Conception d'une dose d'hyperthermie de nanoparticules de Cs0.33WO3 irradiées dans le NIR pour les cellules de cancer hépatique HepG2

Introduction

À l'échelle mondiale, au cours de l'année 2018, des maladies cancéreuses féroces ont fait environ 10 millions de morts et ont ajouté environ 18 millions de nouveaux cas [1]. Jusqu'à présent, bien que la chimiothérapie, la radiothérapie, l'ablation chirurgicale ou l'association sur mesure de ces trois éléments contribuent à une amélioration du taux de survie à 5 ans légèrement supérieure à 40 % des patients cancéreux traités [2, 3], la nature toxique et délétère des produits chimiques et ioniques bombardement provoque inévitablement de nombreux effets secondaires comme la perte de cheveux, la cardiotoxicité, l'infertilité, les anomalies chromosomiques et bien d'autres [4, 5]. De telles conséquences fatales ont fortement encouragé le développement d'une médecine thérapeutique adaptée aux patients, y compris des composés incorporés aux NP.

La nanotechnologie basée sur un système matériel, des structures, une forme et une stoechiométrie atomique particuliers à une échelle de taille inférieure à 100 nm donne des propriétés chimiques, physiques et biochimiques sans précédent renforcées par les phénomènes de quantification et a déjà trouvé des applications précliniques et in vitro dans de nombreuses branches de sciences biomédicales [6, 7]. Malgré les inconvénients de la chimiothérapie, les NP servant de vecteurs d'administration améliorent la sélectivité de la libération du médicament dans la tumeur malade, facilitent l'absorption du médicament par les cellules tumorales et réduisent considérablement la toxicité cumulative dans les tissus sains [8, 9]. En outre, la qualité d'image produite par un éventail de modalités d'imagerie basées sur la NP est grandement améliorée avec une sensibilité plus élevée, une résolution spatiale plus fine et une meilleure pénétration en profondeur pour révéler la biodistribution, surveiller l'absorption de médicaments, localiser la tumeur et évaluer l'efficacité du traitement [10]. En plus de la fonction de diagnostic, les NP, lorsqu'elles sont exploitées avec des propriétés physiques inhérentes, telles que l'ablation par radiofréquence (RF) ou l'hyperthermie rendue photothermique, peuvent en outre induire des dommages à l'emplacement souhaité avec une efficacité améliorée [11,12,13], dont le second est généralement préférable à son dosage spécifique au site, son degré de douleur plus faible, ses effets secondaires faibles et son risque de brûlure des tissus très réduit.

Jusqu'à présent, les systèmes de matériaux NP capables d'induire une hyperthermie lors d'une photo-irradiation comprennent l'or (Au), le tungstate de césium (CsWO₃ ), oxyde de fer, sulfure de cuivre, graphène et tube de carbone et a démontré l'applicabilité d'imposer des dommages létaux aux cellules cancéreuses en augmentant la température extracellulaire ou intracellulaire in situ [14,15,16,17,18]. Comme pour l'ablation RF améliorée par NP, le niveau de densité de puissance incidente des sources photoniques est un problème critique pour la sécurité clinique et le confort du patient [11], et il est manifeste que la limite d'exposition maximale pour la peau humaine dans la plage de VIS et La longueur d'onde NIR comprise entre 400 et 980 nm est de 0,2 à 0,726 W/cm ² selon la Commission internationale de protection contre les rayonnements non ionisants (ICNIRP) publiée en 2013 [19]. Néanmoins, la plupart des densités de puissance optique rapportées lors des précédentes études in vitro sur les cellules cancéreuses dépassaient largement la limite de sécurité pour les tissus cutanés, ce qui peut être grave lorsqu'il s'agit de traiter des tissus biologiques internes avec un faible seuil de photo-irradiation pour vulnérabilité. Par exemple, la densité de puissance optique NIR des nanoparticules d'or (Au) qui a démontré une destruction efficace des cellules cancéreuses varie de 2 à 80 W/cm ² lorsqu'il est irradié pendant pas plus de 10 min (min) [13, 14, 20,21,22]. De même, un assortiment d'autres systèmes matériels comme les oxydes de graphène [18], le fer-platine (FePt) [23] et NaYF₄ :Yb,Er les nanocristaux [24] nécessitaient pas moins de 150 mW/cm ² pour un déploiement instrumental.

