Évaluation quantitative de l'internalisation cellulaire de nanoparticules polymères dans les cellules cancéreuses du larynx et les cellules immunitaires pour une administration améliorée des médicaments

Introduction

Le cancer est l'une des principales causes de mortalité dans le monde avec environ 10 millions de nouveaux cas de décès signalés en 2018 [1]. Le carcinome laryngé (les cellules cancéreuses proviennent du larynx) est la deuxième tumeur maligne la plus fréquente des carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (HNSCC), représentant environ 180 000 nouveaux cas et 95 000 décès en 2018 [2]. Actuellement, des médicaments ciblés sont développés en tant que traitement facultatif pour les défis introduits par les thérapies traditionnelles telles que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie [3]. Les efforts scientifiques ont été accélérés pour améliorer le ciblage et l'efficacité des médicaments et réduire les effets secondaires indésirables en développant, par exemple, de nouveaux nanotransporteurs de médicaments (c'est-à-dire , microaiguilles), médicaments anticancéreux personnalisés et systèmes d'administration ciblés d'anticorps thérapeutiques [4].

Les nanocarriers ont été largement utilisés pour charger des médicaments anticancéreux tels que le cisplatine, le paclitaxel et le docétaxel afin d'améliorer leur solubilité dans l'eau, leur biodisponibilité et leur stabilité pour une administration et une efficacité améliorées des médicaments [3, 4]. En général, l'administration de médicaments à base de nanoparticules (NP) permet l'administration d'un large éventail d'autres substances (par exemple , protéines, anticorps, vaccins et acides nucléiques) à des régions spécifiques du corps chez les modèles animaux et les patients [4, 5]. Cependant, l'effet dit d'amélioration de la perméabilité et de la rétention (EPR) a entraîné une efficacité de ciblage considérablement variable selon les différents types de cancer [6]. Des preuves récentes suggèrent que le dépôt de nano-supports de médicaments (ici les NP d'or) dans les tumeurs dépend préférentiellement du processus de transcytose [7], un type de transport transcellulaire biologique, dans lequel les substances/NP sont transférées à travers les cellules d'un côté à l'autre. un autre comprenant les cours d'endocytose, de transfert vésiculaire et d'exocytose. Il convient toutefois de noter que les résultats contradictoires concernant les mécanismes d'administration ciblée de médicaments sont d'une importance cruciale pour comprendre la base de l'interaction cellulaire avec les nanomédicaments ou les NP en utilisant plusieurs stratégies expérimentales allant de la culture cellulaire in vitro à la culture tissulaire ex vivo. et étude animale in vivo.

De nombreux nanosupports tels que les liposomes, les NP d'albumine (NP), les NP de silice et l'acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA) ont été cliniquement utilisés pour traiter différents types de cancer, y compris le carcinome laryngé [4]. Les NP à base de polymères telles que les micelles et le PLGA ont un grand potentiel dans les applications biomédicales en raison de leurs formulations polyvalentes de nano-médicaments par simple mélange ou conjugaison covalente, d'une excellente capacité d'auto-assemblage, d'une capacité élevée de chargement de médicaments et de biocompatibilité [8, 9 ]. Par exemple, les nanosupports PLGA revêtus de polyéthylène glycol (PEG) chargés de doxorubicine et de vert d'indocyanine permettent une thérapie chimio-photothermique synergique pour le cancer du sein [10]. En outre, des études in vitro et in vivo ont montré que les micelles chargées de cisplatine présentent une excellente activité anticancéreuse contre les tumeurs orthotopiques HNSCC (c'est-à-dire , SAS-L1 et HSC-2) [11]. Bien que plusieurs nanomédicaments à base de polymères comme le PLGA et les micelles aient été approuvés pour une utilisation clinique ou soient en cours d'évaluation dans des essais cliniques [4, 6], de nombreux autres nanomédicaments polymères sont en cours d'investigation préclinique avec différentes cellules cancéreuses de la tête et du cou. lignées et modèles de tumeurs xénogreffes d'animaux [11,12,13,14].

Des preuves scientifiques ont mis en évidence l'importance des réponses immunologiques de l'hôte aux nano-supports de médicaments, car une fois que ces NP pénètrent dans le corps, elles sont inévitablement reconnues par le système immunitaire. Les macrophages sont considérés comme la première ligne de défense cellulaire de l'hôte, spécialisés dans la neutralisation et l'élimination des allergènes, des micro-organismes et des particules étrangères (par exemple , nanocarriers) via la phagocytose et l'amorçage conséquent des réponses immunitaires. La plupart des nouveaux nanocarriers n'ont pas réussi à cibler la livraison à des régions malades ou à des tumeurs spécifiques in vivo en raison de l'accumulation efficace de NP dans le système des phagocytes mononucléés (MPS), comme les cellules de Kupffer dans le foie et les macrophages de la pulpe rouge dans la rate [15]. Par conséquent, la compréhension des mécanismes d'absorption cellulaire des NP par les cellules immunitaires comme les monocytes et les macrophages est cruciale car elle détermine la durée de vie des nanotransporteurs dans les tissus et les fluides biologiques pertinents. Le système émergent de co-culture cellulaire in vitro a donc progressivement attiré une attention croissante dans les domaines de la nanomédecine et de la toxicologie en raison de la demande croissante d'obtenir des résultats plus significatifs pouvant mieux refléter la condition in vivo [16]. En effet, il a été prouvé que les systèmes de co-culture présentent une situation réaliste en imitant les états de tissus sains et malades [17] et ont été utilisés de manière fiable dans les études d'absorption cellulaire et d'absorption de médicaments [18,19,20,21]. L'utilisation de modèles de co-culture de cellules cancéreuses et de cellules immunitaires offre généralement une plate-forme appropriée pour sonder les voies d'absorption et les mécanismes de ces nanomatériaux dans les cellules, ce qui peut faciliter la conception de nanosupports mieux ciblés sur les cellules cancéreuses tout en réduisant simultanément la phagocytose des NP. Par conséquent, il est essentiel de déterminer l'efficacité d'absorption et le devenir des NP dans les cellules cancéreuses en présence de cellules immunitaires. La plupart des nanoporteurs ont été conçus pour avoir des diamètres de 50 à 200 nm afin d'exploiter l'effet EPR et de prolonger la circulation sanguine, tandis que les NP plus grandes (> 500 nm) sont signalées comme étant efficacement éliminées par le MPS [6]. Le PLGA, un nano-support approuvé par la FDA, de différentes tailles (100, 500 et 1000 nm) a ainsi été sélectionné pour étudier les capacités d'absorption de UM-SCC-17A (une lignée cellulaire classique de carcinome épidermoïde du larynx) [22] et THP- 1 (une lignée cellulaire monocytaire aiguë humaine). Plusieurs études in vitro ont appliqué des nanocarriers PLGA pour délivrer des médicaments pour tuer les cellules cancéreuses HNSCC dans des monocultures [12, 13, 23], il s'agit de la première étude à sonder l'efficacité d'absorption et le mécanisme d'absorption des NP par les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses du larynx de manière synchrone dans un modèle de co-culture en utilisant différentes tailles de PLGA, qui pourrait fournir une base fondamentale pour le développement d'une nouvelle nanomédecine sûre par conception pour la thérapie HNSCC.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Trois particules PLGA commercialisées (Sigma-Aldrich) de différentes tailles, dont 100 nm, 500 nm et 1 000 nm ont été utilisées dans cette étude. Toutes les particules ont été chargées de fluorophores verts avec des longueurs d'onde d'excitation optique et d'émission (ex/em) de 460 nm et 500 nm. Toutes les particules ont été reçues sous forme de poudre et ont été mises en suspension dans de l'eau distillée avec une concentration finale de 10 mg/mL pour une utilisation ultérieure. Les diamètres hydrodynamiques et les potentiels zêta de trois particules ont été déterminés par diffusion dynamique de la lumière (DLS) réalisée avec un instrument Malvern Zeta Sizer Nano (Malvern Instruments Ltd., Malvern, Royaume-Uni). Les suspensions mères de chaque particule ont été diluées au 1:100 dans 80 ul d'eau distillée pour la mesure DLS. Suite à l'indication du fabricant, 3 mesures répétées pour chaque particule ont été obtenues.

Cultures cellulaires de UM-SCC-17A et THP-1 et exposition aux particules

La lignée cellulaire de carcinome laryngé humain UM-SCC-17A et la lignée cellulaire de monocytes/macrophages humains THP-1 achetées respectivement à Sigma-Aldrich, USA et Shanghai Hengya Biotechnology Company (Shanghai, Chine), ont été utilisées pour construire le modèle in vitro dans cette étude. Les cellules UM-SCC-17A et les cellules THP-1 ont été cultivées dans un milieu de culture cellulaire DMEM [22] ou RPMI-1640 additionné de 10 % de FBS (Gibco, Allemagne) et d'une solution à 1 % de pénicilline-streptomycine (Gibco, Allemagne) à 37 °C avec 5% de CO2. Les cellules THP-1 ont été exposées à des solutions 100 nM de Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (Sigma, États-Unis) pendant 72 h avant l'ensemencement des cellules pour se différencier en macrophages. Les deux cellules ont été repiquées avec 0,5 % de trypsine-EDTA tous les 3 jours, et la morphologie cellulaire a été vérifiée tous les jours pour garantir la santé des cellules.

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits à la densité de 0,1 × 10 ⁶ cellules/puits pour les cellules en monoculture pour le dosage WST-1 et LDH, ou sur une lamelle de verre stérile dans des plaques à 24 puits pour la microscopie à fluorescence. Pour le modèle co-cultivé, les cellules UM-SCC-17A ont d'abord été ensemencées dans des plaques à 24 puits à une densité de 50 000/puits pendant la nuit, puis ajoutées avec 50 000/puits de cellules THP-1. Les particules ont été mises en suspension dans 500 µl de milieu de culture cellulaire respectif pour les cellules UM-SCC-17A et THP-1 en monoculture ou de milieu de culture cellulaire mixte 1 : 1 pour les cellules co-cultivées et exposées à des échantillons cellulaires pendant 24 h avec concentrations de 5, 10 et 20 µg/mL pour le test WST-1 et LDH ou 10 µg/mL pour la microscopie à fluorescence.

Pour la mesure FACS, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits de la même manière que celle décrite précédemment à une densité de 250 000 cellules/puits, ou 125 000 cellules/puits chacune pour le modèle co-cultivé. Les cellules ont été cultivées dans 1 mL de milieu de culture cellulaire pendant la nuit et exposées à des particules de PLGA à une concentration finale de 10 µg/mL pendant 24 h.

Test de viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été déterminée par le kit de réactif de prolifération cellulaire WST-1 (Roche, Allemagne) selon les instructions du fabricant. En bref, la solution de WST-1 était diluée à 1:10 dans un milieu de culture cellulaire respectif pour la monoculture UM-SCC-17A ou THP-1, ou dans un milieu de culture cellulaire mixte à 1:1 pour les cellules co-cultivées. Le surnageant a été drainé après l'exposition et les cellules ont été incubées avec 500 ul de solution de travail du test WST-1 à 37 °C pendant 30 min. Les échantillons ont été collectés et centrifugés à 14 000 tr/min pendant 10 minutes pour éliminer les particules. L'absorbance (valeur DO) des solutions a été mesurée sous la longueur d'onde de 450 nm en utilisant Infinite ^® F200 (Tecan, États-Unis). Les valeurs d'absorbance ont été corrigées en soustrayant la valeur d'un échantillon à blanc contenant uniquement la solution de travail WST-1, et les viabilités cellulaires relatives ont été comparées à l'échantillon de contrôle non traité.

Test de fuite de membrane cellulaire

La libération de lactate déshydrogénase (LDH) a été mesurée à l'aide d'un kit commercial de détection de cytotoxicité (LDH) (Roche, Allemagne) pour déterminer la cytotoxicité par les particules PLGA. Le surnageant des cellules a été collecté 24 h après l'exposition, centrifugé à 14 000 tr/min pendant 10 min et dilué à 1:10 dans 200 µl de milieu de culture cellulaire complet. Le contrôle positif a été défini comme la libération totale de LDH en incubant les cellules avec 0,2% de Triton X-100 à 37 °C pendant 15 min et dilué à 1:50 dans 200 ul de milieu de culture cellulaire complet. Les échantillons ont été incubés avec 100 solutions de travail de dosage de LDH pendant 30 minutes à température ambiante, et la réaction a été arrêtée en utilisant 50 µl de HCl à 1 %. L'absorbance à la longueur d'onde de 492 nm a été mesurée à l'aide d'Infinite®F200 (Tecan, États-Unis) et les concentrations relatives de LDH ont été calculées selon l'équation suivante

Microscopie à fluorescence

Les cellules ont été visualisées par coloration Hoechst pour la localisation des particules au microscope à fluorescence. Les cellules ont été lavées avec du PBS 3 fois après 24 h d'exposition des particules et incubées avec du formaldéhyde à 4 % pendant 10 min à température ambiante. Après avoir été fixées avec du formaldéhyde, les cellules ont ensuite été incubées avec 200 ul de solution de coloration contenant du Hoechst dilué à 1:1000. et 1 % de BSA dans du PBS pendant 30 min. Ensuite, les lamelles ont été déplacées sur une lame de verre à l'envers et maintenues avec une goutte d'agent anti-décoloration de fluorescence DAKO pour la visualisation. Quatre canaux optiques ont été réglés à l'aide d'un microscope à fluorescence, dont le brillant pour la morphologie cellulaire, le DAPI pour les noyaux cellulaires et le GFP pour les particules. Les temps d'exposition du canal de particules pour chaque image fluorescente ont été enregistrés et utilisés pour l'homogénéisation de l'intensité de fluorescence à travers différentes particules, et les particules intracellulaires ont été calculées par intensité de fluorescence en utilisant des zones sélectionnées au hasard par ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij /). L'indice d'absorption à travers différentes particules a été comparé entre des cellules UM-SCC-17A en monoculture ou en co-culture. En bref, l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) des particules internalisées a été calculée dans, par exemple, 50 cellules pour chaque type de cellule, qui a été déterminée comme la valeur de soustraction entre l'intensité de fluorescence totale (I _total ) d'une zone spécifique et l'autofluorescence (I _auto ) de la même surface dans l'équation de la région sans particules [24, 25]. L'indice d'absorption des cellules cancéreuses a été déterminé par le MFI de UM-SCC-17A normalisé à celui des cellules THP-1 dans un modèle en monoculture ou en co-culture. Le calcul a été effectué suivant l'équation ci-dessous :

Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été effectué pour mesurer la capacité d'absorption de trois particules. Les cellules ont été lavées avec du PBS trois fois pour éliminer le milieu cellulaire et les particules dissociatives 24 h après l'exposition et incubées avec 200 ul de trypsine 0,5 %-EDTA (Gibco, Allemagne) à 37 °C pendant 4 min pour retirer les cellules de la plaque . Ensuite, la réaction a été arrêtée en ajoutant 2 ml de milieu de culture cellulaire complet, et la suspension cellulaire a été transférée dans un tube en verre pour la mesure FACS et centrifugée pendant 5 min à 300  ×  G, 4 °C. Le surnageant a été déchargé doucement et les cellules ont été mises en suspension dans 200 ul de PBS et conservées sur de la glace. Les cellules vivantes ont d'abord été séparées des débris et des cellules mortes en utilisant une diffusion vers l'avant (FSC-A) côté (SSC-A). Ensuite, les cellules co-cultivées ont été analysées en utilisant le canal APC par rapport au FSC-A pour séparer les cellules UM-SCC-17A des macrophages en fonction de la taille des cellules. Un total de 30 000 cellules a été analysé pour chaque échantillon, et l'intensité de fluorescence moyenne pour chaque cellule a été calculée et normalisée entre différentes particules. Pendant ce temps, après 24 h d'incubation des particules avec les cellules, le surnageant de culture cellulaire, le tampon de lavage (trois fois le lavage pour éliminer les particules résiduelles attachées à la surface cellulaire) et les cellules (digestion trypsinisée) ont été collectés pour mesurer l'intensité de fluorescence à l'aide d'une microplaque. lecteur (Infinite®F200, Tecan). Par cette approche, le pourcentage de particules ingérées par les cellules peut être déterminé pour chaque groupe, par exemple, environ 30 000 particules exposées à une seule cellule dans 12 puits/plaque (250 000 cellules au total) à une dose de 5 µg de 100 nm Particules PLGA, résultant en une moyenne de 13 000 particules internalisées par des cellules individuelles, ce qui représente environ 43 % de la dose appliquée délivrée aux cellules. Ce pourcentage délivré peut être utilisé pour calculer le nombre de particules dans le système de co-culture pour chaque type de cellules dans FACS.

Quantification de la fusion cellulaire

La fusion des macrophages avec les cellules géantes multinucléées (CMG) a été définie comme une cellule géante contenant morphologiquement deux ou plusieurs noyaux dans un cytoplasme normal, qui peut être identifiée clairement et de manière synchrone sur des images à fond clair et des images fluorescentes après coloration, comme indiqué dans la littérature [26] . Le pourcentage de fusion cellulaire a été calculé par le nombre de noyaux MGC (comptage manuel) normalisé par rapport au nombre total de cellules, qui a été déterminé avec une approche automatisée dans ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Analyse statistique

Le logiciel GraphPad V8.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) a été utilisé pour l'analyse statistique et la visualisation des résultats. Suite à l'ANONA unidirectionnelle, la méthode Holm-Sidak ou le test t ont été effectués pour comparer les résultats de plusieurs groupes ou les résultats de deux groupes, respectivement. Toutes les expériences ont été réalisées avec des triplications indépendantes, et les données ont été présentées sous forme de moyenne   ± écart type (STD). Résultats avec p valeur < 0,05 (*) et p < 0,01 (**) ont été considérés comme significatifs.

Résultats et discussion

Caractérisation des particules de poly(acide lactique-co-glycolique)

Les micrographies de fluorescence des particules PLGA (Fig. 1a,b,c) ont montré une intensité de fluorescence robuste et aucune diminution significative des signaux de fluorescence au cours des 14 jours après la préparation (Fichier supplémentaire 1 :S1), suggérant une distribution de taille relativement homogène et une fluorescence élevée stabilité. Comme indiqué par le fournisseur, les particules de PLGA de 100, 500 et 1000 nm présentaient des tailles d'environ 80,6 ± 19,3 nm, 542,6 ± 128,3 nm et 951,9 ± 237,5 nm (Fig. 1d,e,f), respectivement. Selon les mesures du potentiel zêta, les charges de surface moyennes sur les particules se sont avérées être de − 20,6 ± 5,3, − 17 ± 4,6 et − 16,5 ± 3,5 avec un indice de polydispersité de 0,057, 0,056 et 0,062 pour 100, 500 et 1000 particules nm, respectivement, dont ces dernières ont indiqué leurs standards hautement monodispersés. Toutes les particules ont été vortexées puis soniquées dans un bain-marie pendant 5 minutes pour éliminer en grande partie l'agrégation de particules. Cependant, de petits pics correspondant à des particules de 100 et 1000 nm ont été observés avec des diamètres d'environ 4 à 6 µm en raison de l'agrégation inévitable des particules en très petites quantités (environ 3 à 4 %).

Caractérisation des particules PLGA. Les micrographies à fluorescence montrent les différentes tailles (a 100 nm, b 500 nm et c 1 µm) de particules PLGA. Ces particules peuvent être détectées au microscope optique Olympus et présentent des distributions granulométriques relativement uniformes dans la suspension aqueuse. Les mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) affichent la distribution des tailles pondérée par le volume pour 100 nm (d ), 500 (e ), 1 µm (f ) Particules PLGA. Malgré une petite partie de l'agrégation des particules (pics plus petits :3 à 4 %) dans les suspensions PLGA de 100 nm et 1 µm, la distribution granulométrique globale est assez homogène en raison du pic principal étroit

Évaluation de la viabilité cellulaire et de la cytotoxicité

En raison de leur excellente biocompatibilité et biodégradabilité, les particules de PLGA ont été approuvées par la FDA et l'Agence européenne des médicaments pour des applications biomédicales [27, 28]. Les particules de PLGA sont donc actuellement utilisées en clinique et sont largement appliquées dans les études précliniques en tant que nanosupports délivrant des médicaments à des régions malades ou à des tumeurs spécifiques. Cependant, l'efficacité de ciblage et l'efficacité thérapeutique des particules de PLGA sont entravées, au moins partiellement, par le système immunitaire. Par exemple, la phagocytose élevée des particules par les cellules de Kupffer dans le foie a considérablement restreint l'entrée des nano-supports de médicaments dans le site tumoral [15]. Par conséquent, il est d'une importance vitale d'établir des modèles in vitro avancés pour étudier l'interaction entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les particules afin de mieux imiter la situation in vivo de l'administration de médicaments. UM-SCC-17A est une lignée cellulaire unique de carcinome épidermoïde du larynx isolée à partir d'un échantillon de cancer du larynx primaire [29]. Cependant, les informations concernant son efficacité d'absorption cellulaire in vitro dans les systèmes de co-culture (par exemple , co-incubation de macrophages et de cellules cancéreuses) est encore insuffisante, un problème qui doit être résolu pour améliorer la capacité de prédiction des réponses in vivo. De plus, il a été prouvé que la taille des particules et le revêtement de surface jouent un rôle important dans la capacité d'administration aux tumeurs solides, aux sites malades et aux cellules cancéreuses dans les modèles animaux et les cultures cellulaires [30,31,32,33]. Ici, nous avons donc appliqué trois tailles de PLGA à des cellules de carcinome UM-SCC-17A pour étudier les effets de la taille des particules sur l'absorption cellulaire et la distribution intracellulaire dans les systèmes de monoculture et de co-culture.

