Optimisation de l'hyperthermie déclenchée par NIR avec des nanoparticules Cs0.33WO3 pour le traitement du cancer du foie HepG2

Résumé

L'hyperthermie est l'une des méthodes les plus acceptées par les patients pour traiter le cancer grâce à son caractère non invasif, ses effets secondaires et sa toxicité minimes, et sa mise en œuvre aisée, ce qui stimule le développement de nouvelles méthodes thérapeutiques comme les systèmes de dosage déclenchés photothermiquement. Cette recherche examine les variables des effets photothermiques des nanoparticules (NP) de Cs_0.33WO₃ — durée d'irradiation, densité de puissance optique et concentration de NP — sur la lignée cellulaire de cancer du foie HepG2 in vitro, conduisant à la formulation d'une dose thermique irradiée par proche infrarouge (NIR). Les NP de taille particulaire de 120 nm ont été synthétisées par une série de réactions d'oxydo-réduction (REDOX), de recuit thermique et de broyage humide. Leurs propriétés physiques, compositionnelles, optiques et photothermiques ont été caractérisées par diffusion dynamique de la lumière (DLS), spectrométrie à dispersion d'énergie en rayons X (EDS), microscopies électronique à balayage et en transmission (MEB et MET), diffraction des rayons X (XRD) et photospectroscopie visible-proche infrarouge (VIS-NIR). La cytotoxicité des NP et de leurs paramètres d'irradiation a été évaluée sur les cellules HepG2. En incubant les cellules avec les NP, l'état d'endocytose a été vérifié, et la dépendance du taux de survie cellulaire aux paramètres variables de la dose photothermique a été déterminée tout en maintenant la température du milieu de culture à la température corporelle humaine (~36,5 °C).

Introduction

En 2018, le cancer a causé environ 10 millions de décès et 18 millions de nouveaux cas dans le monde. Bien que la chimiothérapie, la radiothérapie, la chirurgie ou leurs combinaisons aient légèrement amélioré le taux de survie à 5 ans à plus de 40 %, la nature toxique des produits chimiques et du bombardement ionique cause inévitablement de nombreux effets secondaires : perte de cheveux, cardiotoxicité, infertilité, anomalies chromosomiques, etc. Ces conséquences graves ont fortement incité au développement de médecines thérapeutiques plus acceptables par les patients, incluant des composés incorporant des nanoparticules.

La nanotechnologie, basée sur des systèmes matériels, structures, formes et stoichiométries atomiques à l'échelle sub-100 nm, produit des propriétés chimiques, physiques et biochimiques sans précédent, améliorées par les phénomènes de quantification, et trouve déjà des applications précliniques et in vitro dans de nombreuses branches des sciences biomédicales. Malgré les inconvénients de la chimiothérapie, les NP comme vecteurs de délivrance améliorent la sélectivité de la libération du médicament dans la tumeur, facilitent l'absorption par les cellules tumorales et réduisent largement la toxicité cumulative dans les tissus sains. De plus, la qualité d'image des modalités d'imagerie basées sur les NP est grandement améliorée avec une sensibilité plus élevée, une résolution spatiale plus fine et une meilleure pénétration en profondeur. En plus de la fonction diagnostique, les NP, lorsqu'elles sont exploitées avec leurs propriétés physiques intrinsèques comme l'ablation par radiofréquence (RF) ou l'hyperthermie rendue photothermiquement, peuvent induire des dommages au site désiré avec une efficacité accrue, la seconde étant préférable pour son dosage site-spécifique, son faible degré de douleur, ses faibles effets secondaires et son risque réduit de brûlure tissulaire.

Les systèmes matériels NP capables d'induire l'hyperthermie sous photo-irradiation incluent l'or (Au), le tungstate de césium (CsWO₃), l'oxyde de fer, le sulfure de cuivre, le graphène et les nanotubes de carbone, qui ont démontré l'applicabilité de l'imposition de dommages létaux aux cellules cancéreuses en augmentant la température extra- ou intracellulaire in situ. Comme pour l'ablation RF assistée par NP, le niveau de densité de puissance des sources photoniques est critique pour la sécurité clinique et le confort du patient. La limite d'exposition maximale pour la peau humaine dans la gamme VIS et NIR (400-980 nm) est de 0,2 à 0,726 W/cm² selon la Commission internationale de protection contre les rayonnements non ionisants (ICNIRP, 2013). Pourtant, la plupart des densités de puissance optique rapportées dans les études in vitro sur cellules cancéreuses dépassent largement cette limite de sécurité, ce qui est préoccupant pour le traitement de tissus internes au seuil de vulnérabilité plus bas. Par exemple, la densité de puissance NIR des NP d'or (Au) détruisant efficacement les cellules cancéreuses varie de 2 à 80 W/cm² pour une irradiation ≤ 10 min. De même, d'autres systèmes comme les oxydes de graphène, le FePt et les nanocristaux NaYF₄:Yb,Er requièrent au moins 150 mW/cm².

Le CsWO₃ NP, matériau moins exploré pour l'in vitro, a montré l'annihilation de cellules cervicales (HeLa) avec au moins 0,72 W/cm², proche de la limite d'exposition cutanée NIR de l'ICNIRP, pouvant causer des effets délétères sur les tissus sains sous exposition prolongée. De plus, la température des milieux de culture engendrée par la combinaison dose de NP, durée d'exposition et intensité optique dépassait largement 40 °C, intolérable pour les cellules humaines saines, et les taux de mortalité des cellules cancéreuses n'étaient pas détaillés.

Le CsWO₃ NP est exceptionnellement absorbant dans le NIR de 800 nm à 2400 nm et fonctionnellement adapté aux applications biomédicales. Malgré son efficacité démontrée pour éliminer les cellules cancéreuses, sa cytotoxicité reste largement inconnue, et il manque une formule de dosage combinant concentration NP de faible cytotoxicité, courte durée d'irradiation et densité de puissance optique dans la limite de sécurité d'exposition cutanée.

Cette étude évalue in vitro la faisabilité d'anéantir les cellules cancéreuses hépatiques HepG2 cultivées dans une boîte de Pétri de 5,2 cm de diamètre, en utilisant une concentration NP non cytotoxique et une densité de puissance optique bien dans la limite d'exposition cutanée, tout en maintenant la température du milieu de culture à 36,5 °C. Des NP Cs_0.33WO₃ de taille moyenne ~120 nm ont été synthétisées par une séquence de redox, recuit thermique et broyage humide, et caractérisées pour leur morphologie de surface, cristallinité, propriétés optiques et photothermiques temporelles. Les effets photothermiques des paramètres variables (durée d'irradiation, concentration NP, densité de puissance NIR à 980 nm) sur le taux de survie des cellules HepG2 ont été examinés pour définir une combinaison de dose thérapeutique sûre.

Méthodes

Synthèse des NP Cs_0.33WO₃

La figure 1 (panneau gauche) illustre le diagramme de flux de la synthèse des NP de tungstate de césium (Cs_0.33WO₃). En bref, les précurseurs ((NH₄)₂WO₄) (Alfa Aesar, 99,9 % pureté) et CsCl (Alfa Aesar, 99,9 % pureté) ont été dissous séparément dans 100 ml d'eau DI, puis mélangés à 25 °C sous agitation constante à 250 tr/min pendant 1 heure. Après agitation, la température a été portée à 180 °C et maintenue jusqu'à évaporation complète de l'eau. La poudre blanche sèche obtenue est le précurseur final. Avec le refroidisseur activé, la poudre précurseur dans un bateau en quartz a été chargée au centre d'un tube de four haute température, la pression ramenée à 0,08 torr. Le précurseur est chauffé à 500 °C avec un apport de gaz H₂ et N₂ (ratio 90:10 SCCM) pour faciliter la réaction redox. Après 1 h, l'H₂ est coupé, le N₂ ajusté à 100 SCCM, et la température portée à 800 °C pour un recuit thermique d'1 heure. Après refroidissement, la poudre bleu foncé obtenue est la poudre Cs_0.33WO₃ de taille micron (μ). Pour réduire la taille des granulés, 150 g de mélange (15 g poudre μ, 3,8 g agent dispersant copolymère, 10 μl agent anti-mousse, eau DI) ont été versés dans un bol contenant 600 g de billes de zircone et monté dans un nanobroyeur (Justnanotech Co., Taiwan). À 2400 tr/min et 15 °C, le broyage avec des billes ZrO₂ de 0,1 mm pendant 4 h, puis 0,05 mm pendant 4 h, a produit les NP. La solution finale a été filtrée à 0,22 μm pour les caractérisations et expériences ultérieures. La version fluorescente (fNP) a été préparée en mélangeant 2 ml de fluorescéine (28 mg/ml) et 2 ml de solution NP (1,5 mg/ml) sous ultrasons 15 min, puis mélange NP/dispersant 1:1,25 sous ultrasons 15 min, lavage eau DI, centrifugation 10 000 tr/min 15 min, répété deux fois.