Étant un matériau relativement moins exploré pour les expériences in vitro, quelques études ont signalé l'annihilation des cellules cancéreuses du col de l'utérus (Hela) par le CsWO₃ irradié dans le NIR. NP avec au moins 0,72 W/cm ² [15, 25, 26] qui se situe au voisinage de la limite d'exposition des tissus cutanés à la longueur d'onde NIR fixée par l'ICNRP et peut provoquer des effets délétères pour les tissus sains lors d'une durée d'exposition prolongée [19]. De plus, la température des milieux de culture engendrée par la combinaison de la dose de traitement de la concentration de NP, de la durée de la photo-exposition et de l'intensité optique, dans les études précédentes, était bien supérieure à 40 °C, ce qui est intolérable pour les cellules humaines saines, et les taux de mortalité des cellules cancéreuses n'ont pas été délimitées avec beaucoup de détails.

CsWO₃ Le NP est exceptionnellement absorbant dans la gamme de longueurs d'onde NIR de 800 nm à 2400 nm [27] et convient fonctionnellement aux applications biomédicales. Malgré ses efficacités exceptionnelles démontrées dans l'élimination des cellules cancéreuses, la cytotoxicité est encore largement inconnue et la fourniture d'une formule de dosage de concentration en NP de faible cytotoxicité, de courte durée d'irradiation et de densité de puissance optique dans la limite de la photo-exposition de sécurité pour le tissu cutané est manque encore.

La présente étude de recherche tente d'évaluer in vitro la faisabilité de l'annihilation des cellules cancéreuses hépatiques HepG2 cultivées dans une boîte de Pétri d'un diamètre de 5,2 cm en utilisant une concentration de NP non cytotoxique et une densité de puissance optique bien dans la limite de photo-exposition du tissu cutané tout en maintenant la température des milieux de culture cellulaire à la température normale du corps humain de 36,5 °C. En détail, Cs_0.33 WO₃ Les NP avec une taille de caractéristique moyenne centrée autour de 120 nm ont été synthétisées à l'aide d'une séquence de processus redox, de recuit thermique et de broyage humide, et caractérisées par sa morphologie de surface, sa cristallinité et ses propriétés optiques et temporellement photothermiques. De plus, les effets photothermiques des paramètres de dose variables, de la durée d'irradiation, de la concentration des NP et de la densité de puissance optique de l'irradiation NIR fonctionnant à la longueur d'onde centrale de 980 nm, sur le taux de survie des cellules cancéreuses HepG2, ont été examinés et jugés comme concevoir une combinaison de dose de traitement de sécurité.

Méthodes

Dans cette recherche, la 102e génération de lignée cellulaire de cancer hépatique HepG2 dérivée d'une tumeur primaire humaine a été cultivée comme modèle expérimental pour évaluer la cytotoxicité imposée par le Cs fait maison irradié dans le NIR_0,33 WO₃ NPs et évaluer les efficacités thérapeutiques de diverses doses thermiques bien dans la limite de sécurité pour l'exposition des tissus cutanés et à une concentration de NP non toxique.

