Les nanoparticules biocompatibles en tant que plate-forme pour améliorer l'efficacité antitumorale de la combinaison cisplatine-tétradrine

Introduction

Avec le développement d'une thérapie complète contre les tumeurs, les composés du platine jouent un rôle important dans le traitement de divers cancers, parmi lesquels le cisplatine (CDDP) est largement utilisé en clinique [1, 2]. De nos jours, le CDDP est toujours important lorsqu'il est associé à l'immunothérapie tumorale, montrant un effet favorable sur les tumeurs malignes telles que le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) [3]. Cependant, ces agents chimiothérapeutiques atteignent toujours une activité antitumorale au détriment d'une toxicité indésirable [4], de sorte que les agents thérapeutiques qui peuvent réduire la toxicité et améliorer l'efficacité de la chimiothérapie ont été sans cesse explorés [5, 6]. La tétradrine (Tet) est un membre de l'alcaloïde bis-benzylisoquinoléine [7], montrant un effet satisfaisant dans la sensibilisation à la chimiothérapie. Nos travaux antérieurs ont démontré que la combinaison de Tet et de CDDP a une activité anticancéreuse synergique marquée en inhibant l'expression de gènes associés à des agents chimiothérapeutiques, y compris le groupe de complémentation croisée de réparation par excision 1 (ERCC1), Thymidylate Synthase (TS), β- tubuline III, etc [8]. Cependant, l'application clinique de Tet souffre de sa faible solubilité dans l'eau et de sa faible biodisponibilité orale [7]. De plus, le CDDP hydrophile se distribue le plus facilement dans la matrice extracellulaire (ECM), tandis que le Tet hydrophobe pénètre dans les membranes lipidiques et peut être transporté à travers les cellules, de sorte que les deux médicaments ne peuvent pas vraiment fonctionner ensemble. Par conséquent, il est essentiel de trouver un moyen qui puisse administrer efficacement les deux médicaments simultanément, améliorant l'effet antinéoplasique avec des effets secondaires réduits.

Les progrès récents dans le domaine de la nanotechnologie permettent de gérer de nouvelles approches pour le diagnostic et le traitement du cancer [9, 10]. Les nanoparticules (NP) construites avec des copolymères amphiphiles, en particulier le polyéthylène glycol (PEG), sont connues pour leur capacité à réduire l'adhérence des protéines sériques et à empêcher l'absorption par le système réticulo-endothélial (RES) [11]. S'ils sont utilisés pour transporter des médicaments hydrophobes, les nanosupports augmentent la solubilité avec tact et prolongent ainsi que la résidence du médicament dans la circulation sanguine et la tumeur [12]. Avec l'utilisation clinique des NPs copolymériques, la biocompatibilité des NPs attire de plus en plus l'attention. Par exemple, des découvertes récentes ont révélé que certaines nanoparticules de dioxyde de titane, de silice et d'or injectés accélèrent l'intravasation et l'extravasation des cellules cancéreuses dans des modèles animaux [13]. Les NP préparées à partir de nanomatériaux avec une bonne biocompatibilité et sécurité, en particulier celles approuvées par la FDA, sont de meilleurs candidats pour les transporteurs de médicaments.

Au préalable, nous avons réussi à construire des NP chargées de CDDP [14, 15] et des NP chargées de Tet en utilisant du polyéthylène glycol-poly(caprolactone) (PCL-PEG) [16], dont les effets antitumoraux in vivo ont tous deux été démontrés. Dans cette étude, nous avons utilisé PEG-PCL pour la co-administration du CDDP et du Tet. Avec une charge quasi neutre, le PEG forme l'enveloppe hydrophile d'une nanoparticule, qui cache les épitopes antigéniques et empêche la réaction immunologique [14]. Les images du microscope à fluorescence ont démontré que les cellules peuvent absorber à la fois les agents hydrophiles et hydrophobes délivrés par les NP. Les résultats d'études in vitro, non seulement sur différentes lignées cellulaires tumorales, mais également sur des tissus tumoraux, ont révélé que les NP CDDP-Tet inhibent la croissance tumorale plus efficacement que les médicaments libres. Lors de recherches in vivo, une efficacité antitumorale accrue et une diminution des effets secondaires ont été observées dans le groupe NPs. De plus, ¹⁸ L'imagerie FDG-PET/CT a montré le taux de métabolisme de la tumeur le plus faible dans le groupe des NP, indiquant ainsi la capacité des NP CDDP-Tet à retarder la croissance tumorale.

Méthodes

Matériaux

Réactifs et cellules

CDDP (formule moléculaire PtCl₂ (NH₃ )₂ ) a été acheté auprès de Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Jinan Chine) [15]. Tétrandrine (formule moléculaire C₃₈ H₄₂ N₂ O₆ ) a été obtenu sous forme de poudre avec une pureté de  >   98 % auprès de Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, Chine) [16]. Méthoxypolyéthylèneglycol [MePEG; poids moléculaire moyen en poids (Mw = 4 kDa ; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China] a été déshydraté par distillation azéotropique avec du toluène, puis séché sous vide à 50 °C pendant 12 h avant utilisation. ε-caprolactone (ε-CL ; Aldrich , USA) a été purifié par séchage sur CaH₂ à température ambiante suivie d'une distillation sous pression réduite. L'alcool polyvinylique (PVA ; degré de polymérisation = 500, degré d'alcoolisation = 88% ; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., Chine) et l'octoate stanneux (formule moléculaire SnCl2) (Sigma) ont été utilisés tels que reçus. Le milieu RPMI 1640 (Gibco, États-Unis), le sérum de sang de veau (Lanzhou Minhai Bioengineering, Chine) et le bromure de diméthylthiazoly-2,5-diphényltétrazolium (MTT ; Amersco, États-Unis) ont été utilisés tels quels.

Lignée cellulaire humaine de cancer gastrique bien différencié MKN₂₈ , lignée cellulaire d'adénocarcinome colorectal humain LoVo, lignée cellulaire de cancer du col de l'utérus humain Hela et lignée cellulaire d'hépatome murin H₂₂ ont été obtenus auprès de l'Institut de biologie cellulaire de Shanghai (Shanghai, Chine). Toutes les lignées cellulaires ont été propagées dans du milieu RPMI 1640, additionné de 10 % de sérum bovin, de pénicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 g/mL), de pyruvate, de glutamine et d'insuline à 37 °C dans une atmosphère saturée d'eau avec 5% de CO₂ .

Synthèse des copolymères

Comme nous l'avons décrit précédemment [16, 17], les copolymères mPEG-PCL et HO-PCL ont été synthétisés par une copolymérisation par ouverture de cycle. En bref, une quantité prédéterminée d'a-CL a été ajoutée dans un tube de polymérisation contenant du PEG et une petite quantité d'octoate stanneux (0,1 % en poids/poids). Le tube a ensuite été connecté à un système de vide, scellé et placé dans un bain d'huile à 130 °C pendant 48 h. Pour la synthèse des copolymères HO-PCL, une quantité prédéterminée de -CL et d'octoate stanneux a été ajoutée dans un tube de polymérisation sans sec. Une fois la polymérisation terminée, les copolymères bruts ont été dissous avec du chloroforme et précipités dans une quantité en excès de méthanol froid pour éliminer le monomère et l'oligomère n'ayant pas réagi. Les précipités ont ensuite été filtrés et lavés à l'eau plusieurs fois avant d'être soigneusement séchés à pression réduite.

Préparation de nanoparticules chargées CDDP-Tet

Des quantités prédéterminées de CDDP et de nanoparticules chargées de Tet ont été préparées par la méthode de double émulsion (DE) [14, 18]. Le CDDP et le Tet ont été émulsifiés avec 1 mL de solution de dichlorométhane (DCM) contenant 5 mg de mPEG-PCL et 15 mg de HO-PCL, par sonication pendant 15 s (15 W) dans un bain de glace (solution W1). Ensuite, 4 mL de solution de PVA à 3 % (p/v) W2 ont été ajoutés et soniqués pendant 30 s pour faire une émulsion W1/O/W2. L'émulsion double a été diluée dans 50 ml de solution aqueuse de PVA à 0,3 % (p/v) et le DCM a été évaporé sous vide. Les nanoparticules obtenues ont été collectées, lavées et lyophilisées (Fig. 1).

Le schéma de préparation des NP CDDP-Tet

Contenu de chargement de médicaments et efficacité d'encapsulation

Pour déterminer la teneur en charge du médicament, la poudre lyophilisée de NP chargée de CDDP-Tet a été dissoute dans du diméthylformamide (DMF) et 30 L de cette solution ont été mélangés avec 30 L de 2 mmol/L HCL suivis de l'ajout de 2,94 mL de 0,2 mmol/L SnCl₂ solution dans 2 mmol/L HCL. L'absorbance à 403 nm a été mesurée après 1 h en référence à une courbe d'étalonnage à l'aide d'un spectrophotomètre Shimadzu UV-1205 (Kyoto, Japon). La quantité totale de médicament dans les NP pourrait alors être calculée. Le contenu de charge de médicament et l'efficacité d'encapsulation ont été, respectivement, obtenus par les équations. (1) et (2) :

Cytotoxicité in vitro des nanoparticules et étude de biocompatibilité

Études d'absorption cellulaire

Sur la base de nos travaux antérieurs [15], des cellules LoVo ont été placées sur le couvercle d'une plaque à 6 pores avec environ 5 × 10 ⁵ cellules chaque pore et ont été incubées pendant 24 h (37 °C, 5% CO₂ ). Des NP avec de la rhodamine B (21 μg/mL) ont été ajoutées dans les pores. Après incubation pendant 2 h, le pâté a été lavé avec 4 °C et 37 °C de PBS 3 à 4 fois chacun. Les cellules LoVo sur des lamelles ont ensuite été soumises au microscope à fluorescence.

Test de cytotoxicité

La cytotoxicité in vitro des médicaments a été déterminée par des tests MTT standard utilisant MKN28 et H₂₂ lignées cellulaires. Brièvement, les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 5000 cellules par puits 24 h avant le dosage. Ensuite, les cellules ont été exposées à une série de doses de CDDP libre, de Tet libre, de CDDP libre plus Tet et de nanoparticules chargées de CDDP-Tet. Après incubation, 20 μL de solution de MTT à 5 mg/mL ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a été incubée pendant 4 h, permettant aux cellules viables de transformer le MTT jaune en cristaux de formazan bleu foncé, qui ont été dissous dans 200 μL de diméthyle sulfoxyde (DMSO). La densité optique (DO) de chaque puits a été mesurée par un lecteur ELISA (ELX800 Biotek, USA) en utilisant des longueurs d'onde de test et de référence de 490 et 630 nm, respectivement. La viabilité cellulaire a été déterminée par la formule suivante :

La compatibilité in vitro des nanoparticules vierges a également été déterminée par des tests MTT utilisant MKN₂₈ et H₂₂ lignées cellulaires. Tous les résultats obtenus à partir des tests MTT ont été confirmés en répétant l'expérience à au moins trois occasions indépendantes et en testant en triple à chaque fois.

Test d'apoptose

Le kit Annexin V-FITC (Bender MedSystem, USA) a été adopté pour examiner l'altération des taux d'apoptose cellulaire. MKN₂₈ les cellules ont été soumises à une boîte de culture de 6 cm pendant 24 h. Les milieux de culture ont été remplacés par 1 μg/mL de CDDP libre, 1 μg/mL de NP chargées de CDDP et 200 μg/mL de NP vierges, respectivement. Le groupe témoin a été remplacé par des milieux de culture sans médicaments. L'enzyme a été ajoutée après 48 h de culture. Les cellules ont ensuite été collectées, lavées 2 fois avec du PBS et remises en suspension dans 100 μL de tampon. L'annexine V 5 μL et PI 1 μL ont été ajoutées à tour de rôle, mélangées et laissées au repos pendant 15 min à température ambiante sans exposition à la lumière. 400 mL de tampon ont été ajoutés et ont subi un processus FCM (BD FACS CantoTM, USA) pour l'analyse des taux d'apoptose cellulaire.

Analyse de réponse aux médicaments en histoculture (HDRA)

L'HDRA a été réalisée selon nos études précédentes [14, 19]. En bref, des souris ICR mâles ont reçu une injection sous-cutanée dans les deux espaces axillaires avec 4-6 × 10 ⁶ H₂₂ cellules en solution saline. Lorsque les tumeurs ont atteint 400 à 600 mm ³ en volume, les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale et des échantillons frais ont été prélevés, lavés deux fois dans une solution saline, immergés dans la solution de Hank et divisés en morceaux d'un poids d'environ 15 mg. Les échantillons de tissus ont été placés dans une plaque à 24 puits dans laquelle des éponges de gélatine carrées de dimensions 1 cm avaient été immergées dans du milieu RPMI 1640 additionné de 20 % de sérum de veau fœtal et de sulfate d'amikacine (100 UI/mL) contenant du CDDP libre ou du CDDP- NP chargées à deux concentrations différentes. Quatre échantillons de tumeur ont été incubés sans aucun médicament comme témoin. Les tissus ont ensuite été cultivés pendant 7 jours à 37 °C 5% CO₂ . Une solution mixte de collagénase de type I (100 L, 0,6 mg/mL) et de MTT (100 L, 5 mg/mL) dans 100 mg/mL de succinate de sodium a été ajoutée. Après incubation pendant 24 heures supplémentaires, le formazan MTT a été extrait par 1 ml de DMSO et 100 L de solution de chaque puits ont été transférés dans les puits d'une microplaque à 96 puits. La DO de chaque puits de la microplaque a été mesurée à l'aide du lecteur ELISA avec des longueurs d'onde de test et de référence de 490 et 630 nm, respectivement. Les viabilités des tissus ont été calculées selon la formule (4) suivante :

