Efficacité antitumorale améliorée de la thérapie Cisplatine-Tétradrine via une administration par nanoparticules biocompatibles

Résumé

La thérapie combinée a été une stratégie standard dans le traitement clinique des tumeurs. Nous avons démontré que la combinaison de Tétradrine (Tet) et de Cisplatine (CDDP) présentait une activité anticancéreuse synergique marquée, mais les effets secondaires inévitables limitent leur concentration thérapeutique. Considérant les propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques différentes des deux médicaments, nous les avons chargés ensemble dans un nanovéhicule par la méthode d'émulsion double améliorée. Les nanoparticules (NP) ont été préparées à partir du mélange de poly(éthylèneglycol)-polycaprolactone (PEG-PCL) et de polycaprolactone (HO-PCL), de sorte que CDDP et Tet peuvent être localisés dans les NP simultanément, résultant en un faible effet d'interférence et une haute stabilité. Les images du microscope à fluorescence ont révélé l'absorption cellulaire des deux agents hydrophiles et hydrophobes administrés par les NP. Les études in vitro sur différentes lignées de cellules tumorales et tissus tumoraux ont révélé une inhibition tumorale et des taux d'apoptose accrus. Quant aux études in vivo, une efficacité antitumorale supérieure et des effets secondaires réduits ont été observés dans le groupe NP. De plus, l'imagerie ¹⁸FDG-TEP/TDM a démontré que les NP réduisaient les activités métaboliques des tumeurs de manière plus prononcée. Nos résultats suggèrent que les NP copolymères PEG-PCL pourraient être un vecteur prometteur pour la chimiothérapie combinée avec une efficacité solide et des effets secondaires mineurs.

Introduction

Avec le développement de la thérapie complète des tumeurs, les composés de platine jouent un rôle important dans le traitement de divers cancers, parmi lesquels le cisplatine (CDDP) est largement utilisé en clinique [1, 2]. De nos jours, le CDDP est encore significatif lorsqu'il est combiné avec l'immunothérapie des tumeurs, montrant un effet favorable sur les tumeurs malignes telles que le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) [3]. Cependant, ces agents chimiothérapeutiques atteignent toujours une activité antitumorale au prix d'une toxicité indésirable [4], donc des agents thérapeutiques qui peuvent réduire la toxicité et améliorer l'efficacité de la chimiothérapie ont été explorés sans cesse [5, 6]. La Tétradrine (Tet) est un membre de l'alcaloïde bis-benzylisoquinoléine [7], montrant un effet satisfaisant dans la sensibilisation à la chimiothérapie. Notre travail précédent a démontré que la combinaison de Tet et CDDP a bien une activité anticancéreuse synergique marquée en inhibant l'expression de gènes associés aux agents chimiothérapeutiques, y compris le groupe de complémentation de réparation d'excision 1 (ERCC1), la Thymidylate Synthase (TS), la β-tubuline III, etc [8]. Cependant, l'application clinique de Tet souffre de sa faible solubilité dans l'eau et de sa faible biodisponibilité orale [7]. De plus, le CDDP hydrophile se distribue le plus facilement dans la matrice extracellulaire (MEC), tandis que le Tet hydrophobe pénètre les membranes lipidiques et peut être transporté à travers les cellules, donc les deux médicaments ne peuvent pas vraiment travailler ensemble. Par conséquent, il est essentiel de trouver un moyen qui peut administrer efficacement les deux médicaments simultanément, améliorant l'effet antinéoplasique avec des effets secondaires réduits.

Les avancées récentes dans le domaine de la nanotechnologie gèrent de nouvelles approches pour le diagnostic et le traitement du cancer [9, 10]. Les nanoparticules (NP) construites avec des copolymères amphiphiles, en particulier le polyéthylène glycol (PEG), sont connues pour leurs capacités à réduire l'adhérence des protéines sériques et prévenir la prise par le système réticulo-endothélial (SRE) [11]. Si elles sont utilisées pour transporter des médicaments hydrophobes, les nanovecteurs augmentent la solubilité habilement et prolongent ainsi que augmentent la résidence du médicament dans la circulation sanguine et la tumeur [12]. Avec l'utilisation clinique des NP copolymères, la biocompatibilité des NP attire de plus en plus d'attention. Par exemple, des découvertes récentes ont révélé que certaines nanoparticules de dioxyde de titane, de silice et d'or injectées accélèrent l'intravasation et l'extravasation des cellules cancéreuses dans des modèles animaux [13]. Les NP préparées à partir de nanomatériaux avec une bonne biocompatibilité et sécurité, en particulier celles approuvées par la FDA, sont de meilleurs candidats pour les vecteurs de médicaments.