Synthèse de Cs _0.33 WO ₃ IP

Le panneau de gauche de la figure 1 illustre l'organigramme schématique de la procédure de synthèse de l'oxyde de tungstène de césium (Cs_0.33 WO₃ ) matériau NP. En bref, les précurseurs chimiques ((NH₄ )₂ WO₄ ) (Alfa Aesar, pureté 99,9%) et CsCl (Alfa Aesar, pureté 99,9%) ont été dissous séparément dans 100 ml d'eau DI puis mélangés ensemble à 25 °C sous une agitation constante à 250 tours par minute (tr/min) en utilisant un essoreuse à commande magnétique pendant une heure (heure). Une fois l'agitation terminée, la température du bécher contenant la solution de mélange a été ajustée à 180 °C et cuite jusqu'à ce que la teneur en eau de la solution soit complètement évaporée. La poudre blanche séchée résultante était le précurseur final de Cs_0.33 Matériau WO3. Avec le refroidisseur allumé, la nacelle de quartz contenant de la poudre précurseur a été chargée au centre d'un tube de four à haute température, et la pression à l'intérieur du tube de four a été portée à 0,08 torr. Ensuite, le précurseur est chauffé à une température de 500 °C parallèlement à l'introduction d'un afflux d'une combinaison de gaz, H₂ et N₂ , dans un rapport de 90 à 10 centimètre cube standard par minute (SCCM) pour faciliter la réaction redox. Après 1 h, l'entrée de H₂ le gaz est coupé, le débit de N₂ le gaz est ajusté à 100 SCCM, et la température du four est augmentée à 800 °C pour un recuit thermique pendant une heure. Une fois les processus terminés, le refroidisseur et le four à température contrôlée ont été éteints et la nacelle en quartz a été refroidie jusqu'à ce qu'elle atteigne la température ambiante et ait été retirée du tube du four. La poudre bleu foncé résultante obtenue à partir du bateau de quartz est de la taille du micron (µ) Cs_0,33 WO₃ poudre. Pour réduire davantage la taille des granulés de poudre, 150 g d'une solution de mélange composée de 15 g de µpoudre, 3,8 g d'un agent dispersant à base de copolymère pour empêcher l'agrégation des particules, 10 μl d'agent anti-mousse et DI de l'eau a été préparée, versée dans un bol à échantillon qui contenait 600 g de billes de zircone et a été montée dans la chambre d'un équipement de nanobroyeur (Justnanotech Co., Taiwan). Avec la vitesse et la température réglées à 2400 tours par minute (RPM) et 15 °C, les NP sont produites en broyant la µpoudre avec 0,1 mm de ZrO₂ billes pendant 4 h, et avec 0,05 mm de ZrO₂ perles pendant encore 4 h. La durée totale de chaque processus de broyage ne dépasse pas 4 h pour éviter une viscosité excessive du fluide ainsi que tout changement erratique des tailles physiques du matériau. La solution finale après le processus de broyage a été tamisée à travers un filtre à pores de 0,22 µm pour toutes les caractérisations et expériences ultérieures. La version fluorescente de Cs_0.33 WO₃ NPs (fNPs) a été faite en utilisant le protocole suivant. Une solution composée de 2 ml de fluorescéine à la concentration de 28 mg/ml et 2 ml de Cs_0.33 WO₃ Une solution de NP à 1,5 mg/ml a été préparée dans un bécher et placée dans le bol d'un agitateur à ultrasons pendant 15 min. Par la suite, la solution de NP et le dispersant ont été mélangés dans un rapport de 1:1,25 et ont subi une agitation par ultrasons pendant 15 min. La solution résultante a ensuite été lavée avec D.I. eau et centrifugé à 10 000 tr/min pendant 15 min. et répété deux fois avant toute utilisation.

Illustration schématique des procédures expérimentales pour la synthèse matérielle, l'incubation cellulaire avec des NP et le dosage photothermique sur les cellules cancéreuses. BCL, TEn et PD sont l'abréviation de lentille biconcave, enceinte thermique et boîte de Pétri, respectivement ; la flèche rouge indique l'emplacement pour la mesure du profil du faisceau

Caractérisation des matériaux

Ensuite, la caractérisation de Cs_0.33 WO₃ Les NP, y compris la taille des caractéristiques statistiques des NP, la structure cristalline, la morphologie structurelle, la forme du contour, la photo-absorbance VIS-NIR ont été réalisées à l'aide de l'analyse du potentiel zêta (ZS90, Malvern, Royaume-Uni), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Allemagne), SEM (SU-5000, Hitachi, Japon) en association avec la spectrométrie à dispersion d'énergie (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Japon), la diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, États-Unis) , spectromètre UV-VIS-NIR (V-750, Jasco, Japon), respectivement. Les spectres XRD ont été acquis en balayant les rayons X sur les échantillons dans une plage angulaire de 20° à 80° à la vitesse de balayage de 4° par minute. Le signal de diffraction dépendant de l'angle de balayage de l'échantillon a été déterminé et comparé au spectre XRD standard de Cs_0,32 WO₃ du Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) carte n° 83-1334. Pour confirmer la dépendance temporelle de la propriété photothermique du NP, un appareil expérimental simple composé d'un laser NIR de longueur d'onde de 980 nm et d'une sonde de mesure de température a été mis en place pour sonder l'état de température engendré par la solution irradiée dans le NIR. Les solutions d'examen incluent le D.I. solution de NPs diluée dans l'eau et le mélange de solution de NPs dans des milieux de culture cellulaire. Le diamètre du faisceau optique pour les échantillons dans les boîtes de Pétri a été élargi pour couvrir toute la surface de la boîte de Pétri, produisant 0,05 W/cm ² dans la densité de puissance optique estimée, sinon resté intact à 2 W/cm ² . Une configuration optique illustrée sur le panneau de droite de la figure 1 est utilisée pour effectuer une irradiation NIR. Au cœur du système optique se trouve un faisceau laser NIR dirigé vers une lentille biconcave qui élargit le diamètre du faisceau de 4 mm à 5,2 cm, soit l'équivalent du diamètre de surface d'une boîte de Pétri placée sur une plaque chauffante réglée à 36,8 ° C, qui est une température physiologique pour la croissance cellulaire; De plus, la boîte de Pétri est entourée d'une enceinte cylindrique en plastique pour aider à équilibrer la température de l'environnement ambiant et du milieu. Fichier supplémentaire 1 :La figure S1 illustre la cartographie de l'intensité optique du faisceau laser NIR mesurée à la sortie de l'ouverture du faisceau qui est indiquée par une flèche rouge à côté du faisceau laser sur la figure 1. Le profil du faisceau présente la distribution 3D de l'intensité optique et vérifie l'uniformité du champ lumineux sur toute l'ouverture de la boîte de Pétri.

Cytotoxicité et dosages photothermiques

Pour débuter les cycles de culture cellulaire, 500 ml de solution de milieu composée de 440 ml de mélange nutritif de Ham F-12 et de milieu essentiel Eagle modifié de Dulbecco (HDMEM), 50 ml de sérum bovin foetal (FBS), 5 ml de L-glutamine et 5 ml de P/S (Pénicilline-Streptomycine), qui a été stérilisé par un filtre à mailles avec une taille de pores de 0,22 μm, a été préparé. Les boîtes de Pétri contenant des cellules, de 10 cm ou 5,2 cm de diamètre, remplies de manière correspondante de 8 ml et 2 ml du milieu ont été utilisées pour la culture primaire et la sous-culture et incubées dans un incubateur conditionné avec 5% de CO_{2 et à la température de 37 °C. L'observation de la croissance cellulaire et un renouvellement du milieu de culture ont été effectués une fois tous les deux jours.}

Pour obtenir les taux de survie pour les cas de tests cellulaires qui incluent (1) un contrôle sans apport externe, (2) une irradiation NIR unique, (3) une incubation avec des NP et (4) une incubation avec des NP parallèlement à une irradiation NIR consécutive, le milieu de culture dans la boîte de culture a été aspiré et 0,4 ml de trypsine est ajouté à la boîte de culture et placé dans l'incubateur pendant environ 10 min. Une fois que le détachement des cellules des parois de la boîte est confirmé, 10 μl du milieu contenant les cellules ont été prélevés de la boîte de culture et ajoutés à 10 μl de solution de bleu trypan dans un tube de microcentrifugation, et une élimination des NP flottantes restantes a été effectuée à travers plusieurs temps de lavage avec une solution tampon phosphate (PBS). Ensuite, le comptage des cellules a été effectué en remplissant une plaque de comptage avec 10 ul de la solution de cellules colorées à travers un trou d'injection, et les cellules peuvent être observées au plan focal d'un stéréomicroscope et comptées par un compteur manuel ; chaque point de données présenté dans tous les chiffres concernant le taux de survie cellulaire était une moyenne de trois essais expérimentaux (N = 3) plus la marge de l'écart type.

Pour se préparer à l'évaluation de la cytotoxicité de la NP et de ses effets photothermiques sur le taux de survie cellulaire, le milieu dans la boîte de 5,2 cm a été retiré, rempli de nouveau avec la quantité appropriée de solution de NP dans le nouveau milieu pour faire un tableau de concentration de test, 2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml et 0,5 mg/ml, puis incubés pendant un jour avant l'expérience.

Avant le test photothermique, l'évaluation de la cytotoxicité a été effectuée pour examiner la réponse des cellules à une matrice de concentration de NP et a été effectuée comme suit. Le milieu contenant les cellules et les NP a été sorti de l'incubateur et aspiré. Un millilitre de PBS préchauffé a été utilisé pour laver les cellules cancéreuses et aspirer les restes flottants de CsWO₃ NPs n'ayant pas subi d'endocytose, dont la procédure est répétée plusieurs fois pour s'assurer que toute mortalité cellulaire potentielle n'est pas causée par l'élévation de température induite par les NP dans le nouveau milieu. Après le traitement photothermique, la procédure de comptage a ensuite été mise en œuvre pour la cytotoxicité et le dosage photothermique sur les cellules.

Résultats

L'absorbance optique et les propriétés photothermiques de Cs_0.33 WO₃ les nanomatériaux dépendent fortement de la structure cristalline, de la température de post-recuit, de la stoechiométrie atomique et de la taille des particules [28, 29].

Caractériser la morphologie de surface du Cs_0.33 WO₃ µpoudre, des images SEM avec un grossissement de 10 000X ont été acquises pour la confirmation visuelle de la structure emblématique de l'hexagone colonnaire indiquée par une flèche rouge sur la figure 2a. De plus, les images MET présentent la forme du contour et la taille des caractéristiques du granule de poudre de µ sur la figure 2b, où sa taille de caractéristique est d'environ 1 μm ou moins. La géométrie en forme de tige des NP et l'histogramme de distribution DLS de la taille des caractéristiques à l'échelle nanométrique centrée autour de 120 nm ont également été vérifiés et sont présentés sur la figure 2c et l'image MET correspondante. De plus, la caractérisation cristalline de la µpoudre et des NP avec XRD est présentée dans la Fig. 2d. Comme on peut l'observer à partir du spectre XRD de la poudre sur le panneau supérieur, les plans emblématiques de cristallisation le long de (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220 ), (222), (204), (400) et (224) coïncident bien avec le spectre standard de Cs_0.32 WO₃ du Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) carte n° 83-1334. Lorsque la taille des caractéristiques de la poudre µ diminue jusqu'à 120 nm, les intensités de tous les pics de diffraction sont réduites de manière monotone, et certains pics caractéristiques indiquant une forte absorption NIR, tels que les plans (102) et (220), sont éclipsés de manière invisible dans le spectre. De même, l'identification des constituants atomiques, le césium (Cs), le tungstène (W) et l'oxygène (O), illustrés à la Fig. 2e, non seulement confirme sa présence atomique, mais authentifie également le rapport des pourcentages atomiques de Cs à W, 0,315 , ressemblant étroitement à la stoechiométrie initialement conçue.

Caractérisation physique et matérielle. un SEM et b Images MET de la µpoudre, c Histogramme de distribution DLS de la taille de l'entité NP, d Spectres XRD de µpoudre et 120 nm NPs, et e Le spectre EDS avec le pourcentage de composition atomique est présenté. Les barres d'échelle dans a , b , c sont respectivement de 1,5 μm, 200 nm et 100 nm

Au sommet de la caractérisation des matériaux, les spectres d'absorbance optique des NP et la modulation photothermique de la température au cours du temps ont été mesurés et sont présentés sur la figure 3. En (a, b), la dépendance de l'absorbance NIR et les profils d'élévation de température induits par NIR - une solution de NP irradiée en fonction de la concentration de NP est représentée, où le tracé de la température au cours du temps de 1 mg/ml, par exemple, dépasse 40 °C, et reste stable pendant au moins 1 h confirmant la stabilité photothermique et la durabilité des matériaux . De même, le profil de température au cours du temps de la figure 3c illustre 5 cycles répétitifs en 190 min, vérifiant la réactivité photothermique du matériau NP. Sur la Fig. 3d, les profils de température temporels du milieu de culture et du milieu de culture NP-incorporé, sortis de l'incubateur, placés sur la plaque chauffante et soumis à une irradiation NIR, se stabilisent à environ 37 °C en 10 min, et la température de la solution de NP pure irradiée dans le NIR passe de 24,6 °C à 33,6 °C après 10 min. Ainsi, compte tenu de la fonctionnalité photothermique de la NP, l'irradiation NIR pour l'expérience suivante a été menée pendant 10 min, 30 min et 60 min, maintenant la robustesse des NP pendant la session expérimentale et étant potentiellement applicable aux études précliniques.

Propriétés optiques et photothermiques. un Spectres d'absorbance optique et profils de température d'évolution dans le temps de la solution de NP irradiée dans le NIR dans b , c une cuvette et en d une boîte de Pétri sont représentées. Ex symbolise les profils des cas à faisceau élargi; Concentration de NP de 1,5 mg/ml et densité de puissance optique de 50 mW/cm ² ont été utilisés dans (d ); la durée d'irradiation NIR par cycle en c est de 15 minutes

Par la suite, la dose non toxique de paramètres expérimentaux comprenant la durée d'irradiation NIR et la concentration de NP a été déterminée en irradiant les cellules pendant 1 h et 2 h à 50 mW/cm ² et par interaction directe avec les NP de concentration de 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml et 2 mg/ml, qui sont représentés sur les figures 4a, b, respectivement. Le taux de survie cellulaire reste bien supérieur à 95 % au cours de 2 h d'irradiation NIR, confirmant la non-toxicité des cellules pour une exposition à long terme au photon de 980 nm, ainsi que la concentration de NP non toxique inférieure à 1,5 mg /ml a été déterminé.

Dosage de cytotoxicité des paramètres expérimentaux. Le taux de survie des cellules HepG2 lorsqu'elles sont dosées avec a la durée de l'irradiation NIR, b Des NP à 120 nm de différentes concentrations sont présentées. La durée d'incubation des NP était d'un jour; l'écart type de trois essais expérimentaux (N = 3) pour chaque point de données est indiqué

Le but du dosage des cellules cancéreuses à 1,5 mg/ml ou moins, qui n'a pratiquement aucun effet nocif sur les cellules HepG2, est d'examiner les effets de la dose photothermique sur les cellules cancéreuses sans l'implication de la toxicité inhérente de la NP. Pour examiner si les NP irradiées dans le NIR peuvent être une solution viable pour éliminer les cellules cancéreuses, les cellules ont été incubées avec des NP à 1,5 mg/ml pendant une journée, puis soumises au rayonnement NIR pendant 1 h. Comme on peut le voir sur les images optiques à fond clair (BF) de la Fig. 5d–f, le nombre de cellules est clairement réduit lorsque le temps d'exposition dure 1 h (e) ou 2 h (f). Quantitativement, le taux de survie diminue de façon monotone de 84,2 % à 58,4 % à mesure que la durée d'irradiation augmente de 10 min. à 1 h, et une ligne tendance linéaire s'intègre bien parmi les points de données dispersés, ce qui prédit 20 % du taux de survie lorsque l'irradiation dure 2 h. De plus, la Fig. 5h indique que pour 1 h d'irradiation, le taux de survie diminue de 73 à 58 % lorsque la densité de puissance optique augmente de 12,5 à 50 mW/cm ² , en vérifiant la fonctionnalité des NP irradiées dans le NIR en tant que déclencheur photothermique dans la destruction des cellules cancéreuses.

Dosage photothermique. Le taux de survie des cellules HepG2 lorsqu'elles sont dosées avec la concentration de NP de 1,5 mg/ml avec l'irradiation NIR. Les barres d'échelle respectives sur le a –c haut et d –f les rangées inférieures des images optiques BF sont de 200 μm et 100 μm. L'écart type de trois essais expérimentaux (N = 3) pour chaque point de données est indiqué

En outre, l'incertitude quant à savoir si une telle action photothermique se produisait de manière intracellulaire ou extracellulaire a été résolue en préparant les fNP, en effectuant la même procédure de lavage et d'incubation et en observant toute présence intracellulaire des fNP. La figure 6 illustre des images confocales BF (b, e) et de fluorescence (a, d) et leurs composites superposés (c, f) des cellules incubées avec et sans les fNP. De toute évidence, les cellules sans incubation de fNP comme contrôle présentent une fluorescence verte négligeable, qui est principalement attribuée à l'autofluorescence cellulaire, contrastant fortement avec l'expérimentation où la distribution de la fluorescence verte est omniprésente dans tout le cytoplasme trouvé dans l'image. Les intensités moyennes de fluorescence dans les images des échantillons témoins et expérimentaux ont également été quantifiées et sont présentées dans l'histogramme de la figure 6g où la fluorescence des fNP ayant subi une endocytose est au moins neuf fois plus forte que le contrôle.

Images confocales optiques. Le a , d fluorescence, b , e BF et c , f des images optiques composites des cellules HepG2 incubées avec et sans les fNP, en tant que groupes expérimentaux et témoins correspondants, sont présentées dans le a –c haut et d –f rangées du bas à côté de g un histogramme des intensités moyennes de fluorescence. Les barres d'échelle représentent 20 μm ; la longueur d'onde d'excitation laser est de 488 nm

Discussion

Le concept d'hyperthermie thérapeutique utilisant des ondes électromagnétiques pour guérir les maladies cancéreuses remonte au début des années 1900 et a réussi à faire reculer certaines formes de malignités, mais a cependant diminué en raison de l'utilité des agents antibactériens induisant la fièvre et du manque de précision l'accessibilité à la tumeur locale d'intérêts in situ [30]. Ce n'est que dans les années 1980 que l'intérêt a été relancé avec plusieurs études in vitro qui ont découvert de nombreux aspects des changements métaboliques, l'altération de la microcirculation tumorale et l'acidolyse après un traitement d'hyperthermie produisant des effets létaux sur les cellules cancéreuses [31]. D'un point de vue mécanique, outre la cytotoxicité directe dans laquelle les cellules cancéreuses subissent une nécrose avec une apoptose décroissante lorsque la température appliquée est> 42 °C, le débit sanguin réduit associé à une capacité de refroidissement plus faible et à un pH bas (< 6,8) rend les cellules cancéreuses plus sensibles à chauffage et par conséquent, un taux de destruction cellulaire plus élevé [32, 33]. Cependant, cliniquement, en raison de l'inconvénient centenaire d'une localisation non spécifique imprécise, l'hyperthermie n'a trouvé une efficacité thérapeutique accrue que lorsqu'elle est appliquée en même temps que la chimiothérapie ou la radiothérapie [34, 35].

Les matériaux à base de NP qui permettent un ciblage et une surveillance précis, et ont un large éventail de propriétés physiques telles que la charge de surface, la fluorescence, la conversion photothermique, s'intègrent parfaitement dans le créneau d'une telle imprécision dans les applications d'hyperthermie. Cependant, malgré l'utilité prouvée de nombreux matériaux NP irradiés dans le NIR dans les études sur les cellules cancéreuses, la limite de sécurité de la photo-exposition n'est souvent pas bien examinée comme dans le cas du CsWO₃ NPs. CsWO₃ Les NP, cependant, comme le montre la figure 4b, ont une cytotoxicité relativement faible à 1,5 mg/ml par rapport à une poignée de matériaux NP populaires, tels que Ag, Au, graphène, dont les seuils se situent sur l'échelle de 1 μg/ml [ 18, 36, 37], nécessite toujours 0,7 W/cm ² pour une destruction efficace des cellules Hela malgré sa forte absorption NIR dans la gamme de longueurs d'onde de 800 nm à 2400 nm [15, 25, 26].

Cette étude de recherche vise à concevoir un efficace déclenché par irradiation NIR, Cs_0.33 WO₃ Formule de dosage thermique à base de NP pour les cellules cancéreuses HepG2 in vitro en fonction de la concentration de NP, de la durée d'irradiation et de la densité de puissance optique bien dans la limite d'exposition NIR pour les tissus cutanés.

L'expérience commence par la synthèse des NP, où une procédure de synthèse étape par étape comprenant une réaction redox, un processus de recuit et une méthode de broyage humide est décrite sur la figure 1. La réaction redox incorpore de grands éléments ternaires, Cs dans ce cas, dans anneaux de structure octaédrique de WO₆ dans un environnement physique approprié, permettant la formation d'une structure cristalline particulière et l'incorporation d'électrons libres dans le composé moléculaire métallique, ce qui est la raison intrinsèque d'une forte conversion photothermique lors de l'absorption NIR [26, 27]. En outre, les processus de recuit et de broyage humide qui ont suivi ont permis d'affiner la formation cristalline et de réduire la taille des particules, ce qui améliore encore la conversion photothermique NIR. Ensuite, la solution de NP synthétisée a procédé à une série de caractérisations physiques et matérielles qui vérifient une taille de caractéristique moyenne de 120 nm, une optimisation critique de l'absorption NIR et authentifie la composition atomique (Fig. 2). De plus, la mesure correspondante du potentiel zêta pour 0,5 mg/ml, 1 mg/ml et 1,5 mg/ml est de - 53,2 mV, - 54,3 mV, - 60,1 mV. Généralement, le processus d'endocytose est la principale voie d'entrée pour la plupart des types de NP, et le taux d'absorption des NP cationiques et ioniques pour les cellules non phagocytaires est supérieur à celui des entités neutres, bien que les premières fonctionnent mieux que les dernières [38]. En outre, de nombreux rapports antérieurs ont trouvé des NP chargées négativement moins toxiques pour les cellules non phagocytaires [39, 40], ce qui est un avantage lorsqu'une accumulation intracellulaire excessive de NP pour une dose photothermique accompagnée d'une faible toxicité est considérée.