Efficacité antitumorale in vivo

Mesure du volume tumoral

Des souris ICR mâles pesant entre 18 et 20 g ont été implantées avec la lignée cellulaire d'hépatome murin H₂₂ et utilisé pour qualifier l'efficacité relative des NP chargées de CDDP-Tet. Élevées dans des circonstances spécifiques sans agent pathogène (SPF), les souris ont été réalisées conformément aux directives approuvées par le comité de protection des animaux de l'hôpital Drum Tower. 0,2 mL de suspension cellulaire contenant 4–6 × 10 ⁶ H₂₂ les cellules ont été injectées par voie sous-cutanée dans l'espace axillaire gauche des souris. Les souris ont été divisées en 6 groupes :groupe témoin (solution saline), groupe NPs vierges, groupe CDDP libre (3 mg/kg), groupe CDDP libre plus Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) et CDDP- Groupe NP chargées en Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg). Chaque groupe était composé de 6 souris. Les traitements ont commencé après 7 à 8 jours d'implantation, et le jour a été désigné comme « jour 0 ». Chaque animal a été pesé au moment du traitement afin que les dosages puissent être ajustés pour atteindre les doses en mg/kg rapportées. Les animaux ont également été pesés tous les deux jours tout au long de l'expérience.

Test d'immunofluorescence

Les tissus tumoraux des souris du groupe témoin et qui ont reçu des NP libres de CDDP plus Tet et CDDP-Tet ont été sélectionnés pour une observation histologique le 21e jour après le traitement. Les tumeurs ont été disséquées et fixées dans du formol tamponné neutre à 10 %, systématiquement transformées en paraffine, sectionnées à une épaisseur de 5 mm. Les coupes de tissus ont été observées au microscope confocal Zeiss LSM510 Meta après coloration des échantillons au (40,6-diamidino-2-phénylindole) (DAPI, bleu) et au marquage terminal deoxynucléotidyl transférase dUTP (TUNEL, vert) [20] .

¹⁸ Imagerie FDG-PET/CT

Les souris du groupe CDDP libre plus Tet et du groupe NP chargées CDDP-Tet ont ensuite reçu une imagerie TEP/CT au jour 6 après le traitement. 4 h de jeûne ont été effectuées avant l'injection du traceur. 14,8 MBq (400 lCi) sur ¹⁸ Le F-FDG a été injecté par la veine caudale comme radiotraceur. Les images ont été produites avec un scanner combiné TEP/CT (Jemini JXL, Philips, USA). Des images TEP haute résolution et le même champ de vision CT ont été acquis avec les souris 45 min après l'administration de ¹⁸ F-FDG. Les images TEP ont été corrigées pour l'atténuation et la dispersion sur la base des données CT. La fusion d'images a été réalisée par un système de fusion d'images automatique, à l'aide d'un logiciel fourni par le fournisseur. Les valeurs maximales d'absorption du FDG dans la tumeur ont été obtenues pour les calculs de la valeur d'absorption standard (SUV), en appliquant des corrections pour le poids corporel et l'activité injectée.

Méthodes statistiques

Les analyses statistiques des données ont été effectuées à l'aide du t de Student test. Les données sont répertoriées sous forme de moyenne  ± SD et les valeurs de P < 0,05 ont été acceptés comme une différence statistiquement significative.

Résultats

Synthèse et caractérisation de copolymères

Selon notre étude précédente, nous avons synthétisé les NP avec PEG-PCL et HO-PCL (le rapport optimal était de 1:3) [14]. Le diamètre, la polydispersité, le poids moléculaire moyen en nombre (Mn) et le poids moléculaire moyen en poids (Mw) des NPs copolymères PEG-PCL optimales sont indiqués dans le fichier supplémentaire 1 :tableau S1. Lorsqu'ils sont chargés de CDDP et de Tet, le contenu de chargement du médicament et l'efficacité d'encapsulation ont également été mesurés (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S2), qui sont similaires à ceux des NPs copolymériques PEG-PCL chargées de CDDP. Cependant, le contenu de charge médicamenteuse et l'efficacité de charge de Tet sont inférieurs à ceux des NPs copolymères PEG-PCL chargées de Tet, ce qui peut avoir quelque chose à voir avec les composants HO-PCL.

Grâce à la diffusion dynamique de la lumière (DLS), le diamètre des nanoparticules copolymériques PEG-PCL chargées de CDDP-Tet était de 359,1 ± 5,3 nm avec une polydispersité d'environ 0,231. Lorsqu'elles ont été observées par TEM et AFM (Fichier supplémentaire 1 :Fig S1a et S1b), les NP ont présenté une forme sphérique régulière et des tailles similaires qui coïncident avec les données de DLS. De plus, de petites gouttelettes sont dispersées dans les nanoparticules, ce qui confirme que les nanoparticules sont bien la structure d'une double émulsion.

Captation cellulaire des NP chargées par CDDP-Tet

Le chargement de particules avec des colorants fluorescents a été appliqué comme méthode courante pour explorer l'absorption cellulaire, qui réalise une détection visuelle et en temps réel. Nous avons démontré que les NP chargées de colorant peuvent pénétrer dans les cellules par endocytose. Dans cette étude, la rhodamine-B est hydrophile et peut être détectée dans le canal de fluorescence PI, qui est utilisé pour simuler le CDDP. Comme la simulation de Tet, la coumarine-6 ​​est hydrophobe, dont le signal peut être reçu dans le canal de fluorescence FITC. Après avoir été co-incubées avec des NP chargées de coumarine-6 ​​et de rhodamine-B pendant 2 h, les cellules LoVo ont été détectées par microscopie à fluorescence et lentille optique (200 ×). Comme on peut le voir sur la figure 2, les signaux de fluorescence peuvent être détectés dans le canal de fluorescence PI, le canal de fluorescence FITC, ainsi que le canal de fluorescence double PI/FITC. Les résultats ont confirmé que les NP peuvent transporter à la fois la coumarine-6 ​​et la rhodamine-B vers les cellules tumorales, ce qui nous permet de déduire que CDDP et Tet peuvent être chargés dans les NP et absorbés par les cellules tumorales simultanément.

Photographies de cellules LoVo après 2 h de coloration avec des NP chargées de rhodamine B et de coumarine-6 ​​(200 x ; bar :50 um). un Morphologie cellulaire en microscopie optique, b morphologie cellulaire sous microscope à fluorescence (canal de fluorescence PI), c morphologie cellulaire sous microscope à fluorescence (canal de fluorescence FITC), et d morphologie cellulaire sous microscope à fluorescence (double canal de fluorescence PI/FITC)

Cytotoxicité in vitro des nanoparticules

La cytotoxicité du CDDP libre, du Tet libre, du CDDP libre plus Tet et des NP chargées de CDDP-Tet a été comparée dans la lignée cellulaire gastrique MKN28. La concentration de Tet était 2,4 fois supérieure à la concentration de CDDP. Comme le montre la figure 3, la cytotoxicité des NP chargées de CDDP-Tet était la plus puissante parmi les quatre groupes. La différence de cytotoxicité entre le Tet libre et le groupe NPs et trois autres groupes de médicaments libres est devenue importante avec l'augmentation de la concentration. Des résultats similaires ont été observés dans les cellules humaines de cancer du col de l'utérus Hela et les cellules de carcinome hépatocellulaire H₂₂ (Fichier supplémentaire 1 :Fig S2a, S2b).

Cytotoxicité in vitro des nanoparticules. un Viabilités cellulaires de MKN28 après avoir été co-cultivées avec des médicaments pendant 48 h. La concentration de Tet était 2,4 fois supérieure à la concentration de CDDP. b Photographies de cellules MKN28 en microscopie optique (200 ×) après avoir été co-cultivées avec des médicaments pendant 48 h

L'étude de la toxicité des NP vierges a été menée dans nos travaux précédents. Dans l'étude précédente, le blanc de NP avait peu de toxicité sur les lignées cellulaires tumorales, ce qui indiquait que les NP à blanc ont une biocompatibilité satisfaisante [14, 16].

Analyse de l'apoptose in vitro des NP chargées de CDDP-Tet

Nous avons mesuré l'impact de 1 μg/mL de CDDP libre, de 2,4 μg/mL de Tet libre, de CDDP libre plus Tet (1 μg/mL + 2,4 μg/mL) et de NP chargées de CDDP-Tet (1 μg/mL + 2,4 μg /mL) sur le taux d'apoptose des cellules MKN28 après avoir été co-cultivées pendant 48 h. Le taux d'apoptose cellulaire a été calculé comme Q2 + Q4 (montré sur la figure 4). L'altération des taux d'apoptose des cellules était similaire entre les groupes CDDP libre plus Tet, CDDP libre et Tet libre (Fig. 4a–c). Cependant, le taux d'apoptose des cellules MKN28 induit par les NP chargées de CDDP-Tet était significativement plus élevé que dans trois autres groupes (Fig. 4d).