Préliminairement, nous avons réussi à construire des NP chargées de CDDP [14, 15] et des NP chargées de Tet en utilisant le polyéthylène glycol-poly(caprolactone) (PCL-PEG) [16], dont les effets antitumoraux in vivo ont tous deux été démontrés. Dans cette étude, nous avons utilisé PEG-PCL pour la co-administration de CDDP et Tet. Avec une charge quasi-neutre, le PEG forme la coquille hydrophile d'une nanoparticule, qui cache les épitopes antigéniques et prévient la réaction immunologique [14]. Les images du microscope à fluorescence ont démontré que les cellules peuvent absorber à la fois les agents hydrophiles et hydrophobes administrés par les NP. Les résultats des études in vitro, non seulement sur différentes lignées de cellules tumorales, mais aussi sur les tissus tumoraux, ont révélé que les NP CDDP-Tet inhibent la croissance tumorale plus efficacement que les médicaments libres. Lorsqu'elles sont étudiées in vivo, une efficacité antitumorale accrue et des effets secondaires diminués ont été observés dans le groupe NP. De plus, l'imagerie ¹⁸FDG-TEP/TDM a montré le taux de métabolisme le plus faible de la tumeur dans le groupe NP, indiquant ainsi la capacité des NP CDDP-Tet à retarder la croissance tumorale.

Méthodes

Matériaux

Réactifs et Cellules

CDDP (formule moléculaire PtCl₂(NH₃)₂) a été acheté auprès de Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Jinan Chine) [15]. Tétradrine (formule moléculaire C₃₈H₄₂N₂O₆) a été obtenue sous forme de poudre avec une pureté > 98% auprès de Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, Chine) [16]. Méthoxypolyéthylèneglycol [MePEG ; poids moléculaire moyen (Mw = 4 kDa ; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. Chine] a été déshydraté par distillation azéotropique avec le toluène puis séché sous vide à 50 °C pendant 12 h avant utilisation. ε-Caprolactone (ε-CL ; Aldrich, USA) a été purifiée par séchage sur CaH₂ à température ambiante suivie de distillation sous pression réduite. L'alcool polyvinylique (PVA ; degré de polymérisation = 500, degré d'alcoolisation = 88% ; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., Chine) et l'octoate d'étain (formule moléculaire SnCl2) (Sigma) ont été utilisés tels que reçus. Le milieu RPMI 1640 (Gibco, USA), le sérum de veau (Lanzhou Minhai Bioengineering, Chine), et le bromure de diméthylthiazoly-2,5-diphényltétrazolium (MTT ; Amersco, USA) ont été utilisés tels que reçus.

Ligne cellulaire de cancer gastrique humain bien différencié MKN₂₈, lignée d'adénocarcinome colorectal humain LoVo, lignée de cancer du col utérin humain Hela, et lignée d'hépatome murin H₂₂ ont été obtenues de l'Institut de Biologie Cellulaire de Shanghai (Shanghai, Chine). Toutes les lignées cellulaires ont été propagées dans le milieu RPMI 1640, supplémenté avec 10% de sérum bovin, pénicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 g/mL), pyruvate, glutamine et insuline à 37 °C dans une atmosphère saturée en eau avec 5% CO₂.

Synthèse des Copolymères

Comme nous l'avons décrit précédemment [16, 17], les copolymères mPEG-PCL et HO-PCL ont été synthétisés par une copolymérisation par ouverture de cycle. Brièvement, une quantité prédéterminée de ε-CL a été ajoutée dans un tube de polymérisation contenant du PEG et une petite quantité d'octoate d'étain (0,1% p/p). Le tube a ensuite été connecté à un système de vide, scellé, et placé dans un bain d'huile à 130 °C pendant 48 h. Pour la synthèse des copolymères HO-PCL, une quantité prédéterminée de ε-CL et d'octoate d'étain ont été ajoutées dans un tube de polymérisation sans séchage. Après la polymérisation complète, les copolymères bruts ont été dissous avec du chloroforme et précipités dans une quantité excédentaire de méthanol froid pour éliminer le monomère et l'oligomère non réagis. Les précipités ont ensuite été filtrés et lavés à l'eau plusieurs fois avant d'être séchés soigneusement sous pression réduite.

Préparation des Nanoparticules Chargées CDDP-Tet

Une quantité prédéterminée de CDDP et Tet-chargées nanoparticules ont été préparées par la méthode d'émulsion double (DE) [14, 18]. CDDP et Tet ont été émulsionnés avec 1 mL de solution de dichlorométhane (DCM) contenant 5 mg de mPEG-PCL et 15 mg de HO-PCL, par sonication pendant 15 s (15 W) dans un bain de glace (solution W1). Ensuite, 4 mL de solution PVA 3% (p/v) W2 a été ajoutée et soniquée pendant 30 s pour faire une émulsion W1/O/W2. L'émulsion double a été diluée dans 50 mL de solution aqueuse PVA 0,3% (p/v) et le DCM a été évaporé sous vide. Les nanoparticules obtenues ont été collectées, lavées et lyophilisées (Fig. 1).