Cette étude a déterminé la viabilité cellulaire en utilisant la méthode WST-1 (4-[3-(4-iodophényl)-2-(4-nitrophényl)-2H-5-tétrazolio]-1,3-benzène disulfonate) pour la monoculture THP-1 et les cellules UM-SCC-17A, ainsi qu'une co-culture des deux types de cellules. Bien qu'aucune mort cellulaire évidente ne soit survenue dans les groupes traités avec du PLGA de 100 et 500 nm à toutes les concentrations testées, les particules de PLGA de 500 nm et 1 µm à la concentration la plus élevée (20 µg/mL) ont considérablement réduit la viabilité cellulaire en monoculture UM-SCC-17A cellules (Fig. 2a). Comme prévu, la viabilité des cellules THP-1 n'a pas été affectée de manière significative après 24 h d'incubation avec les trois types de PLGA à des concentrations de 5 à 20 µg/mL (≥  95 % de viabilité par rapport aux cellules non traitées, dont la viabilité est considérée comme 100 % , fig. 2b). Identique aux résultats des cellules UM-SCC-17A en monoculture, la viabilité cellulaire dans le système de co-culture n'a pas été altérée par la présence de particules de PLGA de 100 et 500 nm dans les trois dosages utilisés ici, alors qu'elle a diminué de manière significative dans le groupe traité avec 20 µg/mL 1 µm PLGA (Fig. 2c).

Détermination de la viabilité cellulaire dans des cellules en monoculture et en co-culture à l'aide du test WST. UM-SCC-17A (a ) et les cellules THP-1 (b ), et des cellules co-cultivées UM-SCC-17A et THP-1 (c ) ont été traités avec différentes concentrations (5 à 20 µg/mL) de particules de PLGA de trois tailles

L'évaluation de la cytotoxicité des particules à l'aide du test LDH consiste à déterminer la fuite de la membrane cellulaire en mesurant la quantité de LDH extracellulaire [9]. La libération de cette enzyme cytoplasmique dans le surnageant de culture cellulaire est caractéristique d'une lésion de la membrane cellulaire, conduisant à une mort cellulaire irréversible. Malgré la légère augmentation des taux de LDH avec des doses plus élevées dans les cellules en monoculture UM-SCC-17A traitées avec diverses doses de 1 µm de PLGA, aucune cytotoxicité distincte pour les cellules n'a été observée, même à la concentration la plus élevée de 20 µg/mL (Fig. 3a) . Sans surprise, les trois tailles de PLGA utilisées ici à différentes doses n'ont pas pu induire une libération substantielle de LDH dans le surnageant, indiquant les effets toxiques insignifiants sur les cellules THP-1 en monoculture, ce qui est également très cohérent avec les résultats de viabilité cellulaire décrits ci-dessus (Fig. . 3b). Dans les expériences de co-culture, toutes les particules avec des concentrations différentes ont montré une excellente biocompatibilité envers les deux cellules en termes de niveaux de LDH libérés (Fig. 3c). En général, la large gamme de tailles de particules, de 100 nm à 1 µm, qui a été utilisée ici couvre les tailles typiques des nanosupports (50-200 nm), tels que les liposomes, les micelles, les dendrimères, les polymères et les mini-cellules. Cette plage couvre également les particules de taille inférieure au micron (les particules de 500 nm peuvent toujours être considérées comme des NP, par exemple, les particules d'une taille d'environ 500 nm ont les mêmes voies de clairance dans les poumons que celles des NP de 10 à 100 nm [34] et de la taille d'un micron de 1 µm. Aucune de ces particules de PLGA n'a montré de cytotoxicité évidente pour les cellules THP-1 et/ou UM-SCC-17A dans les systèmes de monoculture et de co-culture, à l'exception des particules de PLGA de 500 nm et 1 µm à la concentration la plus élevée contre UM-SCC- 17A et des cellules en co-culture (mais plus de 85 % des cellules ont survécu), ce qui indique qu'elles sont favorables aux applications dans les systèmes d'administration de médicaments.

Détermination de la cytotoxicité pour les cellules en monoculture et en co-culture à l'aide du test LDH. UM-SCC-17A (a ) et les cellules THP-1 (b ), et des cellules co-cultivées (c ) ont été traités avec des particules de PLGA. Aucune mort cellulaire significative n'a été observée après 24 h d'incubation des particules (avec différentes tailles et concentrations utilisées ici) et des cellules dans les systèmes de monoculture et de co-culture

Capacités d'absorption cellulaire du PLGA dans les systèmes de monoculture et de co-culture

La figure 4 montre la morphologie cellulaire (Fig. 4a,d,g), les noyaux cellulaires et les NP à 100 nm (Fig. 4b,e,h) et les images agrandies fusionnées (Fig. 4c,f,i) en monoculture et co- systèmes de culture. Aucune particule n'a été observée dans les cellules non traitées du groupe témoin (Fichier supplémentaire 1 :S2). Des agglomérats massifs de 100 nm de PLGA NPs de grande taille ont été observés dans le cytoplasme cellulaire des cellules de monoculture de macrophages (Fig. 4c). Pendant ce temps, la monoculture UM-SCC-17A a présenté une excellente capacité d'absorption de 100 nm PLGA, prouvée par les signaux de fluorescence vert vif observés à l'intérieur de la membrane cellulaire (Fig. 4f). Pour mieux illustrer l'accumulation intracellulaire de particules PLGA dans les cellules THP-1 ou UM-SCC-17A et de particules extracellulaires dans les co-cultures, des superpositions d'images en champ clair avec des images de fluorescence ont été appliquées comme dans le fichier supplémentaire 1 :S3). Dans le système de co-culture, les deux types de cellules sont différenciables en termes de morphologie et de taille de cellule dans les images en fond clair, dans lesquelles les macrophages affichent une forme ronde et une petite taille, tandis que les cellules cancéreuses présentent une grande taille et une forme allongée. Cependant, les cellules cancéreuses ont montré une ingestion cellulaire insuffisante en raison de l'absorption élevée de PLGA à 100 nm par les macrophages dans le système de co-culture. Ceci est attendu car les macrophages sont considérés comme un type efficace et spécifique de cellules immunitaires pour remplir la fonction de phagocytose pour éliminer les micro-organismes étrangers, les allergènes et les particules. De même, les figures 5 et 6 montrent une analyse qualitative de la capacité d'absorption cellulaire de particules de PLGA de 500 nm et 1 µm dans des cultures cellulaires ou mixtes, respectivement. Il est à noter que les deux morphologies cellulaires n'ont pas été altérées après traitement avec différentes tailles de particules de PLGA à la concentration de 10 mg/mL utilisée ici (Fig. 4a,d,g, Fig. 5a,d,g et Fig. 6a, d,g). Les particules PLGA de 500 nm et 1 µm ont affiché une intensité de fluorescence plus forte dans les cellules UM-SCC-17A uniques (Fig. 5e,f et Fig. 6e,f) que dans les cellules THP-1 uniques (Fig. 5b,c et Fig. . 6b,c). Dans les incubations de co-culture (Fig. 5h,i et Fig. 6h,i), il y a des diminutions de signal apparentes dans les cellules cancéreuses, dans lesquelles l'intensité de fluorescence des particules s'est avérée inférieure à celle des macrophages. Les macrophages ont phagocyté tous les types de particules rapidement et efficacement, de sorte que les cellules cancéreuses ne peuvent pas ingérer suffisamment de particules dans le système de co-culture. Pour quantifier l'effet de la phagocytose sur la capacité d'absorption par les cellules cancéreuses pour différentes tailles de particules PLGA, une analyse optique semi-quantitative a été réalisée. En bref, les intensités de fluorescence des particules ont été calculées sur la base, par exemple, de 50 cellules individuelles chargées de particules pour obtenir une valeur moyenne pour les deux types de cellules, et l'indice d'absorption des cellules cancéreuses a été déterminé en faisant la moyenne de l'intensité de fluorescence des particules intracellulaires par cancer. cellule normalisée à celle des macrophages (Fig. 7). En monoculture, l'indice d'absorption des cellules cancéreuses pour le PLGA à 100 nm s'est avéré être d'environ 1,34 ± 0,19, ce qui suggère que les cellules cancéreuses ont ingéré plus de particules que celles ingérées par les macrophages dans la culture unicellulaire (Fig. 7). Ceci n'est pas surprenant en raison du niveau élevé de viscosité des particules de PLGA et de la plus grande taille des cellules cancéreuses du larynx. De même, 500 nm et 1 µm de PLGA ont également été fortement internalisés par les cellules cancéreuses avec des indices d'absorption d'environ 1,5 ± 0,25 et 1,4 ± 0,31, respectivement, en monoculture. Les indices d'absorption pour les grosses particules ont considérablement diminué (0,59 ± 0,12 et 0,47 ± 0,1) en présence de macrophages dans les systèmes de co-culture. Pendant ce temps, des capacités d'internalisation cellulaire identiques pour les deux types de cellules après 24 h d'incubation de particules PLGA de 100 nm dans la culture cellulaire mixte. Dans l'ensemble, les résultats accumulés ici suggèrent que l'ingestion de particules par les cellules cancéreuses et les macrophages pourrait dépendre de différentes voies d'absorption dans la culture unicellulaire et l'environnement de co-culture. Moreover, the presence of macrophages reduced the cellular internalization of PLGA particles by cancer cells particularly for large ones, a biological event that has been observed in in vivo nanomedicine drug delivery studies [3, 15].

Microscopic examination of cellular internalization of 100 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 100 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b, e, and h) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular uptake of 100 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , je ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A (red arrows). In the co-culture system, 100 nm PLGA nanoparticles were still highly ingested by macrophages but less efficient for cancer cells compared to single cultured cells

Microscopic examination of cellular internalization of 500 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-cultured cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 500 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b , e , h ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular ingestion of 500 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , je ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A cells (red arrows). In the co-culture system, 500 nm PLGA nanoparticles were still highly uptake by macrophages, while cancer cells had inadequate particle internalization

Microscopic examination of cellular internalization of 1 µm PLGA particles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 1 µm PLGA particles for 24 h at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b , e , h ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. A large amount of particle uptake and tremendous accumulation of 1 µm PLGA particles can be visualized in magnified images (c , f , je ) for monoculture THP-1 (yellow arrows) and UM-SCC-17A laryngeal cancer cells (red arrows). In the co-culture system, 1 µm PLGA particles were still efficiently uptake by macrophages, while cancer cells had insufficient particle ingestion

Quantitative analysis of PLGA particle internalization in UM-SCC-17A cells in monoculture and co-culture systems. The percentage of particle fluorescent intensity in UM-SCC-17A cells normalized to that in THP-1 cells for solely and mixed cultured cells

Quantification of cellular uptake by flow cytometry

Flow cytometry is widely used to determine of particle-cell interplay in a quantitative manner, for example, the size-dependent uptake of polystyrene particles with sizes ranging from 20 to 1000 nm by dendritic cells in vivo [35]. FACS was thus utilized for analysis of the percentage of NP-positive cells and particle number in those NP-positive cells in monoculture and co-culture systems. Then, average NP counts in a single cell were calculated by determining the total fluorescence intensity in particle-laden cells normalized to the fluorescence of total applied dose. For example, about 70% of 500 nm PLGA was deposited in the cancer cells, whereas the residual was kept in the supernatant of cell cultures (Additional file 1:S4). This fluorescence intensity measured by a Tecan reader was then compared to the average/total FACS signals (FITC signal values of P5 and P6 in Fig. 8,) to estimate the particle number in the co-culture system. As seeded in the co-cultured cells, about half of the cells were recognized as macrophages and the rest were considered as cancer cells. It was observed that approximately 13,000 of single 100 nm PLGA particles accumulated in cancer cells and 9700 particles in macrophages (Fig. 8i) in the monoculture, consistent with the above microscopic examinations. A much lower particle number (164 ± 30 and 45 ± 15) was ingested by monocultured cancer cells for 500 nm and 1 µm PLGA, with a slightly lower particle count in the respective macrophages (Fig. 8i). The number of particles ingested by single cells is in great agreement with the literature records [24]; for instance, an average 2500 of gold NPs coated with cetyltrimethylammonium bromide were deposited in epithelial cells, while PEG-modified gold NPs only had a few tens per cell [36]. In co-culture systems, unexpectedly, there is a slight increase of 100 nm particle number in cancer cells, despite a higher enhancement of NP internalization by macrophage. Comparing to the uptake index in the single-cell to mixed cell culture, it also reduces about 25% for 100 nm PLGA particles. The uptake indices were found to significantly decline with around 2.5 and 3 folds reduction in co-cultured system for 500 nm and 1 µm PLGA, respectively (Fig. 8i). Generally, it was found that the existence of macrophages largely affects the uptake ability of cancer cells especially for large particles, which is also in excellent agreement with the above observations.

Particle uptake quantification in monoculture UM-SCC-17A cells and co-culture with THP-1 cells by flow cytometry. Grating strategy to identify respective cell populations in mixed cell culture (a –h ). Gating is showing one representative experiment of cells exposure to 500 nm PLGA particles. With initial live gating in the y-axis with a side scatter (SSC-A) and x-axis with a forward scattering (FSC-A), P2 a were further gated with FSC-A versus APC-A to differentiate the THP-1 cells in P4 c from UM-SCC-17A cell population in P3 (monoculture cells (b ) and mixed cells (c )). The cell population of P3 further displayed as counts versus FITC plots (P5) in non-exposed cells (d ), monoculture cells (e ), and co-cultured cells (h ). Also, P6 is the counts versus FITC-A plot originated from P4 population in non-exposed cells (g ) and co-cultured cells (f ). Both types of cells efficiently ingested the 500 nm PLGA indicated by the solid histogram completed shifted to the right side of the x -axis, indicating particles are taken up by all exposed cells. Quantification of particle-laden numbers (i ) in both types of cells for mono-culture and co-culture systems

Currently, different uptake pathways by cancer cells in ingesting particles with different sizes and surface modifications like clathrin-mediated endocytosis, caveolae-mediated endocytosis, clathrin- and caveolae-independent endocytosis, micropinocytosis, and macropinocytosis have been claimed in the literature [37]. For instance, it has been proved that iron oxide aggregates with a size of < 200 nm are taken up by MCF-7 cells through the clathrin-mediated endocytosis, whereas larger aggregates tend to be ingested via macropinocytosis [38]. Another study has demonstrated that 100 nm plain polystyrene particles tended to be taken up mainly through macropinocytosis, whereas the internalization of carboxylated polystyrene particles prefer to occur via the clathrin-mediated endocytic route [25]. Phagocytosis is a classical uptake pathway for immune cells such as neutrophils, dendritic cells, and most importantly monocytes/macrophages. The uptake pathways tightly depend on various parameters of drug delivery vesicles, e.g. , the particle size, chemical composition, surface modification, proteins in the culture environment, as well as cell type. Usually, multiple uptake pathways can be involved in particle ingestion such as the caveolae-mediated endocytosis, clathrin-mediated endocytosis, and macropinocytosis, which has been found to participate in cellular internalization of 300–400 nm chitosan NPs in human HeLa cells [39]. It has also been observed that 63 nm cholesterol-modified pullulan NPs enter into the human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells via macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis [40]. Several previous studies showed that PLGA particle cell uptake involves different endocytic pathways, in which clathrin-independent endocytosis is the main route responsible for the internalization of PLGA in in vitro models [23, 24, 37]. Nevertheless, once they entered into the cells, PLGA particles applied here were highly potentially entrapped by the endo-lysosomal system consisting of early endosomes, recycling endosomes, late endosomes, and lysosomes [41]. It should be noted, however, that there is a lack of studies showing the cellular uptake mechanisms in co- or tri-cultured systems in vitro, a notion that has to be probe in the future.

Induction of cell fusion by PLGA NPs

Extensive scientific evidence has shown that the fusion of monocytes/macrophages into multinucleated giant cells (MGCs) occurred in a broad range of biological processes [42, 43]. Generally, implantation of biomaterials into the body causes a foreign body response characterized by the fusion of macrophages into MGCs and fibrotic encapsulation [44]. A wide type of human and murine primary cells like alveolar macrophages, splenic macrophages, microglia, bone-marrow-derived macrophages, and blood monocytes, as well as cell lines such as RAW264.7 and UG3 were also frequently observed to form MGCs in vitro [26, 45]. It is well-known that the macrophages form a fusogenic phenotype when they are unable to ingest foreign materials via phagocytosis because of the large size of particles or implants. So far, it is unclear whether in vitro macrophage cell fusion relates to the particle size in the range 100–1000 nm, which can be easily phagocytized. Here, the cell fusions were observed in all groups by microscopic examination (Fig. 9). The cellular fusion was confirmed only when multiple nuclei were found to share the same cytoplasm in both fluorescence images and bright-field images. Spontaneous formation of giant cells by THP-1 cells was occurred in the control group without particle treatment (Fig. 9a), with a fusion percentage of about 10% of the total cells (Fig. 9h), as reported in the literature [46]. Size-dependent cellular fusion was found for 100 and 500 nm PLGA particles, whereas 1 µm PLGA-induced insignificant enhancement of fusions in monoculture. This may be due to the small number of 1 µm PLGA particles exposed to cells (approximately 60 particles exposed to each cell at a concentration of 10 µg/mL). When the macrophages were co-cultured with cancer cells, the percentages of MGC formation were increased in all groups in comparison with the corresponding monoculture groups. In particular, there is a significant increment of cellular fusion for 1 µm PLGA (19%) in the mixed cell culture. The most prominent increase in fusion occurred in co-cultured 500 nm PLGA particles, which might be attributed to the large size of particles and sufficient particle numbers ingested per cell.

Visualization and quantification of THP-1 cell fusion in monoculture and co-culture systems. Cell fusion occurred in all groups including the control group without particle treatment for THP-1 cells (a ). Monocultured (b , c ) 100 nm and 500 nm NP-induced significant cell fusion compared to 1 µm PLGA group (d ), which has a slightly higher level than that of the control group. In co-cultured systems, 100 nm (g ) and 1 µm (e ) PLGA had an identical percentage of cellular fusion, which is apparently smaller than that of 500 nm group (f ). Quantification of cell fusion for all groups after 24 h incubation was displayed in h

The molecular machinery involved in macrophage fusion has been widely probed, achieving substantial progress [43]. For example, the formation of macrophage fusion receptors CD47and CD44 together allowed mediating the process of macrophage fusion, and subsequent the differentiation of giant cells [42] and miR-223 delivery by a NP vesicle permitted attenuating it [47]. Hence, further study should focus on the determination of key molecules in regulating particle-induced macrophage fusion and the dominant receptors expressed in the giant cell membrane. Another important concern is the fate of MGCs. It is believed that MGCs fused with particles or stimuli might subsequently experience the process of apoptosis or necrosis [48]. This may lead to the release of undigested particles or other giant materials to the other cells in vitro or biological tissues in vivo, further inducing the long-term inflammatory response or granulomas. On the other hand, the macrophage fusion itself may be benefit for NP drug delivery, for example, in tumorous tissues, the re-release of drugs from macrophages to the cancer cells might represent an enhanced tumor killing ability. More importantly, future nanomedicine study should address how to exploit the application of macrophage fusion for nanocarrier drug delivery to improved disease diagnosis and therapy. This is because not only macrophages an abundant type of immune cells in the body with the excellent uptake ability of nano-drugs, but also they may be used in targeted gene delivery for repair of injured tissues.

Conclusion

To the best of our knowledge, this study first reported the competitive cellular uptake of PLGA particles with sizes ranging from 100 nm to 1 µm in co-cultured UM-SCC-17A laryngeal cancer cells and THP-1 monocytes/macrophages. The data collected here proved that immune cells may alter/lower the particle internalization by cancer cells in vitro, which is similar to the previous findings in in vivo nanocarrier drug delivery studies. Size-dependent and cell culture-related macrophage cellular fusion caused by PLGA particles has also been demonstrated here. Future studies should probe the uptake mechanism in co-cultured systems and design novel approaches to achieve a higher uptake index for laryngeal cancer cells in the presence of phagocytes. Moreover, elaborate evaluation of intracellular trafficking and fate of nano-drug-carriers in co- or tri-cultured systems in 3D, which better mimic the in vivo conditions, is needed prior to the utilization of animal studies in vivo and even in clinical trials.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié [et ses fichiers d'informations supplémentaires].

Abréviations

PLGA:

Poly(lactic-co-glycolic acid)

HNSCC:

Head and neck squamous cell carcinoma

EPR :

Perméabilité et rétention améliorées

NP :

Nanoparticules

ICG:

Indocyanine green

MPS :

Système phagocytaire mononucléaire

LDH :

Lactate déshydrogénase

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting

MGC:

Multinucleated giant cells

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière