Synthèse assistée par acide sulfurique de points de polymère carbonisés rouge brillant pour imagerie biologique à deux photons

Résumé

Des points de polymère carbonisés (PPC) à émission rouge ont été fabriqués à partir de solution aqueuse de p-phénylènediamine (p-PD) sous l'influence catalytique de l'acide sulfurique (H₂SO₄). Les PPC-SA résultants (diamètre moyen ≈5 nm) présentaient la photoluminescence la plus brillante parmi les acides testés, avec un rendement quantique (RQ) de 21,4 % dans l'eau et un rendement global de 16,5 %. L'excitation à 300–580 nm produisait systématiquement une émission à 600 nm, indépendante de la longueur d'onde d'excitation. Les calculs de théorie de la fonctionnelle de la densité indiquent que la croissance transversale des précurseurs protonés est énergétiquement favorisée, menant à la formation de PPC à l'échelle nanométrique. La photoluminescence à deux photons, émettant à 602 nm sous excitation laser femtoseconde 850 nm, a été démontrée pour l'imagerie de cellules HeLa, soulignant le potentiel des PPC-SA dans les applications biomédicales.

Contexte

Les points de carbone (PC) ont attiré un large intérêt en raison de leur excellente solubilité dans l'eau, stabilité optique, faible toxicité et synthèse rentable. Ils sont explorés dans les capteurs électrochimiques, l'imagerie biologique, la catalyse, les dispositifs électroluminescents et l'optoélectronique. Les voies bottom-up à partir de monomères organiques, polymères ou produits naturels sont préférées pour la production à grande échelle. Des groupes fonctionnels tels que –OH, –COOH, –C=O et –NH₂ subissent déshydratation et carbonisation à températures élevées pour produire des nanoparticules fluorescentes.

Les PC à émission rouge sont particulièrement précieux pour l'imagerie biologique en raison de leur pénétration tissulaire plus profonde et interférence de fond minimale. Cependant, la plupart des PC affichent une émission dépendante de l'excitation, rendant une source unique de photon rouge stable rare. Les isomères de phénylènediamine (o-, m-, p-) ont été utilisés pour générer des PC bleus, verts et rouges respectivement. Des travaux récents ont identifié les points à base de p-PD comme points de polymère carbonisés (PPC) en raison de leur émission indépendante de l'excitation.

Nous présentons ici une synthèse hydrothermale assistée par acide sulfurique, facile, à haut rendement, de PPC à émission rouge et démontrons leur capacité d'imagerie à deux photons dans les cellules HeLa.

Méthodes

Synthèse des PPC rouges à partir de systèmes p-PD assistés par acide

Nous avons étudié H₂SO₄, HCl et HClO₄ comme donneurs de protons, étiquetant les PPC résultants comme PPC-SA, PPC-HC et PPC-PA. Les variables de réaction — ratio acide/p-PD, concentration du précurseur, température et temps — ont été systématiquement optimisées. Après traitement hydrothermal (200 °C, 2 h), le produit a été purifié par hexane (élimination p-PD non réagi) et éthanol (élimination acide), suivi de centrifugation à 14 000 tr/min, filtration sur membrane 0,22 µm, et évaporation rotative optionnelle pour obtenir des poudres sèches.

Caractérisation et Mesures

Le MET haute résolution (JEM-2100, 200 kV) a évalué la morphologie et les franges de réseau. Les spectres FT-IR ont été enregistrés avec un spectromètre Prestige-21 utilisant des fenêtres KRS-5. Les spectres de fluorescence et UV-Vis ont été obtenus avec un spectrophotomètre F-2500 et un spectromètre Lambda 950 respectivement. L'émission à deux photons a été mesurée sur un spectrographe à fibre (QE65000, Ocean Optics) couplé à un laser femtoseconde. Les rendements quantiques ont été calculés en utilisant la Rhodamine B (RQ = 56 % dans l'éthanol) comme référence, suivant la procédure du Fichier Supplémentaire 1.

Méthodes de Calcul

Les calculs de théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) ont été effectués avec Gaussian 09 (B3LYP/6-311++G(d)) dans le modèle d'eau PCM pour évaluer l'énergétique des voies de croissance longitudinale et transversale.

Culture Cellulaire et Traitement

Des cellules HeLa (4 × 10⁴ cellules mL⁻¹) ont été ensemencées en DMEM (Gibco) et incubées à 37 °C avec 5 % CO₂ pendant 24 h. Les PPC-SA (40 µg mL⁻¹) ont été ajoutés pendant 12 h, suivis de lavages PBS. L'imagerie a été réalisée sur un microscope confocal utilisant un laser femtoseconde 850 nm (30 mW).

Résultats et Discussion

Optimisation de la préparation des PPC rouges

Tous les systèmes acides ont donné des PPC rouges à des températures supérieures à 180 °C (2 h). Des températures plus élevées (240 °C, 4–12 h) augmentaient la taille des particules et diminuaient la fluorescence. Les conditions optimales étaient 200 °C, 2 h, avec un ratio acide/p-PD de 1 pour H₂SO₄, et 3 pour HCl et HClO₄. La plage de concentration de p-PD (0,02–0,20 mol L⁻¹) était tolérante. Sous ces paramètres, les PPC-SA ont atteint un RQ de 21,4 % et un rendement de 16,5 %, surpassant les PPC-HC et PPC-PA.

Caractérisation MET et Analyse FT-IR

Le MET-HR a révélé des PPC sphériques monodisperses (diamètre moyen ≈5 nm) avec un espacement de réseau de 0,21 nm correspondant aux plans graphène (100). Les spectres FT-IR indiquaient une oxydation de surface plus élevée dans les PPC-SA, avec des caractéristiques –OH et –COOH prononcées et signaux –NH₂ réduits, suggérant une surface plus oxydée, hydrophile.

Mécanisme Proposé pour la Formation des PC

Les calculs DFT montrent que la croissance transversale (−1 406 kJ mol⁻¹) est significativement plus favorable que la croissance longitudinale (−616 kJ mol⁻¹), menant à des intermédiaires plans qui s'auto-assemblent en PPC sphériques.

Propriétés Optiques

Les PPC-SA présentent une forte absorption UV à 290 nm (π→π*), avec des bandes additionnelles à 430 et 510 nm (transitions phénazine-amine). Les spectres d'excitation culminent près de 580 nm, correspondant à l'émission 600 nm, et la fluorescence reste indépendante de l'excitation sur 220–580 nm, confirmant la nature PPC.

Imagerie Cellulaire

L'excitation à deux photons à 850 nm a produit une émission à 602 nm avant pulvérisation et 529 nm après, avec intensité accrue. Les images confocales de cellules HeLa incubées avec PPC-SA montraient une localisation cytoplasmique, avec une fluorescence plus forte dans le canal vert due à l'émission décalée vers le bleu.

Conclusions

Nous avons démontré une méthode hydrothermale simple, scalable, assistée par acide sulfurique pour produire des PPC rouges brillants (≈5 nm, RQ = 21,4 %, rendement = 16,5 %). Les PPC émettent à 600 nm sous excitation 300–580 nm, et à 602 nm sous excitation 850 nm à deux photons. Leur fluorescence indépendante de l'excitation, haute brillance et absorption cellulaire efficace en font des candidats prometteurs pour l'imagerie tissulaire profonde et autres applications bio.

Abréviations

PC :

Points de carbone

PPC :

Points de polymère carbonisés

PPC-HC :

PPC synthétisés à partir de p-PD avec assistance HCl

PPC-PA :

PPC synthétisés à partir de p-PD avec assistance HClO₄

PPC-SA :

PPC synthétisés à partir de p-PD avec assistance H₂SO₄

RQ :

Rendements quantiques

p-PD :

p-Phénylènediamine