Efficacité antitumorale améliorée de la thérapie Cisplatine-Tétradrine via une administration par nanoparticules biocompatibles — Le schéma de la préparation des NP CDDP-Tet

Teneur en Médicament et Efficacité d'Encapsulation

Pour déterminer la teneur en chargement du médicament, la poudre de NP CDDP-Tet-chargées lyophilisées a été dissoute dans le diméthylformamide (DMF), et 30 L de cette solution a été mélangée avec 30 L de HCl 2 mmol/L suivi de l'addition de 2,94 mL de solution SnCl₂ 0,2 mmol/L dans HCl 2 mmol/L. L'absorbance à 403 nm a été mesurée après 1 h en référence à une courbe d'étalonnage en utilisant un spectrophotomètre Shimadzu UV-1205 (Kyoto, Japon). La quantité totale du médicament dans les NP pouvait alors être calculée. La teneur en chargement du médicament et l'efficacité d'encapsulation étaient, respectivement, obtenues par les Éqs. (1) et (2) :

$${\text{Teneur en chargement du médicament}}\, (\% ) = \frac{{{\text{Poids du médicament dans les nanoparticules}}}}{{{\text{Poids des nanoparticules}}}} \times 100\,(\% )$$ (1) $${\text{Efficacité d'encapsulation }}\,(\% ) = \frac{{{\text{Poids du médicament dans les nanoparticules}}}}{{{\text{Poids du médicament d'alimentation}}}} \times 100\,(\% )$$ (2)

Cytotoxicité In Vitro des Nanoparticules et Étude de Biocompatibilité

Études d'Absorption Cellulaire

Sur la base de notre travail précédent [15], les cellules LoVo ont été placées sur le couvercle d'une plaque à 6 puits avec environ 5 × 10⁵ cellules chaque puits et ont été incubées pendant 24 h (37 °C, 5% CO₂). Les NP avec rhodamine B (21 μg/mL) ont été ajoutées dans les puits. Après incubation pendant 2 h, la plaque a été lavée avec 4 °C et 37 °C de PBS pendant 3-4 fois chacune. Les cellules LoVo sur lamelles ont ensuite été soumises au microscope à fluorescence.

Essai de Cytotoxicité

La cytotoxicité in vitro des médicaments a été déterminée par des essais MTT standard en utilisant les lignées cellulaires MKN28 et H₂₂. Brièvement, les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 5000 cellules par puits 24 h avant l'essai. Ensuite, les cellules ont été exposées à une série de doses de CDDP libre, Tet libre, CDDP libre plus Tet et NP chargées CDDP-Tet. Après incubation, 20 μL de solution MTT 5 mg/mL a été ajouté à chaque puits et la plaque a été incubée pendant 4 h, permettant aux cellules viables de transformer le MTT jaune en cristaux de formazan bleu foncé, qui ont été dissous dans 200 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO). La densité optique (DO) de chaque puits a été mesurée par un lecteur ELISA (ELX800 Biotek, USA) en utilisant des longueurs d'onde de test et de référence de 490 et 630 nm, respectivement. La viabilité cellulaire a été déterminée par la formule suivante :

$${\text{Viabilité cellulaire}}\,(\% ) = \frac{{{\text{DO (puits test)}}}}{{{\text{DO (puits référence)}}}} \times 100\,(\% )$$ (3)

La compatibilité in vitro des nanoparticules vides a également été déterminée par des essais MTT en utilisant les lignées cellulaires MKN₂₈ et H₂₂. Tous les résultats obtenus des essais MTT ont été confirmés en répétant l'expérience au moins trois fois indépendantes et en testant en triplicata chaque fois.

Essai d'Apoptose

Le kit Annexin V-FITC (Bender MedSystem, USA) a été adopté pour examiner l'altération des taux d'apoptose cellulaire. Les cellules MKN₂₈ ont été soumises à un plat de culture de 6 cm pendant 24 h. Les milieux de culture ont été remplacés avec 1 μg/mL CDDP libre, 1 μg/mL NP chargées CDDP, et 200 μg/mL NP vides, respectivement. Le groupe contrôle a été remplacé avec des milieux de culture sans médicaments. L'enzyme a été ajoutée après 48 h de culture. Les cellules ont ensuite été collectées, lavées 2 fois avec PBS, et resuspendues dans 100 μL de tampon. Annexin V 5 μL et IP 1 μL ont été ajoutés tour à tour, mélangés, et laissés reposer pendant 15 min à température ambiante sans exposition à la lumière. 400 mL de tampon a été ajouté et a subi le processus FCM (BD FACS CantoTM, USA) pour l'analyse des taux d'apoptose cellulaire.

Essai de Réponse aux Médicaments par Histoculture (HDRA)

Le HDRA a été réalisé selon nos études précédentes [14, 19]. Brièvement, des souris ICR mâles ont été injectées sous-cutanément dans les deux espaces axillaires avec 4-6 × 10⁶ cellules H₂₂ dans du sérum physiologique. Lorsque les tumeurs atteignaient 400-600 mm³ de volume, les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale, et des spécimens frais ont été échantillonnés, lavés deux fois dans du sérum physiologique, immergés dans la solution de Hank, et divisés en morceaux avec des poids d'environ 15 mg. Les échantillons de tissu ont été placés dans une plaque à 24 puits dans laquelle des éponges de gélatine carrées de dimensions 1 cm avaient été immergées dans le milieu RPMI 1640 supplémenté avec 20% de sérum fœtal de veau et sulfate d'amikacine (100 UI/mL) contenant du CDDP libre ou des NP chargées CDDP à deux concentrations différentes. Quatre spécimens de tumeurs ont été incubés sans aucun médicament comme contrôle. Les tissus ont ensuite été cultivés pendant 7 jours à 37 °C 5% CO₂. Une solution mixte de Collagénase Type I (100 L, 0,6 mg/mL) et MTT (100 L, 5 mg/mL) dans 100 mg/mL de succinate de sodium a été ajoutée. Après incubation pendant 24 h supplémentaires, le formazan MTT a été extrait par 1 mL DMSO, et 100 L de solution de chaque puits a été transférée dans les puits d'une microplaques à 96 puits. La DO de chaque puits dans la microplaques a été mesurée en utilisant le lecteur ELISA avec des longueurs d'onde de test et de référence de 490 et 630 nm, respectivement. Les viabilités des tissus ont été calculées selon la formule suivante (4) :

$${\text{Viabilité du tissu}}\,(\% ) = \frac{{{\text{DO (test)}}/{\text{Poids (test)/mg}}}}{{{\text{DO (contrôle)}}/{\text{Poids (contrôle)/mg}}}} \times 100\,(\% )$$ (4)

Efficacité Antitumorale In Vivo

Mesure du Volume Tumorale

Des souris ICR mâles avec un poids entre 18 et 20 g ont été implantées avec la lignée d'hépatome murin H₂₂ et utilisées pour qualifier l'efficacité relative des NP chargées CDDP-Tet. Élevées sous des circonstances exemptes de pathogènes spécifiques (SPF), les souris ont été réalisées conformément aux directives approuvées par le Comité de Soins Animaux à l'Hôpital Drum Tower. 0,2 mL de suspension cellulaire contenant 4-6 × 10⁶ cellules H₂₂ ont été injectées sous-cutanément dans l'espace axillaire gauche des souris. Les souris ont été divisées en 6 groupes : groupe contrôle (sérum physiologique), groupe NP vides, groupe CDDP libre (3 mg/kg), groupe CDDP libre plus Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), et groupe NP chargées CDDP-Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg). Chaque groupe était composé de 6 souris. Les traitements ont commencé après 7-8 jours d'implantation, et le jour a été désigné comme « Jour 0 ». Chaque animal a été pesé au moment du traitement pour que les dosages puissent être ajustés pour atteindre les doses rapportées en mg/kg. Les animaux ont également été pesés tous les deux jours tout au long de l'expérience.

Essai d'Immunofluorescence

Les tissus tumoraux des souris dans le groupe contrôle et celui qui a reçu du CDDP libre plus Tet et des NP CDDP-Tet ont été sélectionnés pour l'observation histologique le 21ème jour après le traitement. Les tumeurs ont été disséquées et fixées dans du formol neutre tamponné à 10%, traitées de routine en paraffine, sectionnées à une épaisseur de 5 mm. Les sections de tissu ont été observées sous un microscope confocal Zeiss LSM510 Meta après que les échantillons ont été colorés avec (40,6-diamidino-2-phénylindole) (DAPI, bleu) et marquage d'uracile nick terminal désoxyribonucléotidyl transférase (TUNEL, vert) [20].

Imagerie ¹⁸FDG-TEP/TDM

Les souris du groupe CDDP libre plus Tet et du groupe NP chargées CDDP-Tet ont ensuite reçu une imagerie TEP/TDM au jour 6 après le traitement. 4 h de jeûne ont été effectuées avant l'injection du traceur. 14,8 MBq (400 µCi) de ¹⁸F-FDG a été injecté via la veine caudale comme radiotraceur. Les images ont été produites avec un scanner TEP/TDM combiné (Jemini JXL, Philips, USA). Des images TEP haute résolution et le même champ de vue TDM ont été acquis avec les souris 45 min après l'administration de ¹⁸F-FDG. Les images TEP ont été corrigées pour l'atténuation et la diffusion sur la base des données TDM. La fusion d'images a été réalisée par un système de fusion d'images automatique, en utilisant un logiciel fourni par le vendeur. Les valeurs maximales de captation de FDG dans la tumeur ont été obtenues pour les calculs de la valeur d'absorption standardisée (SUV), en appliquant des corrections pour le poids corporel et l'activité injectée.

Méthodes Statistiques

Les analyses statistiques des données ont été faites en utilisant le test t de Student. Les données sont listées en moyenne ± ET, et les valeurs de P < 0,05 ont été acceptées comme une différence statistiquement significative.

Résultats

Synthèse et Caractérisation des Copolymères

Selon notre étude antérieure, nous avons synthétisé les NP avec PEG-PCL et HO-PCL (le ratio optimal était 1:3) [14]. Le diamètre, la polydispersité, le poids moléculaire moyen en nombre (Mn) et le poids moléculaire moyen en poids (Mw) des NP copolymères PEG-PCL optimaux sont montrés dans le Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1. Lorsqu'elles sont chargées avec CDDP et Tet, la teneur en chargement du médicament et l'efficacité d'encapsulation ont également été mesurées (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S2), qui sont similaires à celles des NP copolymères PEG-PCL chargées CDDP. Cependant, la teneur en chargement du médicament et l'efficacité de chargement de Tet sont inférieures à celles des NP copolymères PEG-PCL chargées Tet, ce qui peut avoir quelque chose à voir avec les composants HO-PCL.

Par diffusion dynamique de la lumière (DDL), le diamètre des NP copolymères PEG-PCL chargées CDDP-Tet était de 359,1 ± 5,3 nm avec une polydispersité autour de 0,231. Lorsqu'elles sont observées par MET et MAF (Fichier supplémentaire 1 : Fig S1a et S1b), les NP présentaient une forme sphérique régulière et des tailles similaires qui coïncidaient avec les données de DDL. Aussi, de petites gouttelettes sont dispersées dans les nanoparticules, ce qui confirme que les nanoparticules sont bien la structure d'émulsion double.

Absorption Cellulaire des NP Chargées CDDP-Tet

Les particules chargées avec des colorants fluorescents ont été appliquées comme une méthode commune pour explorer l'absorption cellulaire, qui réalise une détection visuelle et en temps réel. Nous avons démontré que les NP chargées de colorant peuvent entrer dans les cellules par endocytose. Dans cette étude, la rhodamine-B est hydrophile et peut être détectée dans le canal de fluorescence IP, qui sont utilisées pour simuler CDDP. Comme simulation de Tet, la coumarine-6 est hydrophobe, dont le signal peut être reçu dans le canal de fluorescence FITC. Après avoir été co-incubées avec des NP chargées de coumarine-6 et rhodamine-B pendant 2 h, les cellules LoVo ont été détectées par microscopie à fluorescence et objectif optique (200 ×). Comme on peut le voir dans la Fig. 2, des signaux de fluorescence peuvent être détectés dans le canal de fluorescence IP, le canal de fluorescence FITC, ainsi que le canal de fluorescence double IP/FITC. Les résultats ont confirmé que les NP peuvent transporter à la fois la coumarine-6 et la rhodamine-B vers les cellules tumorales en même temps, sur la base de laquelle nous pouvons déduire que CDDP et Tet peuvent être chargées dans les NP et absorbées par les cellules tumorales simultanément.

Cytotoxicité In Vitro des Nanoparticules

La cytotoxicité du CDDP libre, Tet libre, CDDP libre plus Tet et NP chargées CDDP-Tet ont été comparées dans la lignée cellulaire gastrique MKN28. La concentration de Tet était 2,4 fois plus que la concentration de CDDP. Comme montré dans la Fig. 3, la cytotoxicité des NP chargées CDDP-Tet était la plus puissante parmi les quatre groupes. La différence de cytotoxicité entre le Tet libre et le groupe NP et les trois autres groupes de médicaments libres est devenue proéminente avec l'augmentation de la concentration. Des résultats similaires ont été observés dans les cellules de cancer du col utérin humain Hela et les cellules de carcinome hépatocellulaire H₂₂ (Fichier supplémentaire 1 : Fig S2a, S2b).

L'étude de toxicité des NP vides a été réalisée dans notre travail précédent. Dans l'étude précédente, les NP vides avaient peu de toxicité sur les lignées cellulaires tumorales, ce qui indiquait que les NP vides sont d'une biocompatibilité satisfaisante [14, 16].

Analyse d'Apoptose In Vitro des NP Chargées CDDP-Tet

Nous avons mesuré l'impact de 1 μg/mL CDDP libre, 2,4 μg/mL Tet libre, CDDP libre plus Tet (1 μg/mL + 2,4 μg/mL), et NP chargées CDDP-Tet (1 μg/mL + 2,4 μg/mL) sur le taux d'apoptose des cellules MKN28 après co-culture pendant 48 h. Le taux d'apoptose cellulaire a été calculé comme Q2 + Q4 (montré dans la Fig. 4). L'altération des taux d'apoptose cellulaires était similaire entre les groupes CDDP libre plus Tet, CDDP libre et Tet libre (Fig. 4a-c). Cependant, le taux d'apoptose des cellules MKN28 induit par les NP chargées CDDP-Tet était significativement plus élevé que les trois autres groupes (Fig. 4d).

Essai de Réponse aux Médicaments par Histoculture (HDRA)

Pour évaluer l'efficacité antitumorale des NP plus complètement, nous avons évalué les effets antitumoraux du CDDP libre, CDDP libre plus Tet, et NP chargées CDDP-Tet sur les lignées cellulaires H₂₂ en utilisant HDRA. En tant que méthode clinique pour prédire la chimiosensibilité, HDRA simule les conditions pratiques des tissus tumoraux plus authentiquement que l'expérience cytologique [19], dont les résultats peuvent être influencés par le microenvironnement et la microstructure du tissu tumoral tels que la pénétration du médicament, les valeurs de pH extracellulaires, la pression du fluide interstitiel, etc.

La concentration de Tet est 2,4 fois plus que la concentration de CDDP. Comme montré dans la Fig. 5, à la concentration la plus basse, l'effet antitumorale du groupe CDDP libre et Tet était meilleur que celui de CDDP mais les effets étaient similaires avec l'augmentation de la concentration du médicament. Conformément à l'analyse d'apoptose, les NP chargées CDDP-Tet avaient un effet antitumorale considérablement meilleur parmi les trois groupes à toutes les concentrations testées.

Analyse de l'Efficacité Antitumorale In Vivo

Évaluation de l'Efficacité et des Effets Secondaires

Des modèles murins formés par greffe de lignée cellulaire H₂₂ ont été traités avec 3 mg/kg de CDDP libre, CDDP libre avec Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), NP chargées CDDP-Tet (CDDP 3 mg/kg + Tet 7,2 mg/kg), respectivement. Les tumeurs ont été obtenues 12 jours après le traitement médicamenteux. Les tailles de tumeurs ont été détectées tous les 2 jours pour déterminer le contenu optimal d'administration du médicament. Comme montré dans la courbe de croissance tumorale (Fig. 6), la tendance de croissance tumorale du groupe contrôle ainsi que du groupe NP vides étaient similaires mais il existait une inhibition proéminente de la tumeur dans les trois autres groupes avec administration du médicament. Comparé au groupe CDDP libre, le groupe CDDP libre plus Tet a affiché une meilleure efficacité antitumorale pendant les premiers 6 jours. Cependant, après 6 jours, la différence de taux d'inhibition tumorale entre les deux groupes a commencé à se réduire et après 10 jours, le CDDP libre plus Tet avait même un effet antitumorale pire.

Pendant les premiers 6 jours, les effets antitumoraux des groupes CDDP libre plus Tet et NP chargées CDDP-Tet étaient similaires. Par conséquent, les souris recevant des NP chargées CDDP-Tet ont montré une meilleure efficacité antitumorale depuis le jour 6 après le traitement. Le Fichier supplémentaire 1 : Figure S3a affiche différentes tailles de tumeurs de chaque groupe. Le volume tumoral du groupe NP chargées CDDP-Tet était le plus petit, ce qui pourrait être considéré comme le reflet direct de l'effet antitumorale proéminent. En plus de la capacité d'inhibition tumorale, comparé au groupe CDDP libre ou CDDP libre plus Tet, il y avait moins de vaisseaux sanguins situés sur la surface de la tumeur). De même, comme montré dans le Fichier supplémentaire 1 : Figure S3b, la densité vasculaire était la plus faible dans le groupe NP par rapport au groupe contrôle et au groupe CDDP libre plus Tet.

Pour étudier davantage le rapport de cellules apoptotiques dans le tissu tumoral in vivo, l'essai TUNEL a été réalisé pour la détection des cellules apoptotiques. Comme montré dans la Fig. 7, les cellules apoptotiques dans les tumeurs peuvent être colorées avec une fluorescence verte pour indiquer l'apoptose. Les images fusionnées montrent moins de régions fluorescentes vertes dans le groupe contrôle et le groupe CDDP libre plus Tet, indiquant la présence de moins de cellules apoptotiques. De plus, un grand nombre de régions fluorescentes vertes ont été observées dans le groupe traité avec des NP CDDP-Tet, indiquant une grande quantité de cellules apoptotiques. Les résultats ont confirmé que les NP CDDP-Tet peuvent promouvoir l'apoptose tumorale in vivo.

En plus d'une meilleure efficacité antitumorale que le groupe CDDP libre et CDDP libre plus Tet, les NP chargées CDDP-Tet ont également affiché moins d'effets secondaires. Comme montré dans la Fig. 8a, le CDDP libre et le CDDP libre plus Tet ont causé une perte de poids significative par rapport au groupe contrôle, indiquant la toxicité avec l'administration directe du médicament. La courbe de changement de poids du groupe NP vides était similaire à celle du groupe contrôle, suggérant que la toxicité des NP vides pouvait être ignorée. La perte de poids causée par les NP chargées CDDP-Tet et les groupes contrôle étaient comparables pendant les premiers 6 jours. Du jour 6 au jour 12, les niveaux de poids des souris dans le groupe NP étaient légèrement inférieurs à ceux du groupe contrôle, mais étaient supérieurs au groupe CDDP libre ou CDDP libre plus Tet. Il est notable que le groupe CDDP libre plus Tet a contribué à une perte de poids évidente et a diminué l'appétit des souris pendant les premiers 4 jours, ce qui indique que l'absorption des médicaments était nuisible pour l'ensemble du corps. En revanche, les NP chargées CDDP-Tet peuvent être libérées lentement dans les tissus et maintenir la concentration à un degré stable ; par conséquent, les effets secondaires étaient évidemment abaissés comparés à l'administration directe du médicament. Ensuite, les effets secondaires du traitement ont également été évalués par biopsie hépatique (Fig. 8b). Comparé au groupe contrôle, la limite entre les cellules hépatiques du groupe double médicament nu est floue, certaines cellules hépatiques ont des changements ballonnés, les corps cellulaires se rétractent, la pyknose nucléaire, et l'éosinophilie accrue (flèche jaune), tandis que le groupe double médicament nanoparticules. La structure des cellules souches est normale, l'espace intercellulaire est clair, et il n'y a pas de changement pathologique évident. Ces résultats suggéraient qu'il y avait peu d'altération causée par l'administration par NP.

TEP-TDM

Pour mieux comparer l'effet thérapeutique in vivo de chaque groupe, les souris ont subi un TDM, TEP/TDM scan au jour 6 après le traitement. Les images de fusion de TDM et TEP sont affichées dans la Fig. 9. TEP/TDM est une méthode efficace pour refléter les changements métaboliques par la détection de l'absorption de ¹⁸FDG [21]. Comme montré dans le scan TDM (Fig. 9), le volume tumoral du groupe CDDP libre plus Tet et du groupe NP chargées CDDP-Tet étaient comparables (Fig. 9a) mais le taux métabolique tumoral dans le groupe CDDP libre plus Tet était significativement plus élevé que le groupe NP (Fig. 9b). L'intensité diminuée au site tumoral de la souris recevant des NP chargées CDDP-Tet symbolisait un taux de métabolisme faible de la tumeur, indiquant ainsi la capacité des NP à retarder la croissance tumorale.

Discussion

Considérant l'hétérogénéité et la complexité de la tumeur, la thérapie combinée est devenue une stratégie standard dans le traitement clinique de la tumeur [22]. Néanmoins, la simple combinaison de deux thérapeutiques individuelles ne peut pas nécessairement atteindre l'effet anticipé en raison des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques différentes des deux médicaments [23]. Pour administrer différents médicaments aux cellules tumorales dans un ratio synergique, un véhicule de thérapie combinée a été conçu dans cette étude. CDDP est hydrophile tandis que Tet est hydrophobe, ce qui cause des problèmes pour la méthode de chargement. Dans cette étude, nous avons utilisé le copolymère amphiphile avec PCL comme noyau hydrophobe et PEG comme couronne hydrophile [14]. Par la méthode d'émulsion double améliorée, Tet localisé dans la phase huileuse et CDDP localisé dans la phase aqueuse, la structure unique confère aux NP la capacité d'encapsulation simultanée de Tet et CDDP pour former des NP. CDDP et Tet sont localisés dans différentes couches des NP, résultant en un faible effet d'interférence et une haute stabilité [24].

Le véhicule de thérapie combinée chargé avec CDDP et Tet peut améliorer l'efficacité de la combinaison CDDP-Tet. Non seulement dans les expériences cellulaires, les NP CDDP-Tet inhibent également significativement les viabilités des tissus tumoraux dans les essais HDRA, validant l'effet anti-tumoral des NP dans le modèle qui prend en compte le microenvironnement tumoral [19]. Quant à l'étude in vivo, l'efficacité antitumorale a été observée dans le changement de volume tumoral, ce qui a démontré que les NP CDDP-Tet suppriment efficacement la croissance tumorale avec un niveau de prolifération plus bas. L'imagerie ¹⁸FDG-TEP/TDM a révélé que le métabolisme du glucose des tumeurs dans le groupe CDDP-Tet était inhibé de manière plus proéminente et précoce en induisant un niveau d'apoptose plus élevé des tumeurs, ce qui a été confirmé dans les essais d'immunofluorescence [21]. Comparé au CDDP libre plus Tet, les NP CDDP-Tet sont plus rapides et plus sûres pour prendre effet, ce qui peut être expliqué par les trois mécanismes suivants.

Premièrement, en tant que médicament liposoluble, Tet peut difficilement se distribuer dans la MEC et donc rarement diffuser autour des cellules tumorales [9]. Localisé dans la phase huileuse des NP, Tet est doté d'une meilleure solubilité et biodisponibilité, atteignant les sites tumoraux dans le même ratio synergique que CDDP. De plus, CDDP, qui avait l'habitude d'avoir des effets secondaires systémiques, une fois transporté par la nanoparticule, peut facilement atteindre l'interstitium des tissus tumoraux à partir de vaisseaux sanguins tumoraux perméables et être retenu dans la tumeur en raison de la pression faite par le drainage lymphatique défaillant [25]. Plus les tissus tumoraux retiennent de CDDP, moins de dommages seront faits aux organes normaux. En tant que résultat de stratégies de ciblage passif, les NP CDDP-Tet sont beaucoup plus sûres que le CDDP libre plus Tet, ce qui peut être observé dans les changements de poids corporel des souris et les biopsies hépatiques.

La résistance aux médicaments est considérée comme l'un des plus grands défis dans le traitement du cancer, non seulement en raison des changements génétiques au niveau d'une seule cellule, mais aussi en raison des tissus tumoraux et du microenvironnement [26]. D'un côté, Tet est alcalin, donc il sera protoné dans le microenvironnement tumoral acide et ne peut donc pas traverser les cytomembranes tumorales électro-négatives, ce qui est appelé résistance aux médicaments physiologique induite par le pH [27]. De l'autre côté, les grandes distances entre les vaisseaux sanguins dans les tumeurs solides et la haute pression du fluide interstitiel contribuent à la distribution limitée de CDDP et Tet [28]. Transporté par le nanovéhicule, Tet peut entrer dans les cellules tumorales via l'endocytose sans influence du microenvironnement tumoral, surmontant la résistance aux médicaments physiologique induite par le pH. La petite taille des nanovecteurs leur permet d'entrer dans la vasculature tumorale et de s'accumuler préférentiellement au site tumoral in vivo [29, 30].

En résumé, cette étude représente un exemple d'administration d'un médicament chimiothérapeutique avec un chémosensibilisateur simultanément. Transportés par les NP, les deux médicaments sont ciblés vers le site tumoral passivement, réduisant la toxicité systémique. De plus, les NP offrent une solution à la résistance physiologique aux médicaments en aidant le chémosensibilisateur à entrer dans les cellules tumorales plus et plus rapidement, ce qui joue un rôle important dans l'amélioration de l'efficacité de la chimiothérapie tumorale. Par conséquent, nous croyons que ces NP copolymères PEG-PCL pourraient être un vecteur prometteur pour la chimiothérapie combinée.

Conclusions

Basé sur nos études précédentes [8, 14, 16], cet article a investigué l'application des NP PEG-PCL/HO-PCL pour l'administration de la combinaison de deux médicaments avec des propriétés physicochimiques différentes. Pour les études in vitro, les NP ont exhibé un effet antitumorale supérieur avec une grande biocompatibilité. Une efficacité antitumorale améliorée a été observée dans le changement de volume tumoral et l'imagerie ¹⁸FDG-TEP/TDM quant à l'étude in vivo dans le modèle murin. Les souris dans le groupe NP ont également exhibé des effets secondaires réduits. De plus, le taux d'apoptose des cellules tumorales a été promu par les NP dans les études in vitro et in vivo. En résumé, ces NP copolymères pourraient être un vecteur prometteur pour l'administration des combinaisons Cisplatine-Tétradrine et d'autres combinaisons, avec un effet antitumorale amélioré et une toxicité réduite, pour le traitement du cancer.