Analyse de l'apoptose in vitro par cytométrie en flux a CDDP gratuit, b Têt gratuit, c CDDP gratuit + Tet et d NP CDDP-Tet

Analyse de réponse aux médicaments en histoculture (HDRA)

Pour évaluer l'efficacité antitumorale des NP de manière plus complète, nous avons évalué les effets antitumoraux du CDDP libre, du CDDP libre plus Tet et des NP chargés de CDDP-Tet sur H₂₂ lignées cellulaires utilisant HDRA. En tant que méthode clinique pour prédire la chimiosensibilité, HDRA simule les conditions pratiques des tissus tumoraux de manière plus authentique que l'expérience cytologique [19], dont les résultats peuvent être influencés par le microenvironnement et la microstructure du tissu tumoral telles que la pénétration du médicament, les valeurs de pH extracellulaire, interstitielle pression de fluide, etc.

La concentration de Tet est 2,4 fois plus élevée que la concentration de CDDP. Comme le montre la figure 5, à la concentration la plus faible, l'effet antitumoral du CDDP libre et du groupe Tet était meilleur que celui du CDDP, mais les effets étaient similaires avec l'augmentation de la concentration du médicament. En accord avec l'analyse de l'apoptose, les NP chargées de CDDP-Tet ont eu un effet antitumoral considérablement meilleur parmi trois groupes à toutes les concentrations testées.

Test de réponse aux médicaments en histoculture

Analyse de l'efficacité antitumorale in vivo

Évaluation de l'efficacité et des effets secondaires

Modèles murins formés par H₂₂ les greffes de lignées cellulaires ont été traitées avec 3 mg/kg de CDDP libre, CDDP libre avec Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), NP chargées de CDDP-Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/ kg), respectivement. Les tumeurs ont été obtenues 12 jours après le traitement médicamenteux. Les tailles des tumeurs ont été détectées tous les 2 jours pour déterminer le contenu le plus optimal de l'administration du médicament. Comme le montre la courbe de croissance tumorale (Fig. 6), la tendance de croissance tumorale du groupe témoin ainsi que celle du groupe de nanoparticules vierges étaient similaires, mais il existait une inhibition importante de la tumeur dans les trois autres groupes avec administration de médicament. Par rapport au groupe CDDP gratuit, le groupe CDDP gratuit plus Tet a montré une meilleure efficacité antitumorale au cours des 6 premiers jours. Cependant, après 6 jours, la différence de taux d'inhibition tumorale entre les deux groupes a commencé à se réduire et après 10 jours, le CDDP libre plus le Tet avaient un effet antitumoral encore pire.

Volume tumoral de H₂₂ établi xénogreffes chez des souris ICR au cours d'une thérapie sous différents traitements. Les souris ont été traitées avec différentes stratégies au jour 0, comme le montre la figure :3 mg/kg de CDDP libre, CDDP libre avec Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg) et NP chargées de CDDP-Tet ( CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), respectivement. Moyenne ± SD (n = 6) de chaque groupe a été mesuré

Au cours des 6 premiers jours, les effets antitumoraux des groupes de NPs libres CDDP plus Tet et CDDP chargées de Tet étaient similaires. Par conséquent, les souris murines ayant reçu des NP chargées de CDDP-Tet ont montré une meilleure efficacité antitumorale depuis le 6e jour après le traitement. Fichier supplémentaire 1 :la figure S3a affiche différentes tailles de tumeurs de chaque groupe. Le volume tumoral du groupe de NP chargées de CDDP-Tet était le plus petit, ce qui pourrait être considéré comme le reflet direct d'un effet antitumoral important. En plus de la capacité d'inhibition tumorale, par rapport au groupe CDDP libre ou CDDP libre plus Tet, il y avait moins de vaisseaux sanguins situés à la surface de la tumeur). De même, comme le montre le fichier supplémentaire 1 :Figure S3b, la densité vasculaire était la plus faible dans le groupe NPs par rapport au groupe témoin et au groupe CDDP libre plus Tet.

Pour étudier plus avant le rapport des cellules apoptotiques dans les tissus tumoraux in vivo, le test TUNEL a été effectué pour la détection des cellules apoptotiques. Comme le montre la figure 7, les cellules apoptotiques dans les tumeurs peuvent être colorées avec une fluorescence verte pour indiquer l'apoptose. Les images fusionnées montrent moins de régions fluorescentes vertes dans le groupe témoin et le groupe CDDP libre plus Tet, indiquant la présence de moins de cellules apoptotiques. De plus, un grand nombre de régions fluorescentes vertes ont été observées dans le groupe traité avec les NP CDDP-Tet, indiquant une grande quantité de cellules apoptotiques. Les résultats ont confirmé que les NP CDDP-Tet peuvent favoriser l'apoptose tumorale in vivo.

Les cellules apoptotiques ont été détectées par un test TUNEL (vert) et co-colorées par coloration nucléaire DAPI (bleu)

En plus d'une meilleure efficacité antitumorale que le groupe CDDP libre et CDDP libre plus Tet, les NP chargées de CDDP-Tet présentaient également moins d'effets secondaires. Comme le montre la figure 8a, le CDDP libre et le CDDP libre plus Tet ont entraîné une perte de poids significative par rapport au groupe témoin, indiquant la toxicité avec l'administration directe de médicament. La courbe de changement de poids du groupe de NP vierges était similaire à celle du groupe témoin, suggérant que la toxicité des NP vierges pouvait être ignorée. La perte de poids causée par les NP chargées de CDDP-Tet et les groupes témoins était comparable au cours des 6 premiers jours. Du jour 6 au jour 12, les niveaux de poids des souris dans le groupe NPs étaient légèrement inférieurs à ceux du groupe témoin, mais étaient supérieurs à ceux du CDDP libre ou du groupe CDDP libre plus Tet. Il est à noter que le groupe CDDP libre plus Tet a contribué à une perte de poids évidente et à une diminution de l'appétit des souris au cours des 4 premiers jours, ce qui indique que l'absorption des médicaments était nocive pour l'ensemble du corps. En revanche, les NP chargées de CDDP-Tet peuvent être libérées lentement dans les tissus et maintenir la concentration à un degré stable; par conséquent, les effets secondaires étaient manifestement réduits par rapport à l'administration directe de médicaments. Ensuite, les effets secondaires du traitement ont également été évalués par biopsie hépatique (Fig. 8b). Par rapport au groupe témoin, la limite entre les cellules hépatiques du groupe de médicaments nus à double médicament est floue, certaines cellules hépatiques présentent des modifications gonflées, les corps cellulaires rétrécissent, une pycnose nucléaire et une augmentation de l'éosinophilie (flèche jaune), tandis que le double médicament groupe de nanoparticules. La structure des cellules souches est normale, l'espace intercellulaire est clair et il n'y a pas de changement pathologique évident. Ces résultats suggèrent qu'il y avait peu d'altération causée par la livraison des NP.

Évaluation des effets secondaires a poids corporel de H₂₂ établi xénogreffes chez des souris ICR au cours d'une thérapie sous différents traitements. b Les spécimens de foie colorés à l'HE ont été observés au microscope optique (400 ×)

PET–CT

Pour mieux comparer l'effet thérapeutique in vivo de chaque groupe, les souris ont subi une tomodensitométrie, une TEP/CT scan au jour 6 après le traitement. Les images de fusion de la TDM et de la TEP sont affichées sur la figure 9. La TEP/TDM est une méthode efficace pour refléter les changements métaboliques jusqu'à ¹⁸ Détection de l'absorption du FDG [21]. As shown in CT scan (Fig. 9), the tumor volume of free CDDP plus Tet group and CDDP-Tet-loaded NPs group were comparable (Fig. 9a) but the tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group was significantly higher than NPs group (Fig. 9b). The decreased intensity at the tumor site of the murine received CDDP-Tet-loaded NPs symbolized poor metabolism rate of the tumor, and thereby indicating the capability of NPs to retard tumor growth.

Male ICR mice bearing a subcutaneous H₂₂ tumor at the left axillary (arrows). CT, PET and fused PET/CT images are arranged in the figure from left to right. Tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group (blue arrow) was significantly higher than NPs group (yellow arrow)

Discussion

Considering the heterogeneity and complexity of tumor, combination therapy has become a standard strategy in the clinical treatment of tumor [22]. Nevertheless, simple combination of two individual therapeutics can't necessarily reach anticipated effect because of the different physicochemical and pharmacokinetic properties of the two drugs [23]. To deliver different drugs to tumor cells in a synergistic ratio, a combination therapy vehicle has been designed in this study. CDDP is hydrophilic while Tet is hydrophobic, which cause problems for the loading method. In this study, we used the amphiphilic copolymer with PCL as the hydrophobic core and PEG as the hydrophilic corona [14]. By the improved double emulsion method, Tet located in the oil layer and CDDP located in the water layer, the unique structure imparts the NPs with the capacity to simultaneous encapsulation of Tet and CDDP to form NPs. CDDP and Tet are located in different layers of NPs, resulting in low interfering effect and high stability [24].

The combination therapy vehicle loaded with CDDP and Tet can enhance the efficacy of CDDP-Tet combination. Not only in the cellular experiments, CDDP-Tet NPs also significantly inhibit tumor tissue viabilities in the HDRA assays, validating the anti-tumor effect of the NPs in the model which take into account of tumor microenvironment [19]. As to in vivo study, antitumor efficacy was observed in tumor volume change, which demonstrated that CDDP-Tet NPs effectively suppressed tumor growth with lower proliferation level. ¹⁸ FDG-PET/CT imaging revealed that the glucose metabolism of the tumors in the CDDP-Tet group was inhibited more prominently and early by inducing higher apoptosis level of tumors, which was confirmed in the immunofluorescence assays [21]. Compared with free CDDP plus Tet, CDDP-Tet NPs are faster and safer to take effect, which can be explained by the three mechanisms as follows.

Firstly, as a lipid-soluble drug, Tet can hardly distribute in the ECM and therefore rarely diffuse around tumor cells [9]. Located in the oil phase of NPs, Tet is endowed with better solubility and bioavailability, reaching the tumor sites in the same synergistic ratio as CDDP. Furthermore, CDDP, which used to have systemic side effect, once carried by the nanoparticle, can easily reach the interstitium of tumor tissues from leaky tumor blood vessels and be held within the tumor on account of pressure made by destitute lymphatic drainage [25]. The more CDDP tumor tissues hold, the less damage will be done to normal organs. As a result of passive targeting strategies, CDDP-Tet NPs are much safer than free CDDP plus Tet, which can be observed in the murine body weight changes and liver biopsies.

Drug resistance is regarded as one of the greatest challenges in cancer treatment, not only because of genetic changes at the level of a single cell, but also due to tumor tissues and microenvironment [26]. On one hand, Tet is alkaline, so it will be protonated in the acidic tumor microenvironment and thus can’t cross the electronegative tumor cytomembranes, which is called pH-induced physiological drug resistance [27]. On the other hand, large distances between blood vessels in solid tumors and high interstitial fluid pressure contribute to limited distribution of CDDP and Tet [28]. Carried by the nanovehicle, Tet can enter tumor cells via endocytosis without influence of tumor microenvironment, overcoming the pH-induced physiological drug resistance. The small size of nanocarriers allows them to enter tumor vasculature and preferentially accumulating at the tumor site in vivo [29, 30].

In summary, this study represents an example of delivering a chemotherapeutic drug along with a chemosensitizer simultaneously. Carried by the NPs, both drugs are targeted to tumor site passively, reducing systemic toxicity. Besides, NPs offer a solution to physiological drug resistance by helping the chemosensitizer enter tumor cells more and faster, which play an important role in improving the efficacy of tumor chemotherapy. Therefore, we believed that this PEG–PCL block copolymeric NPs could be a promising carrier for combined chemotherapy.

Conclusions

Based on our previous studies [8, 14, 16], this paper investigated the application of PEG–PCL/HO-PCL NPs for delivery of the combination of two drugs with different physicochemical properties. For in vitro studies, NPs exhibited superior antitumor effect with great biocompatibility. Enhanced antitumor efficacy was observed in tumor volume change and ¹⁸ FDG-PET/CT Imaging as to in vivo study in murine model. The mice in NPs group also exhibited reduced side effects. Additionally, the apoptosis rate of tumor cells was promoted by NPs in both in vitro and in vivo studies. In summary, this block copolymeric NPs could be a promising carrier for the delivery of Cisplatin–Tetradrine combinations and other combinations, with enhanced antitumor effect and reduced toxicity, for the treatment of cancer.

Disponibilité des données et des matériaux

The datasets used and/or analysed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abréviations

Tet:

Tetradrine

CDDP:

Cisplatin

NP :

Nanoparticule

PEG–PCL:

Poly(ethyleneglycol)–polycaprolactone

HO-PCL:

Polycarprolactone

ECM:

Extracellular matrix

PEG :

Polyéthylène glycol

RES:

Reticuloendothelial system

DMF :

Diméthylformamide

SPF:

Specific pathogen-free

Mn:

Number-average molecular weight

Mw:

Weight-average molecular weight

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière