Nanoparticules PLGA-lipide marquées au ¹³¹I pour délivrance ciblée de paclitaxel et imagerie dans la thérapie du mélanome

Résumé

Ici, des composites PLGA-lipide conjugués à l'acide folique (FA) (FA-PL) ont été développés comme nanotransporteurs pour la délivrance ciblée du médicament anticancéreux insoluble paclitaxel (PTX), donnant des nanoparticules FA-PLP. De plus, le ¹³¹I, comme traceur radioactif, a été utilisé pour marquer les nanoparticules FA-PLP (FA-PLP-¹³¹I) afin d'évaluer leur activité de capture cellulaire, circulation sanguine in vivo, et biodistribution. Les nanoparticules FA-PLP-¹³¹I avaient une morphologie sphérique avec grande stabilité, distribution de taille étroite (165,6 et 181,2 nm), et -22,1 mV potentiel zêta moyen. La microscopie confocale à balayage laser indiquait que la molécule cible FA favorise l'absorption de PLP-¹³¹I par cellules mélanome B16F10, confirmé par taux d'incorporation cellulaire via détection activité ¹³¹I par compteur gamma. FA-PLP-¹³¹I sans PTX (FA-PL-¹³¹I) montre cytotoxicité mineure, bonne biocompatibilité, tandis que FA-PLP-¹³¹I démontre suppression efficace viabilité cellulaire comparé PTX libre et PLP-¹³¹I. Après injection intraveineuse, la demi-vie circulation sanguine du PTX libre (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 h) prolongée à 18,5 ± 0,5 h par FA-PLP-¹³¹I. Par ciblage FA, l'absorption tumorale de FA-PLP-¹³¹I était ~4,41 et 12,8 fois supérieure à celle de PLP-¹³¹I et PTX libre-¹³¹I respectivement. De plus, après 40 jours traitement, FA-PLP-¹³¹I montrait effet inhibition tumorale amélioré comparé PTX libre et PLP-¹³¹I, sans rechute et sans toxicité systémique in vivo remarquable. Résultats démontrent que nanoparticules PLGA-lipide marquées ¹³¹I peuvent être simultanément appliquées pour délivrance ciblée médicament et suivi fiable médicaments in vivo.

Contexte

L'un des cancers cutanés les plus agressifs, le mélanome, provient de la transformation maligne des mélanocytes [1, 2]. Donnée sa rechute facile et haut potentiel métastatique, la survie à 5 ans des patients mélanome métastasé n'est que 10 %. À ce jour, le traitement le plus courant pour patients mélanome est chimiothérapie, accompagnée effets secondaires sévères indésirables, faible biodisponibilité, mauvaise sélectivité tumorale, et toxicité systémique limitant dose, posant défis majeurs chimiothérapie tumorale [3, 4].

Le paclitaxel (PTX), extrait végétal naturel des racines, branches, feuilles, écorce de taxus, genre conifères [5, 6], montre activité antitumorale efficace vers plusieurs tumeurs, dont carcinome ovarien et cancer poumon [7-9]. De plus, PTX rapporté efficace contre mélanome humain [10, 11]. Néanmoins, outre inconvénients médicaments chimiothérapeutiques, un mélange Cremophor EL et alcool déshydraté (1:1, v/v) utilisé en pratique clinique comme milieu dilution PTX, peut entraîner effets secondaires graves, dont hypersensibilité [12, 13]. Donc, développement nouvelles stratégies pour améliorer solubilité aqueuse et accumulation tumorale agents chimiothérapeutiques pour réduire exposition périphérique et minimiser toxicité in vivo est primordial. Le développement récent de nanotransporteurs biocompatibles fournit potentiel pour améliorer stabilité physiologique PTX [14-16]. De plus, conjugaison molécules cibles à ces nanotransporteurs permettrait délivrance sélective agents chimiothérapeutiques sites tumoraux avec exposition périphérique réduite via effet ciblé médié par récepteur surface cellule tumorale [17-19].

Ici, nous avons préparé un composite PLGA-lipide qui conjugue covalemment acide folique (FA: molécule ciblage tumeur) et encapsule PTX comme médicament chimiothérapeutique pour traitement mélanome. De plus, ¹³¹I, marqueur radioactif, utilisé pour radiomarquer nanoparticules PLGA-lipide pour évaluer clairement comportement in vivo. En raison de son émission bêta négative, demi-vie physique, et large gamme propriétés désintégration, ¹³¹I couramment utilisé comme radiomarqueur en clinique [20-22]. Morphologie, stabilité, dispersité des nanoparticules PLGA-lipide marquées ¹³¹I (FA-PLP-¹³¹I) évaluées in vitro. De plus, capture cellulaire, circulation sanguine, biodistribution FA-PLP-¹³¹I investiguées par mesure radioactivité ¹³¹I. Efficacité chimiothérapie ciblée FA-PLP-¹³¹I étudiée in vitro et in vivo. Résultats indiquent FA-PLP-¹³¹I peut être plateforme nanotechnologique versatile pour nanotransporteur médicament tumeur potentiel pour médicaments chimiothérapeutiques.

Méthodes

Matériaux

Poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLGA, PM: 5000–15 000, lactide:glycolide (50:50)) et chloramine-T achetés chez Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Na¹³¹I obtenu de Atomic Hitech (Beijing, Chine). PTX (99 %) et 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) achetés chez Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Lécithine soja 90–95 % phosphatidylcholine, 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-[folate (polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-FA), et 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-[carboxy (polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH) obtenus chez Avanti (Alabaster, AL, USA). Tous réactifs culture cellulaire Sigma Aldrich.

Préparation nanoparticules FA-PLP

Nanoparticules FA-PLP synthétisées par méthode d'auto-assemblage par nanoprécipitation [23]. En détail, 10 mg PTX dissous dans 1 mL éthanol et 2 mg PLGA dans 1 mL dichlorométhane. Après mélange, solution aqueuse éthanol lécithine/DSPE-PEG₂₀₀₀-FA (4:1) (4 % p/v) ajoutée goutte à goutte dans mélange pour 4 h agitation douce à 25 °C. Mélange filtré et lavé 3 fois eau déionisée avec tube centrifuge ultrafiltration Millipore pour éliminer médicament non encapsulé et solvant organique. Comme contrôle, nanoparticules sans greffage FA préparées même méthode, remplaçant DSPE-PEG₂₀₀₀-FA par DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH. Nanoparticules FA-PLP purifiées stockées 4 °C jusqu'à usage.

Préparation nanoparticules FA-PLP marquées ¹³¹I

Nanoparticules FA-PLP radioactives (FA-PLP-¹³¹I) préparées par méthode oxydation chloramine-T [24]. Mélange 1 mL FA-PLP (1 mg/mL), 500 µCi Na¹³¹I (radioactivité max greffable sur FA-PLP), 100 µL chloramine-T 5 mg/mL réagis dans tampon phosphate pH 7,5 10 min température ambiante. Réaction stoppée par ajout 200 µL métabisulfite sodium (5 mg/mL). ¹³¹I-PLP et ¹³¹I-PTX préparés même procédure. Purifiés tube centrifuge Millipore pour éliminer Na¹³¹I libre jusqu'à aucune activité gamma détectable dans filtrat. Rendement radiomarquage et pureté analysés compteur gamma (LKB gamma 1261; LKB Instruments).

Caractérisation

Spectres absorption UV-vis enregistrés spectrophotomètre UV-vis (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine). Images MET collectées Zeiss LIBRA 120 MET. Taille, potentiel zêta, indice polydispersité (IDP) détectés par diffusion dynamique lumière (DDL) analyse Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Photographies optiques appareil Nikon D3200.

Culture cellulaire

Ligne cellulaire mélanome souris B16F10 obtenue Banque Cellules Type Culture Collection Académie Chinoise Sciences (Shanghai, Chine) cultivée DMEM 10 % sérum fœtal bovin 100 U/mL pénicilline/streptomycine atmosphère humidifiée 5 % CO₂ 37 °C.

Essais incorporation in vitro

Essais incorporation in vitro temps-dépendants pour déterminer temps optimum efficacité liaison cellulaire composés ¹³¹I-marqués [25]. Cellules B16F10 ensemencées plaques 24 puits 1 × 10⁵ cellules/puits cultivées confluence. Échantillons radioiodinés (¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I) préparés milieu DMEM ajoutés puits culture séparément. Après incubation 0,5, 1, 2, 4, 6 h, cellules lavées PBS 3 fois radioactivité mesurée compteur gamma (Science and Technology Institute of China, Jia Branch Innovation Co., Ltd.). Valeurs incorporation (%) calculées comme littérature précédente [25]. De plus, nanoparticules marquées colorant fluorescent fluorescéine isothiocyanate (FITC, Sigma) incubées cellules B16F10. Images fluorescence capturées microscope confocal balayage laser commercial (FV1200, Olympus, Tokyo, Japon).

Essai cytotoxicité in vitro

Test viabilité cellulaire MTT utilisé étudier cytotoxicité nanotransporteurs témoins PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, ainsi que PTX libre, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I, contre cellules B16F10. Brièvement, cellules B16F10 plaquées plaques 96 puits 24 h exposées PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I (0–100 µg/mL PLGA-lipide), ou PTX libre, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I (concentrations 0–40 µg/mL) 24 h. Expérience triplicata. Données moyenne ± SD.

Modèle animal

Souris Balb/c 3–5 semaines achetées Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Toutes expériences animales approuvées Comité Soins Utilisation Animaux Université Fudan, conforme Guide NIH Soins Utilisation Animaux Laboratoire.

Cellules B16F10 (1 × 10⁶) en PBS injectées sous-cutané flanc droit souris. Volume tumeur croissante mesuré pied à coulisse, volume calculé formule : volume = (longueur × largeur²)/2. Quand volume tumeur ~80 mm³, souris randomisées groupes expérimentaux.

Étude circulation sanguine et biodistribution

Souris Balb/c saines injectées intraveineusement PTX-¹³¹I et FA-PLP-¹³¹I (100 µL 10 µCi par souris, 5 mg/kg). Circulation sanguine mesurée prélevant ~10 µL sang queue souris. Radioactivité sang mesurée compteur gamma. Pour détecter biodistribution nanoparticules, souris porteuses tumeur B16F10 injectées PTX-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I même dose sacrifiées 24 h post-injection. Organes majeurs pesés collectés comptage gamma.

Chimiothérapie tumeur in vivo

Souris Balb/c porteuses tumeurs B16F10 injectées 150 µL salin, PTX libre, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I (même concentration PTX, 5 mg/kg). Taille tumeur et poids corporel mesurés pied à coulisse tous les 4 jours. Volumes tumeur relatifs calculés V/V₀ (V₀ volume tumeur début traitement). Après ~40 jours traitement, souris sacrifiées organes majeurs collectés, fixés formol 4 %, inclus paraffine, tranchés, colorés hématoxyline-éosine, examinés microscope numérique.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation nanoparticules FA-PLP marquées ¹³¹I

Schéma synthèse FA-PLP-¹³¹I montré Fig. 1. En bref, nanoparticules FA-PLP synthétisées auto-assemblage nanoprécipitation [23] et FA-PLP radioactives (FA-PLP-¹³¹I) préparées oxydation chloramine-T [24]. PTX encapsulé composite PLGA-lipide, greffé FA covalent surface coque via PEGylation. Finalement ¹³¹I greffé surface externe nanoparticule. Images MET indiquaient morphologie sphérique distribution taille étroite (165,6 à 181,2 nm), confirmée DLS (Fig. 2a, b). Potentiel zêta -39,1 à -3,2 mV (Fig. 2c). Spectres UV-vis PTX libre et FA-PLP-¹³¹I (même concentration PTX) même pic caractéristique 233 nm (Fig. 2d), indiquant PTX encapsulé dans FA-PLP-¹³¹I et encapsulation n'influence pas intensité absorbance PTX. Après calcul, efficacité encapsulation PTX dans FA-PLP-¹³¹I = 56,35 ± 1,6 %. Rendements radiomarquage PTX-¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I : 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5, 54,8 ± 2,7 respectivement.

Stabilité essentielle application biomédicale nanoparticules [26]. Après 4 semaines stockage, FA-PLP-¹³¹I dissous eau, milieu cellulaire, sérum fœtal bovin, PBS n'affichait aucun changement taille moyenne, potentiel zêta, IDP (Fig. 3a–c), indiquant grande stabilité et dispersité. De plus, stabilité radiomarquage FA-PLP-¹³¹I détectée plasma souris 37 °C (Fig. 3d), montrant <15 % dé-iodation dans 7 jours.

