que la fusion de monocytes/macrophages en cellules géantes multinucleées (CGM) se produit dans divers processus biologiques. L'implantation de biomatériaux déclenche une réaction corps étranger caractérisée par la fusion des macrophages en CGM et encapsulation fibreuse. Une large gamme de cellules primaires humaines et murines (macrophages alvéolaires, spléniques, microglie, macrophages dérivés de moelle osseuse, monocytes sanguins) et lignées (RAW264.7, UG3) forment des CGM in vitro. Il est connu que les macrophages adoptent un phénotype fusogène lorsqu'ils sont incapables d'ingérer des matériaux étrangers par phagocytose en raison de leur grande taille. Il reste flou si la fusion macrophagique in vitro est liée à la taille des particules dans la gamme 100–1000 nm, facilement phagocytables. Ici, la fusion cellulaire était observée dans tous les groupes (Fig. 9). La fusion était confirmée seulement quand plusieurs noyaux partageaient le même cytoplasme, visible simultanément en champ clair et fluorescence. Une formation spontanée de cellules géantes par THP-1 se produisait dans le groupe témoin sans particules (Fig. 9a), avec ~10 % de fusion (Fig. 9h), comme rapporté. Une fusion taille-dépendante était trouvée pour 100 et 500 nm PLGA, tandis que 1 µm PLGA n'induisait pas d'augmentation significative en monoculture, peut-être du au faible nombre de particules exposées par cellule (~60 à 10 µg/mL). En co-culture avec cellules cancéreuses, les pourcentages de formation de CGM augmentaient dans tous les groupes vs monocultures correspondantes. Particulièrement, une augmentation significative pour 1 µm PLGA (19 %) en co-culture. L'augmentation la plus marquée concernait 500 nm PLGA en co-culture, attribuable à la grande taille des particules et au nombre suffisant internalisé par cellule.

La machinerie moléculaire de la fusion macrophagique a été largement explorée, avec progrès substantiels. Ex. : la formation des récepteurs de fusion CD47 et CD44 médie le processus de fusion et la différenciation des cellules géantes, et la livraison de miR-223 par vésicules NP l'atténue. Des études futures devraient identifier les molécules clés régulant la fusion macrophagique induite par particules et les récepteurs dominants exprimés à la membrane des cellules géantes. Le devenir des CGM est aussi crucial : on pense qu'elles subissent apoptose ou nécrose, libérant particules non digérées ou matériaux géants vers d'autres cellules in vitro ou tissus in vivo, induisant inflammation chronique ou granulomes. Inversement, la fusion macrophagique pourrait bénéficier à l'administration de médicaments par NP : dans tissus tumoraux, la re-libération de médicaments depuis les macrophages vers cellules cancéreuses pourrait potentialiser l'effet cytotoxique. Surtout, la nanomédecine future devrait explorer comment exploiter la fusion macrophagique pour l'administration de nanovecteurs afin d'améliorer diagnostic et thérapie. Car les macrophages sont abondants, ont une excellente capacité d'internalisation de nanomédecines, et peuvent servir au ciblage génique pour réparation tissulaire.

Conclusion

À notre connaissance, cette étude rapporte pour la première fois l'internalisation cellulaire compétitive de particules PLGA (100 nm–1 µm) en co-culture de cellules cancéreuses laryngées UM-SCC-17A et monocytes/macrophages THP-1. Les données prouvent que les cellules immunitaires peuvent altérer/réduire l'internalisation des particules par les cellules cancéreuses in vitro, comme observé in vivo dans l'administration de nanovecteurs. Une fusion cellulaire macrophagique taille-dépendante et liée au modèle de culture induite par PLGA a aussi été démontrée. Futures études devraient sonder les mécanismes d'internalisation en co-culture et concevoir de nouvelles approches pour augmenter l'indice d'internalisation des cellules cancéreuses laryngées en présence de phagocytes. De plus, une évaluation approfondie du trafic intracellulaire et du devenir des nanovecteurs en systèmes de co- ou tri-culture 3D, mieux mimant les conditions in vivo, est nécessaire avant études animales in vivo et essais cliniques.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données générées ou analysées durant cette étude sont incluses dans cet article publié [et ses fichiers d'information supplémentaires].

Abréviations

PLGA :

Poly(acide lactique-co-glycolique)

CETC :

Carcinome épidermoïde de la tête et du cou

EPR :

Perméabilité et rétention accrues

NP :

Nanoparticules

ICG :

Vert d'indocyanine

MPS :

Système phagocytaire mononucléaire

LDH :

Lactate déshydrogénase

FACS :

Tri cellulaire activé par fluorescence

CGM :

Cellules géantes multinucleées

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière