Nanoparticules de chitosane conjuguées à l'acide folique ciblées délivrent la génistéine, renforçant l'efficacité anticancéreuse contre le cancer du col de l'utérus

Résumé

Dans ce travail, nous avons conçu des nanoparticules de chitosane conjuguées à l'acide folique (FGCN) pour délivrer l'isoflavone naturelle génistéine (GEN) spécifiquement aux cellules de cancer du col de l'utérus. Comparées aux nanoparticules de chitosane chargées en GEN simples (GCN), les FGCN présentaient un diamètre hydrodynamique légèrement plus grand (~165 nm) et une charge de surface modestement réduite (+21,5 mV). Les deux systèmes atteignaient >95 % d'encapsulation du médicament et une libération contrôlée dans le tampon phosphate salin (pH 7,4), libérant ~90 % de GEN sur 24 h. Les études d'absorption cellulaire dans les cellules HeLa ont montré une augmentation statistiquement significative (p < 0,05) de 2 à 3 fois de l'internalisation pour FGCN versus GCN, attribuable à l'affinité élevée de l'acide folique pour le récepteur folate-α (FR-α) surexprimé. Les tests de cytotoxicité ont révélé que l'IC₅₀ de GEN chutait de 33,8 µg/mL (médicament libre) à 14,6 µg/mL quand délivré via FGCN, tandis que GCN le réduisait à 26,5 µg/mL. L'analyse d'apoptose a démontré que FGCN induisait >55 % de mort cellulaire apoptotique, nettement plus élevé que GCN (~22 %) et GEN libre. Ces résultats confirment que la conjugaison folate améliore la délivrance de GEN, l'absorption cellulaire et l'efficacité antitumorale dans les cellules de cancer du col de l'utérus.

Contexte

Le cancer du col de l'utérus reste une cause majeure de morbidité chez les femmes dans le monde, principalement dû à l'infection par papillomavirus humain (HPV) à haut risque. Bien que les vaccins prophylactiques (Gardasil, Cervarix) et les thérapies conventionnelles — chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie — soient disponibles, elles sont insuffisantes pour de nombreuses patientes, surtout dans les contextes à faibles ressources. Les composés naturels comme les flavonoïdes offrent une activité anticancéreuse avec une toxicité systémique plus faible. La génistéine, une isoflavone de soja, inhibe les kinases tyrosine protéiques et NF-κB, arrête le cycle cellulaire en G2/M et induit l'apoptose ; cependant, son utilité clinique est limitée par sa faible solubilité aqueuse (~1,45 µg/mL) et sa faible biodisponibilité. L'encapsulation nanoparticulaire peut améliorer ces propriétés physicochimiques, améliorer l'accumulation tumorale via l'effet de perméabilité et rétention accrue (EPR), et surmonter la multirésistance aux médicaments.

Le chitosane, un polysaccharide biodégradable riche en amines primaires, est biocompatible et amenable à la modification de surface. La conjugaison d'acide folique (FA) au chitosane cible le récepteur FA-α, surexprimé sur de nombreuses cellules de cancer du col de l'utérus, permettant l'endocytose médiée par récepteur et une délivrance sélective.

Méthodes

Matériaux

Génistéine (Aladdin Chemicals, Shanghai), chitosane (85 % déacétylé, Sigma‑Aldrich), acide folique, EDC et NHS (Sigma‑Aldrich) ont été utilisés tels que reçus.

Préparation des nanoparticules de chitosane conjuguées FA chargées en GEN

L'acide folique a d'abord été activé avec EDC/NHS dans DMSO et conjugué au chitosane (0,5 % p/p) sous agitation à pH 8. Le conjugué FA-chitosane résultant a été purifié par dialyse. GEN, chitosane et FA-chitosane (10:1 p/p) ont été dissous dans DMSO et ajoutés goutte à goutte à 0,5 % Tween-80, suivi d'agitation pendant 3 h. Le solvant a été évaporé, et la suspension centrifugée à 10 000 tr/min (4 °C) pendant 30 min. Le chargement en médicament (DL%) et l'efficacité d'encapsulation (EE%) ont été calculés par HPLC (Agilent LC‑1100, colonne C18, 60 % MeOH/40 % H₂O, 1 mL min⁻¹).

Taille des particules et morphologie de surface

La diffusion dynamique de lumière (Malvern Zetasizer Nano ZS90) a mesuré la taille et la polydispersité. La microscopie électronique en transmission (JEOL JEM‑1230, 100 kV) a visualisé la morphologie.

Libération in vitro du médicament

La libération a été évaluée par dialyse (COPM 3500) dans PBS (pH 7,4) à 37 °C avec agitation douce. Les échantillons ont été prélevés à intervalles prédéterminés et analysés par HPLC.

Culture cellulaire et absorption

Les cellules HeLa (ATCC) ont été maintenues dans DMEM +10 % FBS. L'absorption cellulaire de GCN et FGCN chargées en coumarine-6 a été quantifiée par lecture fluorescence sur microplaques (excitation 430 nm, émission 485 nm) et visualisée par microscopie confocale à balayage laser (Olympus Fluoview).

Tests de cytotoxicité, Live/Dead et apoptose

MTT (5 mg mL⁻¹) a mesuré la viabilité ; les valeurs IC₅₀ ont été ajustées avec GraphPad Prism. La coloration live/dead a utilisé calcein AM/homodimère d'éthidium. L'apoptose a été quantifiée par coloration annexine V/PI et cytométrie de flux.

Analyse statistique

Les données sont présentées comme moyenne ± SD (n = 3). La significativité statistique a été évaluée par test t de Student (p < 0,05).

Résultats et Discussion

Caractérisation physicochimique

GCN présentait un diamètre moyen de 140 nm (+26 mV), tandis que FGCN mesurait 165 nm (+21,5 mV). Les deux avaient EE% >95 % et DL% dans 10–12 %. La taille et le potentiel zêta restaient stables après 3 mois de stockage à 4 °C.

Cinétique de libération in vitro

GCN et FGCN ont libéré ~35–40 % de GEN dans les premières 4 h, atteignant ~90 % de libération cumulative sur 24 h. Le léger retard de libération FGCN est attribué au revêtement FA, qui prolonge la diffusion du médicament.

Absorption cellulaire

Les essais de fluorescence ont montré une absorption 2 à 3 fois plus élevée de FGCN comparé à GCN à 4 h (p < 0,05). Les images confocales ont confirmé une fluorescence intracellulaire intense pour FGCN, indiquant une endocytose médiée par FA réussie.

Cytotoxicité

Valeurs IC₅₀ : GEN libre 33,8 µg mL⁻¹ → GCN 26,5 µg mL⁻¹ → FGCN 14,6 µg mL⁻¹ (24 h). L'efficacité supérieure de FGCN est liée à l'absorption accrue et la libération contrôlée, réduisant l'efflux médié par P-glycoprotéine.

Apoptose

La coloration annexine V/PI a révélé des taux d'apoptose de 0 % (GEN libre), 22 % (GCN) et 55 % (FGCN), soulignant la puissance de la délivrance ciblée.

Test Live/Dead

Les cellules traitées FGCN affichaient une fluorescence verte minimale et une coloration rouge abondante, cohérente avec une mort cellulaire élevée, tandis que les cellules traitées GEN libre restaient largement viables.

Conclusions

Les nanoparticules de chitosane conjuguées à l'acide folique améliorent nettement la délivrance de génistéine aux cellules HeLa de cancer du col de l'utérus, améliorant l'absorption cellulaire, abaissant l'IC₅₀ à 14,6 µg mL⁻¹, et induisant >55 % d'apoptose. Ces résultats soutiennent une évaluation préclinique plus approfondie de FGCN comme plateforme anticancéreuse ciblée prometteuse.

Abréviations

EPR

Perméabilité et rétention accrues

FGCN

Nanoparticules chitosane conjuguées acide folique chargées GEN

FR

Récepteur folate

GCN

Nanoparticules chitosane chargées GEN

GEN

Génistéine