To set up a tone for the photothermal assay upon the HepG2 cells, the assessment of the NPs' robustness as a photothermal heater, its long-term stability at saturated temperature in equilibrium with the ambient environment over an hour and the repeatability for 5 consecutive cycles within 3 h were demonstrated (Fig. 3b, c). Also, to quantify the effectiveness of the NP's hyperthermia per se in dosing the cancer cells by ruling out the influence of ambient temperature (nominally at 25 °C), a calibration of the experimental apparatus was implemented by setting a hotplate to 37 °C, atop which all cell assays were carried out, and the temporally photothermal characteristics of the pure culture medium and NP-incorporated culture medium remained at 37.1 °C (Fig. 3d). Thereafter, the dependence of cytotoxicity on the duration of irradiation and NP concentration was examined separately and is presented in Fig. 4 indicating less than 5% of cell killing for over 2 h of NIR-irradiation and 1.5 mg/ml as the pivotal point toward lethal concentration. By fixing the NP concentration at 1.5 mg/ml, which was used throughout the rest of photothermal assay, the thermal dose for medical hyperthermia was defined as functions of variable dosing duration and optical power density. Figure 5 illustrates the action of cell killing with low (a–c) and high (d–f) magnification when NIR-irradiation for 0 h, 1 h and 2 h was implemented, the seemingly reduced number in the cells reflects well the quantitative analysis of cell survival rate as shown in (g), and the linear trend line predicts 80% of cell death for 2 h of irradiation. Likewise, the decrease in cell survival rate upon the incremental optical power density is also demonstrated in (h). Lastly, as clearly depicted by the BF, fluorescence and superimposed composite images in Fig. 6, in which a histogram of fluorescence analysis was presented, the endocytosis of the fNPs was verified.

Conclusion

In summary, this study presents material synthesis and characterization of Cs_0.33 WO₃ NPs, examines in vitro cytotoxicity assays of the direct NPs interaction, and separately, with NIR irradiation, and proves the endocytosis of the NPs as well as effectiveness of the NIR-irradiated NPs upon destructing the HepG2 cancer cells. Moreover, this study suggests a combinative dose of the NIR-irradiated Cs_0.33 WO₃ NPs solution for the HepG2 cancer cells, 1.5 mg/ml of NP concentration, the duration of irradiation between 30 min. to 1 h, and optical power densities of NIR irradiation under 50 mW/cm ² which is well below the safety NIR exposure limit for skin tissue while allowing cancer cell mortality rate close to 40% and may be potentially applicable to the development of patient-friendly and personalized medicine. Such studies in a clinical setting will require additional measures like surface modification with molecules that recognize surface receptors of specific cancer cell types.

Disponibilité des données et des matériaux

All data are fully available without any restriction.

Abréviations

NP :

Nanoparticules

fNPs:

Fluorescence version of Cs_0.33 WO₃ nanoparticules

NIR :

Proche infrarouge

UV–VIS–NIR:

Ultraviolet–visible–near-infrared

REDOX:

Oxidation-reduction

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

XRD :

Diffraction des rayons X

SEM :

Microscopie électronique à balayage

EDS :

Spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie

RF :

Radiofréquence

ICNRP:

International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection

MIN:

Minutes

SCCM:

Standard cubic centimeter per minute

μ:

Micron

RPM:

Round per minute

JCPDS :

Comité mixte sur les normes de diffraction des poudres

DI :

Déionisé

BF:

Bright field