Préparation optimisée et caractérisation physicochimique de nanoliposomes à double médicament encapsulant l'erlotinib et la doxorubicine

Résumé

La chimiothérapie combinatoire synergique repose sur l'administration de médicaments aux mécanismes distincts de manière coordonnée. Nous présentons une plateforme de nanoliposomes non PEGylés, reproductible, qui co-encapsule l'erlotinib (ERL) dans la bicouche lipidique et la doxorubicine (DOX) dans le cœur aqueux. Les lipides (DSPC, cholestérol, POPG) ont été assemblés par hydratation de film mince, suivie de sonication par sonde pour obtenir des vésicules sous-200 nm. La DOX a été chargée en utilisant des gradients de sulfate d'ammonium (AS) ou de pH ; le gradient AS a donné >90 % d'efficacité d'encapsulation (EE) de DOX versus ~17 % pour la méthode pH. L'EE de l'ERL a atteint 30 %. La microscopie électronique à transmission a révélé des cœurs cristallins DOX-sulfate et des cristaux d'ERL moins ordonnés dans la bicouche. Les vésicules sont restées stables en taille de 4 à 37 °C et ont libéré l'ERL rapidement (<8 h) tandis que la DOX se libérait lentement, permettant un profil synergique à libération différentielle dans le temps. Ces résultats établissent une plateforme robuste de nanoliposomes à double médicament adaptée aux études translationnelles.

Contexte

Les cancers du sein triple-négatifs et autres tumeurs réfractaires résistent aux monothérapies standards en raison de voies de dommages à l'ADN et de survie entrelacées. Des régimes combinés qui préparent d'abord les tumeurs avec un inhibiteur de facteur de croissance puis les exposent à un agent génotoxique ont montré une synergie préclinique. Pour traduire de tels effets in vitro cliniquement, un véhicule d'administration qui co-délivre les deux agents et synchronise leur libération est essentiel, surtout quand la pharmacocinétique diffère nettement.

Les nanoliposomes — vésicules à bicouche phospholipidique — encapsulent naturellement les médicaments hydrophiles dans leur cœur et les médicaments hydrophobes dans leur membrane, réalisant une co-localisation et une accumulation tumorale accrue via l'effet de perméabilité et rétention accrue (EPR). Cependant, des protocoles de fabrication fiables, reproductibles et des données physicochimiques complètes restent rares, limitant la traduction clinique.

Méthodes

Matériaux

DSPC, POPG, cholestérol (Avanti Polar Lipids), DOX·HCl et ERL base libre (Boryung Co. / Shanghai Send), sulfate d'ammonium, acide citrique (Daejung), et réactifs (Sigma-Aldrich).

Préparation des nanoliposomes à double médicament

L'ERL a été incorporé dans un mélange 27:20:3 (p/p/p) DSPC:cholestérol:POPG (3:50 p/p médicament) et séché en film mince. L'hydratation avec 250–400 mM AS (ou 300 mM acide citrique, pH 3,9) à 65 °C a produit des vésicules multilamellaires. La sonication par sonde (5 s marche/2 s arrêt, 20 % amplitude, 36 J/impulsion) dans un bain eau-glace a réduit la taille à ~140 nm. L'AS en excès a été éliminé par dialyse overnight contre PBS (pH 7,4).

La DOX (1,5 mg/mL, 2 mL) a été ajoutée à 8 mL de liposomes chargés en ERL et chargée soit par gradient de pH soit par gradient AS. Quatre protocoles de chargement DOX (incubation, sonication, équilibration, dialyse) ont été évalués pour optimiser l'EE.

Caractérisation

La diffusion dynamique de la lumière a mesuré la taille et la polydispersité ; le MET (JEM-2100F) a visualisé la morphologie et les structures cristallines. L'efficacité d'encapsulation a été calculée à partir du médicament libéré par Triton X-100 et quantifié par UV-Vis (ERL) ou fluorescence (DOX). La libération in vitro a employé des cassettes de dialyse dans PBS (pH 7,4) à 37 °C. La stabilité physique a été évaluée en surveillant la taille à 4, 25 et 37 °C sur 21 jours.

Résultats et discussion

Contrôle de la taille par sonication

Les liposomes ERL non traités étaient ~760 nm, rétrécissant à ~222 nm en 10 min de sonication par sonde ; une sonication supplémentaire n'apportait pas de changements significatifs. La sonication par bain d'eau atteignait une réduction similaire plus rapidement mais augmentait l'échauffement, donc le refroidissement eau-glace était préféré. Les liposomes post-dialyse avaient une moyenne de 140 nm.

Efficacité de chargement de la DOX

Le chargement par gradient AS a produit 90 %+ d'EE, dépassant de loin les ~17 % du gradient pH. Une concentration de 350 mM AS a maximisé l'EE et minimisé la variabilité, probablement en raison d'une cristallisation favorable DOX-sulfate. Parmi les quatre protocoles, la combinaison d'incubation à 65 °C, 15 min sonication par sonde et 30 min équilibration à température ambiante (Groupe 2) a donné la plus haute EE (~98 %). Une sonication plus longue ou une équilibration retardée réduisaient l'EE, vraisemblablement par fuite d'AS.

Morphologie et cristallinité

Les images MET ont confirmé des vésicules sphériques <200 nm. Le MET haute résolution et la diffraction d'électrons en zone sélectionnée (SAED) ont révélé des cristaux de DOX-sulfate hautement ordonnés dans le cœur et des cristaux d'ERL moins ordonnés à la surface externe de la bicouche. Les contrôles à médicament unique affichaient des motifs cristallins similaires, validant l'intégrité structurelle du système à double médicament.

Stabilité physique

Les changements de diamètre étaient <15 % à 4 °C, <10 % à 25 °C et <6 % à 37 °C sur 21 jours, indiquant une stabilité robuste. La haute température de transition de phase du DSPC et sa teneur de 40 % en cholestérol ont probablement contribué à cette résilience.

Libération différentielle dans le temps

Dans PBS, l'ERL a libéré ~65 % à 48 h, tandis que la DOX a libéré ~30 %. La fenêtre initiale de 8 h a montré >4 % h⁻¹ de libération d'ERL versus <1 % h⁻¹ pour DOX, confirmant un profil de libération séquentielle propice à l'action synergique.

Conclusions

Nous avons établi une plateforme de nanoliposomes non PEGylés, scalable, qui co-encapsule ERL et DOX avec haute EE et taille contrôlée. La sonication par sonde après hydratation du film réduit optimalement le diamètre des vésicules. Le chargement par gradient AS, surtout avec 350 mM AS et une brève équilibration post-sonication, donne la plus haute EE de DOX. Le MET et SAED confirment des arrangements cristallins distincts pour chaque médicament. Les vésicules sont physiquement stables et présentent une libération différentielle dans le temps d'ERL et DOX, les positionnant comme véhicule prometteur pour la thérapie cancéreuse synergique.

Abréviations

DOX

Doxorubicine

DSPC

1,2-Distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine

EE

Efficacité d'encapsulation

EPR

Perméabilité et rétention accrues

ERL

Erlotinib

PK

Pharmacocinétique

POPG

1-Palmitoyl-2-oléoil-sn-glycéro-3-phospho-(1′-rac-glycérol) (sel de sodium)

SAED

Diffraction d'électrons en zone sélectionnée

SEM

Erreur standard de la moyenne

Tc

Température de transition de phase

TEM

Microscopie électronique à transmission