Nanoaiguilles sans solvant, fonctionnalisées à l'acide folique, pour l'administration ciblée de 10-hydroxycamptothécine

Résumé

Les formulations nanoparticulaires traditionnelles de médicaments anticancéreux hydrophobes reposent souvent sur des solvants organiques, soulevant des inquiétudes quant à la toxicité résiduelle. Nous présentons ici une synthèse entièrement verte de nanoaiguilles de 10-hydroxycamptothécine (HCPT) modifiées par l'acide folique (HFND), qui élimine les solvants organiques tout en atteignant un chargement élevé en médicament (70,2 %) et une capacité de ciblage robuste. In vitro, les HFND démontrent une absorption cellulaire supérieure dans les cellules HeLa par rapport aux nanoaiguilles de chitosane-HCPT non ciblées, et les tests MTT révèlent une cytotoxicité accrue à doses équivalentes d'HCPT. L'imagerie in vivo confirme l'accumulation tumorale préférentielle des HFND, et les études thérapeutiques sur des xénogreffes HeLa montrent une suppression tumorale prononcée avec une toxicité systémique minimale. Cette approche sans solvant offre une plateforme prometteuse pour une administration chimiothérapeutique sûre, efficace et pour l'imagerie.

Contexte

Au cours des deux dernières décennies, la recherche s'est concentrée sur la surmontée des limitations pharmacocinétiques de la chimiothérapie conventionnelle grâce à des systèmes d'administration basés sur des nanoparticules offrant une circulation prolongée, un ciblage actif et des capacités d'imagerie multimodales [1, 2]. Les avancées récentes ont mis en évidence l'importance de la forme des particules, les nanostructures à haut rapport d'aspect montrant une internalisation cellulaire et une pénétration tumorale améliorées [10, 26]. Cependant, la plupart de ces stratégies dépendent encore de solvants organiques pour solubiliser les médicaments hydrophobes, entraînant des préoccupations de solvants résiduels qui peuvent s'accumuler dans l'organisme et présenter des risques pour la sécurité [27]. Notre étude comble cette lacune en développant des nanoaiguilles chargées en HCPT et modifiées par l'acide folique via une méthode complètement verte, sans solvant, combinant ainsi un chargement élevé en médicament, une administration ciblée et un potentiel d'imagerie.

Méthodes

Matériaux

Tous les réactifs étaient de grade analytique et utilisés tels que reçus. De l'eau déionisée a été employée tout au long. L'acide folique (FA) provenait de Bio Basic Inc. ; l'HCPT (> 99 % pureté) de Lishizhen Pharmaceutical Co. ; le chitosane (Mw = 70 kDa, 90 % déacétylation) de Zhejiang Aoxing ; le NHS et l'EDC de Sigma‑Aldrich.

Synthèse du conjugué FA‑Chitosane

FA (10 mg), chitosane (20 mg), EDC (4 mg) et NHS (4 mg) ont été agités dans 2 mL de PBS (pH 5,5) à température ambiante pendant 12 h. Le mélange a été dialysé contre un tampon pH 10 pour éliminer l'excès de FA, puis centrifugé (5 000 tr/min) et lyophilisé pendant 24 h pour obtenir la poudre CS‑FA.

Préparation des HFND

HCPT (10 µg) a été dissous dans 200 µL de NaOH 0,1 M (solution A) ; CS‑FA (10 µg) dans 200 µL de HCl 0,1 M (solution B). Les solutions A et B ont été ajoutées goutte à goutte dans 1 mL d'eau pure sous agitation vigoureuse pendant 30 s, puis soniquées (200 W, bain de glace) pendant 6 min. La suspension résultante a été centrifugée (10 000 tr/min, 5 min) et lyophilisée pendant 24 h. Pour comparaison, le chitosane seul a remplacé le CS‑FA dans la solution B pour produire des nanoaiguilles non ciblées (ND).

Caractérisation

La morphologie a été visualisée par MEB (UV‑70, 15 kV). La taille des particules et le potentiel zêta ont été mesurés avec un Malvern Zetasizer Nano‑ZS. La DRX (X'pert PRO) a évalué la cristallinité. La teneur en FA a été quantifiée par UV à 281 nm ; le chargement en HCPT par fluorescence à 383 nm. Les efficacités de chargement et d'encapsulation ont été calculées à l'aide des équations (1) à (4) ci-dessous.

Équations de calcul :

• Chargement en médicament (%) = (poids d'HCPT dans HFND / poids des HFND) × 100 % (1)
• Efficacité d'encapsulation (%) = (poids du médicament dans HFND / poids du médicament initial) × 100 % (2)
• % FA dans la conjugaison = (poids de FA dans la conjugaison / poids de la conjugaison) × 100 % (3)
• Chargement en FA (%) = (1 - % chargement HCPT) × % FA dans la conjugaison × 100 % (4)

Étude de libération in vitro du médicament

Les HFND ont été dispersés dans 10 mL de PBS et placés dans une poche de dialyse (COPM 3 kDa), puis immergés dans 200 mL de PBS (pH 7,4) à 37 °C, 100 tr/min. Des échantillons ont été prélevés sur 48 h et analysés par spectroscopie de fluorescence.

Imagerie confocale des cellules

Les cellules HeLa ont été ensemencées et incubées 24 h avant exposition aux HFND pendant 8 h. L'imagerie a été réalisée sur un microscope confocal Leica (excitation HCPT 382 nm, émission 500–550 nm).

Absorption cellulaire mesurée par fluorescence

Après 6 h d'incubation avec ND ou HFND (HCPT équivalent), les cellules ont été lavées, digérées à la trypsine/EDTA et soniquées. La teneur en HCPT a été quantifiée par fluorescence à 382 nm.

Tests de cytotoxicité

Des tests MTT ont été réalisés sur des cellules HeLa ensemencées dans des plaques à 96 puits. Après 24 h d'exposition au médicament, 20 µL de MTT à 5 mg/mL ont été ajoutés pendant 4 h, suivis de 150 µL de DMSO. L'absorbance a été lue à 570 nm.

Biodistribution

Des ND et HFND chargés en DiR ont été injectés par voie intraveineuse chez des souris nues porteuses de tumeurs HeLa. L'imagerie de fluorescence a été réalisée avec un système Maestro à 1, 4, 8, 12 et 24 h. L'imagerie ex vivo de la tumeur et des organes majeurs a été conduite à 24 h.

Inhibition tumorale in vivo

Lorsque les volumes tumoraux atteignaient ~60 mm³, les souris ont reçu des injections IV de sérum physiologique, HCPT libre, ND ou HFND (80 µg HCPT par souris) tous les 3 jours. Le volume tumoral (0,5×L×W²) et le poids corporel ont été surveillés pendant 21 jours. Post-mortem, les tumeurs ont été pesées et colorées H&E pour l'histologie.

Analyse statistique

Les données ont été analysées par test t de Student bilatéral ; *p* < 0,05 indiquait la significativité (confiance 95 %).

Résultats et Discussion

Synthèse du conjugué FA‑Chitosane

L'acide folique a été lié covalentement au chitosane via une amidation médiée par EDC/NHS (Fig. 1). Les spectres FT-IR (Fig. 2) ont révélé un étirement C=O prononcé à 1605 cm⁻¹, confirmant la formation de liaisons amide. La quantification UV a donné un chargement en FA de 23,4 ± 2,5 % dans le conjugué.

Préparation des HFND

L'insolubilité aqueuse de l'HCPT et la solubilité acide du chitosane ont été exploitées : HCPT dissous dans NaOH et CS‑FA dans HCl. La neutralisation des deux solutions a produit un mauvais solvant pour les deux espèces, déclenchant la précipitation d'HCPT et l'encapsulation concomitante de CS‑FA en nanoaiguilles (Fig. 3a). Les ultrasons et la stabilisation stérique du CS‑FA ont empêché la croissance cristalline massive, produisant des nanoaiguilles à haut rapport d'aspect (Fig. 3b–c). Un criblage par plan d'expériences (Tableau 1) a optimisé le rapport HCPT:CS‑FA, la puissance ultrasonique, le pH et la concentration pour obtenir la morphologie désirée.