Caractérisation des matériaux

La caractérisation des NP Cs_0.33WO₃ (tailles statistiques, structure cristalline, morphologie, forme, photo-absorption VIS-NIR) a été réalisée par analyse de potentiel zêta (ZS90, Malvern, UK), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Allemagne), MEB (SU-5000, Hitachi, Japon) avec EDS intégré, MET (JEM-2100F, JEOL, Japon), DLS (Delsa Nano C, Beckman Coulter, USA), spectromètre UV-VIS-NIR (V-750, Jasco, Japon). Les spectres XRD ont été acquis en balayant de 20° à 80° à 4°/min. Le signal de diffraction angle-dépendant a été comparé au spectre standard de Cs_0.32WO₃ (carte JCPDS n° 83-1334). Pour confirmer la dépendance temporelle de la propriété photothermique, un appareil simple composé d'un laser NIR 980 nm et d'une sonde de température a été mis en place. Les solutions testées incluent la solution NP diluée dans l'eau DI et le mélange NP dans le milieu de culture. Le diamètre du faisceau optique a été étendu pour couvrir toute la surface de la boîte de Pétri, produisant 0,05 W/cm² de densité de puissance estimée, sinon intact à 2 W/cm². Un montage optique (figure 1, panneau droit) est utilisé pour l'irradiation NIR. Un lentille bi-concave étend le diamètre du faisceau de 4 mm à 5,2 cm (équivalent au diamètre de la boîte de Pétri), placée sur une plaque chauffante à 36,8 °C (température physiologique), entourée d'une enceinte cylindrique en plastique pour équilibrer la température ambiante et du milieu. Le fichier supplémentaire 1 : Fig. S1 illustre la cartographie de l'intensité optique du faisceau NIR mesurée à la sortie de l'ouverture, vérifiant l'uniformité du champ lumineux sur toute l'ouverture de la boîte de Pétri.

Essais de cytotoxicité et photothermiques

Pour commencer les cycles de culture cellulaire, 500 ml de milieu composé de 440 ml de mélange nutritif Ham's F-12 et milieu essentiel modifié de Dulbecco (HDMEM), 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS), 5 ml de L-glutamine et 5 ml de P/S (Pénicilline-Streptomycine), stérilisés par filtre à mailles 0,22 μm, ont été préparés. Les boîtes de Pétri contenant les cellules (10 cm ou 5,2 cm de diamètre) ont été remplies de 8 ml et 2 ml de milieu respectivement pour la culture primaire et les sous-cultures, incubées à 5 % CO₂ et 37 °C. L'observation de la croissance cellulaire et le renouvellement du milieu étaient effectués tous les deux jours.

Pour obtenir les taux de survie pour les cas : (1) témoin sans entrée externe, (2) irradiation NIR seule, (3) incubation avec NP, (4) incubation avec NP suivie d'irradiation NIR, le milieu a été aspiré, 0,4 ml de trypsine ajouté et incubé ~10 min. Après confirmation du décollement, 10 μl de milieu contenant les cellules ont été prélevés et mélangés à 10 μl de solution de bleu de trypan dans un microtube, puis lavages répétés avec tampon phosphate (PBS) pour éliminer les NP flottants. Le comptage cellulaire a été effectué en remplissant une plaque de comptage avec 10 μl de solution cellulaire teintée, observé au microscope stéréoscopique et compté manuellement ; chaque point de données est une moyenne de trois essais (N = 3) ± écart-type.

