Points de carbone fluorescents verts abordables : bioimagerie améliorée et administration ciblée de médicaments

Résumé

Des points de carbone piégeant la doxorubicine (DOX-CDs) ont été préparés pour la bioimagerie et l'administration intracellulaire améliorée de médicaments. Les CDs ont été synthétisés par méthode hydrothermale utilisant du citrate et de l'urée sous 200 °C pendant 1 h. Ensuite, la DOX a été conjuguée avec succès sur les CDs via des interactions physico-chimiques. Les DOX-CDs présentaient une bonne structure cristalline, une stabilité aqueuse remarquable, d'excellentes propriétés de photoluminescence et un rendement quantique élevé de 93 %. Les images fluorescentes révélaient que les DOX-CDs pouvaient être facilement internalisés par les cellules cancéreuses pour le marquage cellulaire. De plus, un comportement de libération de DOX assisté par le pH endo-lysosomal a été observé, et la cytotoxicité des DOX-CDs confirmée par test MTS contre les cellules de cancer de l'ovaire HO-8910. En outre, les CDs indiquaient un signal fluorescent brillant dans le test d'imagerie animale et démontraient une faible toxicité après administration pendant 7 et 21 jours. Par conséquent, les CDs préparés pourraient être une sonde d'imagerie prometteuse pour l'imagerie biomédicale et l'administration intracellulaire de médicaments.

Introduction

La doxorubicine (DOX) est un médicament chimiothérapeutique anthracycline largement utilisé pour traiter plusieurs cancers : sein, poumon, gastrique, ovarien, thyroïde, myélome multiple, sarcome et cancers pédiatriques. Son mécanisme d'action anticancéreuse est considéré comme interférant avec la synthèse et la réparation de l'ADN. Par conséquent, la DOX doit être transportée à travers la membrane cellulaire jusqu'au noyau pour perturber la synthèse d'ADN pendant le traitement. Cependant, la DOX libre ne peut pas facilement atteindre le noyau et induirait une cardiotoxicité in vivo sévère, entravant son application comme thérapie anticancéreuse.

Récemment, les nanovecteurs multifonctionnels tels que liposomes, micelles, nanoémulsions, nanoparticules polymères et autres nanoparticules ont attiré une attention considérable pour leur importance dans l'administration de médicaments anticancéreux. Parmi eux, en tant que nouveau type de la famille des points quantiques, le point quantique de carbone (CD) a suscité un énorme intérêt mondial depuis sa découverte en 2004. En particulier, les CDs fluorescents sont devenus le choix privilégié pour l'imagerie cellulaire, la photocatalyse, l'administration de médicaments, la détection de polluants et d'ions métalliques lourds, et les équipements photoélectriques grâce à leurs propriétés supérieures : poids et taille quasi-nuls (< 10 nm), haute photostabilité, spectres d'excitation larges et continus, longueur d'onde ajustable, biocompatibilité satisfaisante, faible toxicité et excellente performance de fluorescence. Par exemple, Yang et al. ont couplé avec succès la DOX aux CDs pour un traitement anticancéreux amélioré, impliquant que les CDs ont une grande importance pour l'administration de médicaments ciblant le noyau.

Précédemment, diverses techniques ont été proposées pour préparer les CDs incluant de nombreux matériaux biomasse, carbonisation, passivation et fonctionnalisation de surface. En détail, on peut classer en deux méthodes principales. L'une est l'approche « top-down » : décharge d'arc, ablation laser, gravure électrochimique, méthode d'oxydation, qui consiste à briser la structure de carbone à grande échelle en nanoparticules de carbone. L'autre est la méthode « bottom-up », qui synthétise les points de carbone à partir de précurseurs moléculaires, incluant principalement l'approche hydrothermale, la méthode ultrasonique et la synthèse assistée par micro-ondes. Cependant, ces méthodes sont limitées en raison de leur processus de synthèse compliqué, procédure chronophage, exigences de fabrication strictes et matières premières coûteuses. De plus, l'utilisation de solvants organiques comme agents de passivation peut augmenter la toxicité des CDs. Par ailleurs, la plupart des CDs rapportés émettent une fluorescence bleue sous excitation UV, ce qui entrave sérieusement leur potentiel en imagerie biomédicale en raison de l'autofluorescence tissulaire forte interférant.

Ici, nous avons synthétisé des CDs fluorescents verts via une pyrolyse thermique contrôlée en une étape, verte et efficace, de citrate de sodium dihydraté et d'urée. La DOX a été conjuguée de manière non-covalente à la surface des CDs préparés pour l'administration de médicaments par interaction hydrophobe, interaction électrostatique et empilement π-π. La morphologie et la structure des CDs ont été étudiées par microscopie électronique en transmission (MET) et analyse de diffraction des rayons X. Les propriétés optiques ont été évaluées par spectromètre UV-Vis et spectres d'émission de photoluminescence (PL). La libération soutenue du médicament a été réalisée par méthode de dialyse. L'internalisation cellulaire et la distribution intracellulaire des DOX-CDs ont été étudiées par microscopie à fluorescence. L'effet anticancéreur des DOX-CDs a été évalué par test MTS standard. L'imagerie in vivo des CDs a été réalisée sur souris nude Balb/c. Enfin, la toxicité à long terme des CDs a été étudiée par analyse histologique. Par conséquent, les CDs préparés seraient un agent potentiel pour l'imagerie in vivo et l'administration ciblée de médicaments.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Citrate de sodium dihydraté, urée, L-arginine, éthylènediamine acétone, sulfate de quinine, tampon phosphate salin (PBS), acide acétique, phosphate d'hydrogène disodique, paraformaldéhyde provenaient de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd (Shanghai, Chine). Kit MTS de dosage colorimétrique de prolifération cellulaire, milieu DMEM/glucose élevé, solution pénicilline-streptomycine, solution trypsine-EDTA provenaient de Beyotime Biotechnology Co. Ltd (Shanghai, Chine). Sérum fœtal bovin (FBS) provenait de Tianhang Biotechnology Co. Ltd (Hangzhou, Chine). Les cellules de cancer de l'ovaire HO-8910 et cellules endothéliales de veine ombilicale humaine EA.hy926 provenaient de l'Institut de nutrition et santé de Shanghai, Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Chlorhydrate de doxorubicine (DOX) provenait de Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine). Les poches de dialyse (PMCO = 1000 Da) provenaient de SpectrumLabs (Los Angeles, CA, USA).

Synthèse des CDs et DOX-CDs

Brièvement, le citrate de sodium dihydraté (0,2 mmol) et l'urée (5 mmol) ont d'abord été dissous dans 1 mL d'eau DI. Le mélange a été transféré dans un récipient en verre et carbonisé à 200 °C pendant 1 h. Ensuite, 1 mL d'eau DI et d'acétone (v/v, 1/3) ont été ajoutés et centrifugés à 10000 tr/min pendant 10 min, trois fois.

La DOX a été conjuguée sur les CDs par interaction non-covalente. Brièvement, DOX·HCl (0,5 mg) a été ajouté à 5 mL de CDs (5 mg/mL) et agité pendant 48 h dans l'obscurité. La solution résultante a été dialysée contre l'eau DI dans une poche de dialyse (PMCO = 1000 Da) pendant 24 h pour obtenir les DOX-CDs. Finalement, les DOX-CDs ont été lyophilisés et stockés à 4 °C.

Caractérisation des CDs et DOX-CDs

La morphologie de taille des CDs a été caractérisée par MET (FEI Tecnai G2 Spirit). Les mesures d'émission PL ont été effectuées sur un spectrofluorimètre LS55 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Le rendement quantique (QY) des CDs a été déterminé en utilisant une solution de sulfate de quinine dans H₂SO₄ comme référence. La structure cristalline a été observée par un spectrophotomètre infrarouge à transformée de Fourier Bruker Tensor27 (Pike Corporation, Madison, Wisconsin). La spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) a été réalisée avec un spectromètre ESCALAB250Xi (Thermo, USA). Le potentiel zêta a été mesuré avec un potentiomètre Zeta (Malvern Panalytical, Malvern, UK).

Étude de libération in vitro du médicament

La libération in vitro de DOX depuis les DOX-CDs a été étudiée en utilisant une poche de dialyse. Brièvement, les DOX-CDs étaient chargés dans la poche et immergés dans PBS (pH 7,4 et 5,0) respectivement, puis placés dans un incubateur agité (37 °C, 100 tr/min). À des temps prédéterminés, des échantillons de 0,5 mL étaient prélevés et remplacés par le même volume de PBS. La DOX libérée était enregistrée par intensité de fluorescence à 590 nm.

Test de cytotoxicité in vitro

La cytotoxicité cellulaire des DOX-CDs a été déterminée par test MTS contre les cellules de cancer de l'ovaire HO-8910 et cellules endothéliales EA.hy926. Brièvement, les cellules étaient ensemencées en plaque 96 puits à 0,5 × 10⁵ cellules/mL, maintenues 24 h pour l'adhésion. Ensuite, DOX-CDs à diverses concentrations étaient ajoutés par puits. Après 24 h d'incubation, le milieu était aspiré, et 90 µL de milieu et 10 µL de MTS étaient ajoutés par puits. Après 4 h, l'absorbance à 490 nm était mesurée avec un lecteur de microplaques (BioTek Epoch). Les viabilités cellulaires étaient exprimées en pourcentage de cellules survivantes, moyennes de mesures en triplicat.

Étude d'imagerie cellulaire in vitro

Les cellules HO-8910 étaient inoculées en plaque 6 puits et incubées à 37 °C pendant 24 h pour l'adhésion. Ensuite, les cellules étaient incubées avec DOX-CDs pour permettre l'internalisation. Après 4 h d'incubation, le milieu était retiré, les cellules lavées trois fois avec PBS froid et fixées avec 4% paraformaldéhyde pendant 10 min. Finalement, la morphologie et la distribution de fluorescence des cellules étaient visualisées par microscope à fluorescence (Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, Allemagne).

Imagerie in vivo

Les expériences animales étaient approuvées par le Comité de soins aux animaux de l'Université médicale de Xuzhou. Des souris nude Balb/c étaient utilisées pour évaluer le potentiel des CDs en imagerie fluorescente. Brièvement, les souris étaient injectées sous-cutanément avec une solution aqueuse de CDs (50 µL, 6 mg/mL) au site d'injection après injection intrapéritonéale de 2% pentobarbital pour l'anesthésie. De plus, la biodistribution des CDs dans le corps des souris était étudiée par injection via la veine caudale (5 mg/kg). Différents organes (cœur, rein, rate, foie, vessie) étaient prélevés pour évaluations de fluorescence à divers temps. L'imagerie de fluorescence animale était réalisée sur un système Tanon-5200Multi Gel, temps d'exposition 1,0 s pour toutes les images.

Étude de toxicité in vivo

Des souris Kunming (femelles, 7 semaines) étaient utilisées pour étudier la toxicité à long terme in vivo des CDs. Les souris étaient divisées aléatoirement en 2 groupes : CDs et groupe contrôle. Les souris étaient injectées avec PBS et CDs via veine caudale (6 mg/kg). Ensuite, les organes principaux (cœur, poumon, rein, foie, rate) étaient prélevés après 7 et 21 jours d'injection. Les organes étaient fixés au paraformaldéhyde 4%, coupés en tranches et colorés à l'hématoxyline-éosine (H&E). Finalement, les coupes histologiques étaient observées au microscope optique (Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, Allemagne).

Résultats et discussion

Caractérisation des CDs et DOX-CDs

Les CDs ont été préparés par stratégie en une étape utilisant citrate de sodium dihydraté et urée (ratio 1/25) à 200 °C pendant 1 h. La DOX a été conjuguée de manière covalente à la surface des CDs préparés pour l'administration de médicaments (Schéma 1). Comme montré sur l'image MET (Fig. 1a), les CDs présentaient une morphologie sphérique uniforme avec un diamètre moyen de 2,75 nm et une distribution de taille relativement étroite. De plus, la structure cristalline des CDs pouvait être observée par l'image MET haute résolution (Fig. 1a encart), indiquant une bonne cristallinité avec des franges de réseau visibles.

La structure chimique des CDs a été caractérisée par spectroscopie FTIR. Comme montré Fig. 1d, les pics nets à 3499 cm⁻¹ et 1729 cm⁻¹ étaient assignés à –OH et –COOH respectivement, tandis que ceux à 780 cm⁻¹ et 1372 cm⁻¹ pouvaient être attribués à N-H. On peut conclure que les groupes carboxyle et amino existent à la surface des points de carbone comme groupes fonctionnels et modifient les macromolécules biologiques avec des fonctions spécifiques, offrant une possibilité pour la recherche d'application future des points de carbone.

De plus, les propriétés optiques des CDs ont été étudiées par absorbance UV-Vis et spectroscopie PL. Comme montré Fig. 1c, les CDs présentaient un pic d'absorbance à 410 nm, et la DOX révélait un pic à 500 nm. Alors que les DOX-CDs maintenaient les pics d'absorbance des CDs et DOX à 410 nm et 500 nm respectivement, indiquant la conjugaison réussie de la DOX sur les CDs. De plus, comme montré dans l'encart Fig. 1c, la solution aqueuse de DOX-CDs révélait une couleur jaune clair transparente sous lumière naturelle et devenait vert brillant sous excitation UV. Le rendement quantique de fluorescence a été calculé à 93% avec le sulfate de quinine comme référence (QY = 54%). Quand les CDs étaient excités à des longueurs d'onde de 340 à 440 nm, le pic PL montrait presque aucun décalage, indiquant les propriétés d'émission indépendantes de l'excitation des CDs. La longueur d'onde d'excitation maximale et le pic PL des CDs sont 400 et 525 nm respectivement. Le comportement PL indépendant de l'excitation peut résulter des états de surface uniformes des CDs.

En outre, la composition élémentaire des CDs a été déterminée par XPS. Comme démontré Fig. 1f, le spectre XPS a déterminé que les CDs étaient principalement constitués de carbone (C), azote (N) et oxygène (O) avec ratios atomiques de 78,39%, 7,52% et 14,1% respectivement. Trois pics typiques de C₁s, N₁s et O₁s étaient observés à 284,8, 399,5 et 532,6 eV respectivement. Plus spécifiquement, le spectre C₁s montrait 3 pics à 284,8, 286,7 et 288,3 eV, représentant l'existence de liaisons C-C, C-N, C-O ou C=O séparément (Figure S1A). Le spectre haute résolution pour N₁s révélait un pic à 399,5 eV, assigné à C-N. De plus, le spectre O₁s confirmait la présence de liaisons C=O et C-O à 531,9 et 532,6 eV respectivement (Figure S1B).

L'intensité de fluorescence des CDs maintenait une stabilité merveilleuse à 4 °C et température ambiante (Figure S2A). La diminution d'intensité à 4 °C en 2 semaines était < 10%, négligeable. On s'attend donc à ce que les points de carbone possèdent une stabilité à long terme pour être utilisés comme agent d'imagerie biomédicale.

La Figure S2B illustrait que les intensités PL des CDs diminuaient en solutions aqueuses de pH élevé (> 10) ou bas (< 3). Néanmoins, l'intensité PL était stable en solution aqueuse pH 3-10. Les CDs préparés appliqués au biomarquage et bioimagerie sont requis pour être co-incubés avec les cellules, où le pH est autour du neutre (pH = 6-8), garantissant la stabilité PL. Théoriquement, cela indiquait que les CDs préparés peuvent émettre de la fluorescence avec haute stabilité dans les cellules pour le biomarquage et la bioimagerie.

Pour clarifier la stabilité fluorescente des CDs, un test de résistance au photoblanchiment a été effectué. Comme montré Figure S2C, comparés aux points quantiques (CdTe) et colorants fluorescents traditionnels (DAPI), les points de carbone présentaient non seulement une intensité de fluorescence plus élevée, mais aussi une excellente résistance au photoblanchiment. De plus, les CDs étaient bien dispersés dans diverses solutions : eau DI, PBS, milieu FBS, DMEM, CM1-1, s'attendant à une excellente stabilité dans le système sanguin (Figure S3).

Les CDs présentaient une valeur de potentiel zêta de −31,1 mV (Figure S4), attribuable à l'existence de groupes fonctionnels oxygène et carboxyle en surface. La DOX positivement chargée peut être physiquement attachée à la surface des CDs via interaction électrostatique avec le groupe carboxyle et interaction hydrophobe. Les DOX-CDs affichent une valeur de potentiel zêta de −9,7 mV, confirmant la fabrication des complexes DOX-CD. De plus, les CDs contiennent un réseau de carbone sp² qui peut charger la structure aromatique de la DOX via de fortes interactions π-π. L'efficacité d'encapsulation optimale et l'efficacité de chargement du médicament ont été étudiées par diverses concentrations de DOX. Comme démontré Figure S5, l'efficacité d'encapsulation maximale était de 50,82% avec efficacité de chargement correspondante de 6,82% à 0,1 mg/mL de DOX.

Libération in vitro de DOX depuis les DOX-CDs

Le comportement de libération in vitro de DOX depuis les DOX-CDs a été réalisé dans PBS pour étudier la libération sensible au pH. Pour démontrer ceci, les DOX-CDs étaient incubés à différentes valeurs de pH (7,4, 6,0, 5,0) et la libération de DOX surveillée. Comme montré Fig. 2, les DOX-CDs indiquaient des profils de libération soutenue aux pH 7,4, 6,0 et 5,0 pendant la période de repos. Les résultats indiquaient que la libération de DOX était pH-dépendante. Seulement 13% de DOX était libéré en 8 h à pH 7,4. Cependant, quand le pH était abaissé à 6,0 ou 5,0, plus de 35% ou 65% de DOX était libéré respectivement, suggérant la sensibilité des DOX-CDs au pH bas. Cela démontrait que la quantité de DOX libérée augmentait à pH plus bas, attribuée à l'augmentation de la protonation des groupes –NH₂ sur la DOX en environnement acide. Par conséquent, les DOX-CDs peuvent interdire la fuite prématurée de DOX pendant la circulation sanguine et améliorer la libération intracellulaire du médicament. Cela est d'un grand bénéfice pour le traitement efficace du cancer.

Test de cytotoxicité in vitro

La biocompatibilité est critique pour les CDs pour l'application en imagerie biomédicale et administration de médicaments. La cytotoxicité des CDs à diverses concentrations a été réalisée contre cellules HO-8910 et EA.hy926. Comme représenté Fig. 3a, les deux cellules maintenaient une viabilité élevée > 85% même à haute concentration de 5 mg/mL, indiquant l'excellente biocompatibilité et faible cytotoxicité des CDs.

Quand couplée avec DOX, les DOX-CDs présentaient une viabilité cellulaire dépendante de la concentration de DOX contre cellules HO-8910. Comme montré Fig. 3b, la viabilité des DOX-CDs était significativement plus basse que celle des CDs libres, surtout quand la concentration de DOX était > 0,05 mg/mL, indiquant l'excellent effet anticancéreux des DOX-CDs.

Étude d'internalisation et marquage cellulaire in vitro

Pour évaluer la capacité d'internalisation intracellulaire des DOX-CDs, l'imagerie cellulaire a été étudiée sur cellules HO-8910. Comme illustré Fig. 4, une fluorescence verte vive et rouge était observée dans les cellules cancéreuses attribuée à la présence des CDs et DOX respectivement. Particulièrement, le signal de fluorescence verte intense se localisait principalement dans le cytoplasme, indiquant la distribution intracellulaire des CDs. Inversement, le signal rouge était significativement plus fort dans les noyaux comparé au cytoplasme, suggérant que la DOX peut se déconjuguer des CDs et se déplacer directement vers les noyaux attribuable à son affinité élevée avec l'ADN. Cela s'explique par la valeur de pH bas (5,0) dans l'endosome et le lysosome qui pourrait assister la libération de DOX depuis les DOX-CDs. Par conséquent, les DOX-CDs pourraient être un agent prometteur pour le marquage cellulaire et l'administration intracellulaire de médicaments.

Étude d'imagerie animale in vivo

Une souris nude a été administrée sous-cutanément avec solution aqueuse de CDs (50 µL, 6 mg/mL). La souris a été anesthésiée par injection intrapéritonéale de 1% pentobarbital et imagée par système Tanon-5200Multi Gel sous lumière d'excitation 488 nm et filtre d'émission 535 nm. Comme montré Fig. 5a, une forte fluorescence verte était observée au site d'administration, impliquant que la fluorescence des CDs pouvait efficacement pénétrer la peau et les tissus des souris. De plus, la souris restait en bonne santé après les injections, indiquant que les CDs étaient d'excellente biocompatibilité et faible toxicité pour les animaux. Considérant tous les résultats, les CDs étaient capables comme sonde de luminescence exceptionnelle pour la bioimagerie in vitro et in vivo.

De plus, la biodistribution et la voie d'excrétion des CDs étaient réalisées par injection du nanoprobe via veine caudale. À différents temps (0, 0,5, 1, 3 h), divers organes étaient disséqués pour l'imagerie de fluorescence. Comme montré Fig. 5b, le rein et la vessie révélaient un signal de fluorescence beaucoup plus fort comparé aux autres organes (cœur, rate, foie) après injection. En outre, le signal dans le rein augmentait significativement dans les 0,5 h post-injection et diminuait progressivement après 1 h. Ensuite, le signal dans la vessie augmentait progressivement de 0,5 h à 1 h, indiquant que les CDs étaient délivrés à la vessie depuis le rein. Le résultat indiquait que les CDs pouvaient être excrétés et éliminés par le système rein-vessie.

Test de toxicité à long terme in vivo

De plus, une étude de toxicité à long terme in vivo a été réalisée pour investiguer pleinement le potentiel d'emploi des CDs en recherche clinique. Les souris Kunming étaient injectées via veine caudale avec PBS et CDs, et les organes majeurs (cœur, poumon, rein, foie, rate) prélevés après 7 et 21 jours pour analyse histologique. Ensuite, les figures des tissus histologiques étaient imagées par microscope pour évaluer la différence pathologique entre groupes expérimentaux et contrôle. Comme exhibé Fig. 6, aucun dommage d'organe remarquable ni lésion inflammatoire n'étaient observés dans les organes majeurs des animaux administrés aux CDs, suggérant que les CDs préparés étaient sûrs pour l'utilisation clinique et l'étude in vivo. Donc, les CDs verts synthétisés étaient biocompatibles comme biomarqueur et sonde de bioimagerie.

Conclusion

En conclusion, ce travail a démontré une préparation rentable de CDs fluorescents verts avec haut QY de 93% pour la bioimagerie et l'administration intracellulaire améliorée de médicaments. La DOX a été conjuguée avec succès sur les CDs pour former les DOX-CDs avec bonne structure cristalline, stabilité aqueuse remarquable et excellente propriété de photoluminescence. Les DOX-CDs pouvaient répondre aux environnements pH intracellulaires pour promouvoir la libération intracellulaire déclenchée par l'acide. Attribuable à la sensibilité au pH, les DOX-CDs montraient une inhibition efficace de la prolifération des cellules HO-8910. Les DOX-CDs présentaient une excellente capacité de marquage cellulaire et répondaient au pH endo-/lysosomal pour libérer la DOX dans les cellules. Les CDs agissaient comme sondes fluorescentes in vitro et in vivo. Finalement, aucun effet toxique remarquable n'était observé chez les souris traitées aux CDs par analyse histologique. Néanmoins, le travail démontrait que les CDs préparés par la méthode rentable pourraient avoir un grand potentiel en imagerie biomédicale et administration intracellulaire de médicaments.