Capture cellulaire in vitro

Figure 4 montre incorporation in vitro temps-dépendante ¹³¹I, PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I cellules B16F10 mesurée compteur gamma. FA-PLP-¹³¹I et FA-PL-¹³¹I montraient valeurs incorporation plus hautes que tous points temps testés, augmentant avec temps. Valeurs incorporation FA-PLP-¹³¹I à 6 h étaient 3,12 et 23,4 fois supérieures à ¹³¹I et PLP-¹³¹I, accord avec images microscopie confocale cellules B16F10 incubées nanoparticules FA-PLP-¹³¹I et PLP-¹³¹I marquées FITC (Fichier additionnel 1: Figure S1). Résultats démontrent forte capture cellulaire FA-PLP-¹³¹I, probablement due effet ciblage FA médié sur cellules B16F10.

Cytotoxicité in vitro

Cytotoxicité nanotransporteurs témoins PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I testée essai MTT. Cellules traitées PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I 24 h viabilité similaire témoin (Fig. 5a), indiquant bonne biocompatibilité. De plus, FA-PLP-¹³¹I bien plus efficace supprimer prolifération B16F10 que PTX libre et PLP-¹³¹I même concentration PTX (Fig. 5b), indiquant excellente chimiothérapie ciblée cellulaire. Résultats démontrent FA-PLP-¹³¹I fort effet chimiothérapeutique sans radiotoxicité ni cytotoxicité.

Étude circulation sanguine et biodistribution

Radiomarquage rapporté plus fiable imagerie fluorescence pour suivi quantitatif précis nanoparticules in vivo [27, 28]. Nanoparticules FA-PLP marquées ¹³¹I préparées investiguer comportement in vivo, circulation sanguine, biodistribution, mesurées compteur gamma. Demi-vie circulation sanguine PTX libre (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 h) prolongée à 18,5 ± 0,5 h par FA-PLP-¹³¹I (Fig. 6a) grâce encapsulation nanoparticule, favorable accumulation ciblée tumeur [29-31]. Ensuite, biodistribution PTX-¹³¹I libre, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I souris porteuses tumeur B16F10 à 1 jour post-injection investiguée (Fig. 6b). FA-PLP-¹³¹I et FA-PL-¹³¹I exhibaient enhancement évident absorption tumorale, 4,41 et 12,8 fois celle PLP-¹³¹I et PTX-¹³¹I libre respectivement, probablement dû circulation sanguine prolongée FA-PLP-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I et effet ciblage FA. En plus, foie et rate aussi absorption relativement haute due métabolisme nanoparticules, organes métaboliques normaux [32, 33].

Chimiothérapie tumeur in vivo

Souris traitées PTX libre, PLP-¹³¹I, FA-PLP-¹³¹I exhibaient inhibition croissance tumeur comparé groupe témoin salin (Fig. 7a). Globalement, FA-PLP-¹³¹I plus efficace suppression croissance tumeur sans rechute comparé tous groupes traités après ~40 jours traitement. Résultats attendus considérant circulation sanguine significativement prolongée FA-PLP-¹³¹I et donc capacité promouvoir accumulation ciblée tumeur médiée FA. De plus, accumulation ciblée tumeur aussi réduction exposition périphérique PTX, minimisant toxicité systémique. Comme attendu, sur tout processus traitement, aucune perte notable poids corporel (Fig. 7b), organes majeurs cœur, foie, rate, poumon, rein sans lésions histologiques évidentes aucun groupe (Fig. 7c).

Conclusions

En résumé, nous avons synthétisé des nanoparticules PLGA-lipide marquées ¹³¹I comme transporteurs médicament pour chimiothérapie ciblée mélanome. En mesurant radioactivité ¹³¹I, comportements in vitro et in vivo nanoparticules FA-PLP-¹³¹I étudiés. FA-PLP-¹³¹I obtenu montrait grande dispersité et stabilité colloïdale et radiomarquage. Nanotransporteurs témoins PL-¹³¹I, FA-PL-¹³¹I aussi bonne biocompatibilité. Après encapsulation PTX, FA-PLP-¹³¹I plus efficace supprimer prolifération B16F10 sans cytotoxicité, attribué effet ciblage FA. De plus, FA-PLP-¹³¹I prolongeait significativement circulation sanguine PTX et accumulait efficacement région tumeur ciblée. Ainsi, FA-PLP-¹³¹I excellente inhibition croissance tumeur et grande biocompatibilité in vivo. Résultats soulignent potentiel prometteur ces nanotransporteurs FA-PLP-¹³¹I versatiles comme agents suivi médicament fiables et application thérapie ciblée tumeur.