Pour l'évaluation de la cytotoxicité des NP et de leurs effets photothermiques, le milieu dans la boîte de 5,2 cm a été retiré, remplacé par une quantité appropriée de solution NP dans le nouveau milieu pour obtenir les concentrations testées : 2, 1,5, 1, 0,5 mg/ml, et incubé un jour avant l'expérience.

Avant l'essai photothermique, l'évaluation de la cytotoxicité a été réalisée pour examiner la réponse des cellules à différentes concentrations NP : le milieu contenant cellules et NP a été retiré de l'incubateur et aspiré. 1 ml de PBS préchauffé a servi à laver les cellules cancéreuses et aspirer les NP CsWO₃ flottants n'ayant pas subi d'endocytose, répété plusieurs fois pour s'assurer qu'aucune mortalité cellulaire n'est causée par la montée de température induite par les NP dans le nouveau milieu. Après le traitement photothermique, la procédure de comptage a été mise en œuvre pour les essais de cytotoxicité et photothermiques.

Résultats

L'absorbance optique et les propriétés photothermiques des nanomatériaux Cs_0.33WO₃ dépendent fortement de la structure cristalline, de la température de post-recuit, de la stoichiométrie atomique et des tailles particulaires.

Pour caractériser la morphologie de surface de la poudre μ Cs_0.33WO₃, des images MEB à grossissement 10 000x ont été acquises, confirmant visuellement la structure hexagonale colonnaire iconique (flèche rouge, figure 2a). Les images MET montrent la forme et les tailles des granulés de poudre μ (~1 μm ou moins, figure 2b). La géométrie en bâtonnet des NP et l'histogramme de distribution DLS centré vers 120 nm ont été vérifiés (figure 2c et image MET en encart). La caractérisation cristalline par XRD de la poudre μ et des NP est présentée figure 2d. Le spectre XRD de la poudre μ (panneau supérieur) montre des plans de cristallisation iconiques le long de (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220), (222), (204), (400) et (224) coïncidant bien avec le spectre standard de Cs_0.32WO₃ (JCPDS 83-1334). Lorsque la taille diminue à 120 nm, les intensités de tous les pics de diffraction diminuent monotoniquest, et certains pics caractéristiques indiquant une forte absorption NIR, comme les plans (102) et (220), deviennent invisibles. L'identification des constituants atomiques (Cs, W, O) par EDS (figure 2e) confirme non seulement leur présence, mais authentifie aussi le rapport des pourcentages atomiques Cs/W = 0,315, proche de la stoichiométrie initialement conçue.

Au-delà de la caractérisation matérielle, les spectres d'absorbance optique des NP et les profils temporels de modulation de température par photothermie ont été mesurés (figure 3). Les figures 3a, b montrent la dépendance de l'absorbance NIR et les profils d'élévation de température induits par la solution NP irradiée NIR en fonction de la concentration NP ; par exemple, le profil temporel à 1 mg/ml dépasse 40 °C et reste stable pendant au moins 1 h, confirmant la stabilité et la durabilité photothermiques. La figure 3c illustre 5 cycles répétitifs sur 190 min, vérifiant la réactivité photothermique. La figure 3d montre les profils temporels de température du milieu de culture et du milieu incorporant NP, sortis de l'incubateur, placés sur la plaque chauffante et irradiés NIR, se stabilisant vers 37 °C sur 10 min, tandis que la température de la solution NP pure irradiée NIR passe de 24,6 °C à 33,6 °C après 10 min. En considérant la fonctionnalité photothermique, l'irradiation NIR pour les expériences suivantes a été conduite pendant 10, 30 et 60 min, maintenant la robustesse des NP et étant potentiellement applicable aux études précliniques.

La dose non toxique des paramètres expérimentaux (durée d'irradiation NIR et concentration NP) a été déterminée en irradiant les cellules pendant 1 h et 2 h à 50 mW/cm² et par interaction directe avec les NP à 0,5, 1, 1,5, 2 mg/ml (figures 4a, b). Le taux de survie reste bien au-dessus de 95 % sur 2 h d'irradiation NIR, confirmant la non-toxicité d'une exposition prolongée au photon 980 nm, et une concentration NP non toxique < 1,5 mg/ml a été déterminée.

Le but du dosage à 1,5 mg/ml ou moins (effet dommageable négligeable sur HepG2) est d'examiner les effets de la dose photothermique sans l'implication de la toxicité intrinsèque des NP. Pour examiner si les NP irradiées NIR peuvent être une solution viable pour éliminer les cellules cancéreuses, les cellules ont été incubées avec les NP à 1,5 mg/ml pendant un jour, puis soumises à l'irradiation NIR pendant 1 h. Les images optiques en champ clair (BF) (figures 5d-f) montrent une réduction claire du nombre de cellules pour une exposition de 1 h (e) ou 2 h (f). Quantitativement, le taux de survie diminue monotoniquest de 84,2 % à 58,4 % lorsque la durée d'irradiation augmente de 10 min à 1 h, une ligne de tendance linéaire s'ajustant bien aux points épars, prédisant 20 % de survie pour 2 h. De plus, la figure 5h indique que pour 1 h d'irradiation, le taux de survie diminue de 73 % à 58 % quand la densité de puissance optique augmente de 12,5 à 50 mW/cm², confirmant la fonctionnalité des NP irradiées NIR comme déclencheur photothermique dans la destruction des cellules cancéreuses.

L'incertitude sur le mode d'action photothermique (intra- ou extracellulaire) a été levée en préparant les fNP, effectuant les mêmes lavages et incubations, et observant la présence intracellulaire des fNP. La figure 6 illustre les images confocales BF (b, e) et fluorescence (a, d) et leurs composites superposés (c, f) des cellules incubées avec et sans fNP. Évidemment, les cellules sans fNP (témoin) présentent une fluorescence verte négligeable (autofluorescence cellulaire), en net contraste avec l'échantillon expérimental où la fluorescence verte est omniprésente dans tout le cytoplasme. Les intensités moyennes de fluorescence ont été quantifiées et présentées dans l'histogramme (figure 6g) : la fluorescence des fNP ayant subi l'endocytose est au moins neuf fois plus forte que le témoin.

Discussion

Le concept d'hyperthermie thérapeutique par ondes électromagnétiques pour guérir le cancer remonte au début des années 1900, avec des succès sur certaines tumeurs, mais a décliné en raison de l'utilité des agents antibactériens inducteurs de fièvre et du manque d'accessibilité précise aux tumeurs locales in situ. Ce n'est qu'aux années 1980 que l'intérêt a été ravivé par des études in vitro découvrant de nombreux aspects des changements métaboliques, de l'altération de la microcirculation tumorale et de l'acidolyse après hyperthermie, produisant des effets létaux sur les cellules cancéreuses. Mécanistiquement, outre la cytotoxicité directe (nécrose avec apoptose décroissante à > 42 °C), le débit sanguin réduit, la capacité de refroidissement moindre et le pH bas (< 6,8) rendent les cellules cancéreuses plus sensibles au chauffage et augmentent le taux de destruction cellulaire. Cependant, cliniquement, en raison du défaut centenaire de localisation imprécise et non spécifique, l'hyperthermie n'a trouvé une efficacité thérapeutique accrue que combinée à la chimiothérapie ou radiothérapie.

Les matériaux NP permettant un ciblage et un suivi précis, avec une large gamme de propriétés physiques (charge de surface, fluorescence, conversion photothermique), s'intègrent parfaitement dans cette niche d'imprécision de l'hyperthermie. Cependant, malgré l'utilité prouvée de nombreux matériaux NP irradiés NIR dans les études sur cellules cancéreuses, la limite de sécurité d'exposition photo est souvent mal examinée, comme pour les NP CsWO₃. Bien que les NP CsWO₃ aient une cytotoxicité relativement faible à 1,5 mg/ml (figure 4b) comparée à des NP populaires comme Ag, Au, graphène (seuils ~1 μg/ml), elles nécessitent encore 0,7 W/cm² pour détruire efficacement les cellules HeLa malgré leur forte absorption NIR (800-2400 nm).

Cette étude vise à concevoir une formule de dosage thermique efficace déclenchée par irradiation NIR, basée sur les NP Cs_0.33WO₃, pour les cellules cancéreuses HepG2 in vitro, en fonction de la concentration NP, durée d'irradiation et densité de puissance optique bien dans la limite d'exposition cutanée NIR.

L'expérience commence par la synthèse des NP (figure 1) : procédure étape par étape incluant réaction redox, recuit et broyage humide. La réaction redox incorpore de grands éléments ternaires (Cs) dans les anneaux de structure octaédrique de WO₆ dans un environnement physique approprié, permettant la formation d'une structure cristalline particulière et l'incorporation d'électrons libres dans le composé moléculaire métallique, raison intrinsèque de la forte conversion photothermique sous absorption NIR. Le recuit et le broyage humide affinent la formation cristalline et réduisent la taille particulaire, améliorant davantage la conversion photothermique NIR. La solution NP synthétisée a subi une série de caractérisations physiques et matérielles vérifiant une taille moyenne de 120 nm (optimisation critique de l'absorption NIR) et authentifiant la composition atomique (figure 2). Les mesures de potentiel zêta pour 0,5, 1, 1,5 mg/ml sont -53,2, -54,3, -60,1 mV. Généralement, l'endocytose est la voie d'entrée principale pour la plupart des NP, et le taux d'absorption des NP cationiques et ioniques pour les cellules non phagocytaires est plus élevé que pour les entités neutres. De nombreux rapports trouvent les NP chargées négativement moins toxiques pour les cellules non phagocytaires, un atout bénéfique pour une accumulation intracellulaire excessive de NP pour la dose photothermique avec faible toxicité.

Pour préparer l'essai photothermique sur cellules HepG2, la robustesse des NP comme chauffage photothermique, sa stabilité à long terme à température saturée en équilibre avec l'environnement sur une heure et la répétabilité sur 5 cycles consécutifs en 3 h ont été démontrées (figures 3b, c). Pour quantifier l'efficacité de l'hyperthermie NP per se en éliminant l'influence de la température ambiante (nominalement 25 °C), un étalonnage de l'appareil a été fait en réglant la plaque chauffante à 37 °C, sur laquelle tous les essais cellulaires ont été réalisés, et les caractéristiques photothermiques temporelles du milieu pur et du milieu incorporant NP sont restées à 37,1 °C (figure 3d). La dépendance de la cytotoxicité à la durée d'irradiation et à la concentration NP a été examinée séparément (figure 4) : < 5 % de destruction cellulaire pour > 2 h d'irradiation NIR et 1,5 mg/ml comme point pivot vers la concentration létale. En fixant la concentration NP à 1,5 mg/ml (utilisée pour le reste de l'essai photothermique), la dose thermique pour l'hyperthermie médicale a été définie comme fonction de la durée variable et de la densité de puissance optique. La figure 5 illustre l'action de destruction cellulaire à faible (a-c) et fort (d-f) grossissement pour irradiation NIR 0 h, 1 h, 2 h, le nombre réduit de cellules reflétant l'analyse quantitative du taux de survie (g), la ligne de tendance linéaire prédisant 80 % de mort cellulaire pour 2 h. La diminution du taux de survie avec l'augmentation de la densité de puissance est aussi démontrée (h). Enfin, comme le montrent clairement les images BF, fluorescence et composites superposés (figure 6), avec l'histogramme d'analyse de fluorescence, l'endocytose des fNP a été vérifiée.

Conclusion

En résumé, cette étude présente la synthèse et la caractérisation des NP Cs_0.33WO₃, examine in vitro les essais de cytotoxicité de l'interaction directe des NP et, séparément, avec irradiation NIR, et prouve l'endocytose des NP ainsi que l'efficacité des NP irradiées NIR sur la destruction des cellules cancéreuses HepG2. De plus, cette étude suggère une dose combinée de solution NP Cs_0.33WO₃ irradiée NIR pour les cellules cancéreuses HepG2 : 1,5 mg/ml de concentration NP, durée d'irradiation entre 30 min et 1 h, et densités de puissance optique NIR sous 50 mW/cm², bien en dessous de la limite de sécurité d'exposition NIR pour la peau, tout en permettant un taux de mortalité cancéreuse proche de 40 %, potentiellement applicable au développement de médecine personnalisée et patient-friendly. De telles études en milieu clinique nécessiteront des mesures supplémentaires comme la modification de surface avec des molécules reconnaissant les récepteurs de surface de types spécifiques de cellules cancéreuses.