L'analyse MEB (Fig. 4) a montré qu'un excès de CS‑FA recouvrait la surface des particules, tandis qu'un CS‑FA insuffisant conduisait à l'agrégation. Un pH neutre était essentiel pour préserver l'intégrité des nanoaiguilles, et la puissance ultrasonique influençait l'agrégation et la fragmentation. Une concentration de mélange plus élevée réduisait la taille des particules, comme confirmé par DLS (Fig. 4f). Les HFND optimisés affichaient une longueur moyenne de ~800 nm, largeur ~80 nm, diamètre hydrodynamique 104,3 ± 5,7 nm, et un potentiel zêta de +16,3 ± 1,9 mV. La dispersion à 2 % p/v restait stable pendant ≥2,5 jours.

Le chargement en médicament était de 70,2 ± 3,1 % et l'efficacité d'encapsulation de 83,1 %. L'acide folique représentait 7,0 % de la masse totale, calculé à partir du pourcentage de FA du conjugué.

Analyse DRX

Les diagrammes DRX (Fig. 5) ont confirmé que l'HCPT restait cristallin dans les HFND, tandis que le chitosane semi-cristallin contribuait à des pics larges. En revanche, les cristaux d'HCPT en vrac (Fig. 6) étaient en forme de bâtonnets et >10 µm de long, soulignant le rôle du CS‑FA dans la modulation de la cinétique de croissance de l'HCPT.

Études de libération in vitro du médicament

L'HCPT libre a libéré 30 % en 1 h et près de 100 % à 18 h. Les HFND ont présenté une libération nettement plus lente et soutenue sur 48 h (Fig. 7), attribuée à la barrière de diffusion de l'enveloppe CS‑FA. Ce profil est idéal pour maintenir des concentrations thérapeutiques tout en minimisant la toxicité liée aux pics de concentration.

Absorption cellulaire

L'imagerie confocale (Fig. 8) a révélé une fluorescence HCPT plus forte dans les cellules HeLa traitées avec HFND versus ND non ciblées, indiquant une absorption médiée par l'acide folique. La quantification par fluorescence (Fig. 9) a corroboré un taux d'internalisation plus élevé pour les HFND, validant la stratégie de ciblage.

Tests de cytotoxicité

Les résultats MTT (Fig. 10) ont montré que les HFND obtenaient une destruction cellulaire supérieure à l'HCPT libre ou aux ND à concentrations équivalentes d'HCPT, soulignant le double avantage de l'administration ciblée et de la libération soutenue. La cytotoxicité accrue est attribuée à une internalisation efficace médiée par les récepteurs et un profil de libération intracellulaire prolongé du médicament.

Biodistribution

L'imagerie in vivo (Fig. 11a) a démontré un signal tumoral négligeable pour DiR‑ND, alors que DiR‑HFND montrait une accumulation prononcée, temps-dépendante, culminant à 12 h. L'analyse ex vivo (Fig. 11b–c) a confirmé une fluorescence tumorale plus élevée pour les HFND, indiquant un ciblage tumoral médié par l'acide folique réussi.

Inhibition tumorale in vivo

Les HFND ont atteint la suppression de croissance tumorale la plus significative, avec des poids tumoraux finaux nettement inférieurs à l'HCPT libre ou aux ND (Fig. 12c). L'histologie (Fig. 12d) a révélé une nécrose extensive dans les tumeurs traitées par HFND. Importamment, les HFND n'ont causé ni perte de poids ni toxicité manifeste, contrastant avec les effets secondaires prononcés observés avec l'HCPT libre (Fig. 12b). Ces résultats démontrent que les HFND combinent une activité antitumorale puissante avec un profil de sécurité favorable.

Conclusions

Nous avons introduit une voie entièrement verte, sans solvant, pour produire des nanoaiguilles d'HCPT fonctionnalisées à l'acide folique combinant chargement élevé en médicament, absorption cellulaire ciblée et libération soutenue. Les données in vitro et in vivo confirment une activité anticancéreuse supérieure et une toxicité systémique réduite par rapport aux formulations conventionnelles. Cette plateforme illustre comment une chimie respectueuse de l'environnement peut être exploitée pour faire progresser les thérapeutiques basées sur les nanoparticules.