Biocapteur ampérométrique de Matrix Metalloproteinase-7 amélioré par des nanocomposites de carbone Pd-Functionalized

Contexte

La métalloprotéinase-7 matricielle (MMP-7), une enzyme capable de dégrader la composition de la matrice extracellulaire [1], est mise en évidence pour son rôle pivot dans la progression tumorale et les métastases [2, 3]. Le contenu de MMP-7 dans les échantillons de sérum est associé à des métastases ganglionnaires chez les patients atteints de certains cancers, tels que le cancer des glandes salivaires [4], l'adénocarcinome du côlon [5] et le carcinome rénal de haut grade [6]. En raison de ses divers rôles dans les processus physiologiques, la détection hautement sensible et précise de la MMP-7 a attiré l'attention de la recherche intensive [7], conduisant au développement de plusieurs approches, notamment la colorimétrie [8], l'électrochimiluminescence (ECL) [9] et la fluorescence. analyse de transfert d'énergie de résonance (FRET) [10]. Néanmoins, la limite de détection (LOD) de ces approches est généralement de l'ordre du picogramme et, par conséquent, pas assez basse. Par rapport à ces méthodes, les biocapteurs électrochimiques offrent des capacités de détection de MMP-7 beaucoup plus avancées avec un LOD inférieur au niveau du femtogramme [11]. De plus, certaines méthodes analytiques ont été élaborées pour répondre au besoin urgent de détection électrochimique ultrasensible de MMP-7 à l'aide de tests électrochimiques en raison de leur faible coût et de leur miniaturisation [12].

Dans de nombreux protocoles électrochimiques, la réaction biocatalytique enzymatique est applicable dans l'amplification du signal pour favoriser les performances du biocapteur ampérométrique [13, 14]. Cependant, il était bien connu que l'enzyme, le catalyseur le plus largement utilisé dans les réactions catalytiques, présentait des lacunes évidentes à la fois en termes d'activité sensible à l'environnement et de faibles stabilités [15,16,17,18,19]. Par conséquent, le développement d'un catalyseur hautement efficace et stable est une priorité absolue dans la construction d'un test électrochimique ultrasensible pour la détection de MMP-7. Le Pd est un métal noble avec des propriétés catalytiques supérieures et possède une stabilité chimique élevée dans les réactions catalytiques [20, 21]. De plus, le matériau carboné peut agir comme un support inerte chimique dans les catalyseurs pour adsorber les métaux nobles et conserver les propriétés catalytiques [22, 23].

Compte tenu des situations ci-dessus, nous avons conçu un nanocomposite de carbone fonctionnalisé au Pd comme amplificateur d'impédance pour augmenter considérablement la sensibilité d'un dosage ampérométrique de MMP-7, qui a les deux fonctions suivantes. (1) Les nanosphères de carbone sont un matériau faiblement conducteur [24] ; (2) Les nanoparticules de Pd peuvent catalyser l'oxydation du 4-chloro-1-naphtol avec H₂ O₂ pour générer des précipitations insolubles in situ, formant des précipitations à haute résistance sur les électrodes [25]. Ces deux facteurs augmentent la résistivité et réduisent considérablement le courant, ce qui peut remarquablement améliorer la sensibilité du biocapteur pour avoir un faible LOD de 17,38 fg mL ⁻¹ . Le nanocomposite fonctionnalisé au Pd construit pour la réaction de précipitation catalytique est pratique dans les dosages ampérométriques de MMP-7 avec une sélectivité et une sensibilité élevées.

Méthodes

Matériel

HAuCl₄ ·3H₂ O, H₂ PtCl₄ , 4-CN, glucose, H₂ O₂ (30 %), la thrombine de sérum bovin (TBS) a été achetée chez Alfa Aesar (Tianjin, Chine). L'oxyde de graphène (GO) a été acheté auprès de JCNANO (Nanjing, Chine). L'albumine de sérum bovin (BSA, qualité standard) a été obtenue commercialement auprès de Beijing Xinjingke Biotechnologies Co., Ltd. (Beijing, Chine). Le peptide (NH₂ -KKKRPLALWRSCCC-SH) a été obtenu auprès de Science Peptide Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, Chine). L'énolase spécifique des neurones (NSE) et l'antigène spécifique de la prostate (PSA) ont été achetés auprès de Shanghai Linc-Bio Science Co. Ltd. (Shanghai). La matrice métalloprotéinase-2 (MMP-2) a été achetée auprès de Yeasen Biotechnologies Co., Ltd. (Shanghai, Chine). La MMP-7 a été fournie par Sino Biological Inc. (Pékin, Chine). Des échantillons cliniques de sérum humain ont été achetés par ZhongKe ChenYu Biotech (Beijing, Chine). Toutes les solutions aqueuses ont été préparées avec de l'eau ultrapure (résistivité> 18 MΩ cm). La solution tampon phosphate (PBS) contient 0,1 µM de KCl et 10 mM de tampon phosphate (pH = 7,4).

Appareil

La synthèse micro-ondes a été réalisée à travers le réacteur Microwave CEM Discover® SP (CEM, USA). Les images au microscope électronique à balayage (SEM) ont été obtenues en utilisant HITACHI S-4800 SEM (HITACHI, Japon). Les images au microscope électronique à transmission (MET) ont été obtenues sur HITACHI H7650 TEM (HITACHI, Japon). La spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDS) a été déterminée sur HITACHI SU8010 SEM (HITACHI, Japon). Toutes les mesures électrochimiques ont été effectuées sur la station de travail électrochimique CHI600 (Chenhua Instruments Co., Shanghai, Chine). Une électrode de carbone vitreux (GCE) (4 mm de diamètre) a été utilisée comme électrode de travail, un fil de platine et une électrode Ag/AgCl ont servi de contre-électrode et d'électrode de référence, ainsi un système à trois électrochimiques expérimental a été construit. Les images au microscope électronique à transmission (HR-TEM) à haute résolution ont été réalisées par Tecnai G ² F30 TEM sous 300 kV en accélération.

Synthèse des nanocomposites de carbone fonctionnalisés Pd

Des nanocomposites de carbone fonctionnalisés au Pd (Pd-CNC) ont été synthétisés selon une littérature précédemment rapportée [26]. En bref, 4 g de glucose ont été dissous dans 40 mL d'eau ultrapure pour former une solution limpide. La solution ci-dessus a ensuite été transférée dans un autoclave en acier inoxydable revêtu de téflon de 50 mL et maintenue à 170 °C pendant 5 h. Après réaction, la solution transparente vire au brun foncé. Les nanosphères de carbone obtenues ont été collectées par centrifugation et lavées plusieurs fois avec de l'eau ultrapure/éthanol. Les produits résultants ont été redisposés dans 8 mL d'eau ultrapure.

Pour fonctionnaliser des nanoparticules de Pd sur des nanosphères de carbone [24], 1 mL de suspension de nanosphères de carbone a été mélangé avec 25 μL de HPdCl₄ Solution. Le mélange a été mis à réagir dans un instrument de réaction à micro-ondes (250 W) à 100 °C pendant 15 min, puis a été refroidi naturellement à la température ambiante. Ensuite, les nanosphères de Pd-carbone obtenues ont été centrifugées, lavées à l'eau ultrapure et redisposées dans 1 mL d'eau ultrapure.

Pour éviter l'adsorption non spécifique de MMP-7, la BSA a été encore modifiée sur les nanosphères de Pd-carbone. La suspension de nanosphères a été agitée avec 100 μL de solution de BSA (1 % en poids) pendant 1 h à température ambiante. Après plusieurs étapes de centrifugation et de lavage, les nanosphères de Pd-carbone modifiées par BSA ont été redisposées dans de l'eau ultrapure et stockées à 4 °C pour d'autres expériences.

Électrodéposition Au-rGO sur GCE

Avant modification, le GCE a été poli avec une suspension d'alumine de 0,05 μm et lavé aux ultrasons dans de l'eau ultrapure et de l'éthanol, respectivement. La solution d'électrodéposition a été configurée par les étapes suivantes [27]. Tout d'abord, 8 mg de poudre de GO ont été dispersés dans 20 mL d'eau ultrapure sous sonication pendant 2 h. Ensuite, 200 μL HAuCl₄ solution (4 % en poids) a été ajoutée dans la suspension GO. Par la suite, l'électrodéposition d'Au-rGO sur GCE par technique de voltamétrie cyclique (CV) dans la plage entre 1,5 et - 1,5 V avec une vitesse de balayage de 50 mV s ^{− 1} dans la solution d'électrodéposition ci-dessus. Enfin, l'Au-rGO déposé GCE (Au-rGO/GCE) a été lavé à l'eau ultrapure pour éliminer la solution d'électrodéposition résiduelle, puis séché par soufflage à l'azote à température ambiante.

Fabrication du Biocapteur

Le Au-rGO/GCE a été incubé avec 40 μL de solution peptidique (50 μM) pendant 40 min à 37 °C. Par la suite, le peptide modifié sur le GCE a été activé avec 50 μL de solution de glutaraldéhyde (0,10 % en poids) pendant 30 min supplémentaires (peptides/Au-rGO/GCE). Ensuite, 20 μL de suspension de Pd-CNCs ont été déposés sur l'électrode modifiée par le peptide pendant 1 h (Pd-CNCs/peptides/Au-rGO/GCE). Après chaque étape de modification, l'électrode modifiée a été lavée à l'eau ultrapure.

Mesure électrochimique

Quatre-vingt microlitres de solution de MMP-7 (1 ng mL ⁻¹ ) a été incubée avec les Pd-CNCs/peptides/Au-rGO/GCE pendant 1 h à 37 °C et suffisamment lavée à l'eau ultrapure. Ensuite, 50 μL de solution 1,0 mM de 4-CN contenant 10 mM de H₂ O₂ a été abandonné pour procéder à la réaction de précipitation pendant 50 min. Enfin, la mesure de voltamétrie à onde carrée (SWV) a été réalisée de − 0,2 à 0,6 V en 5 mM [Fe(CN)₆ ] ^3−/4− solution tamponnée au phosphate (0,1 M, pH = 7,4) avec une amplitude d'impulsion de 25 mV et un potentiel d'augmentation de 4 mV s ⁻¹ .

Résultats et discussion

Principe du biocapteur de clivage peptidique

Le processus de construction du biocapteur basé sur le clivage peptidique est illustré dans le schéma 1. Tout d'abord, Au-rGO a été déposé sur l'électrode de carbone vitreux (GCE) par une méthode électrochimique, puis les peptides ont été immobilisés sur Au-rGO par liaison Au-S. Les Pd-CNC ont été composées en tant qu'amplificateur catalytique et le glutaraldéhyde a été sélectionné comme lieur chimique entre le peptide et les amplificateurs. 4-CN et H₂ O₂ ont été utilisés comme substrats de précipitation catalysés pour améliorer l'impédance. En particulier, la MMP-7 a été choisie comme enzyme de clivage peptidique entre l'alanine (A) et la leucine (L) dans les peptides [8], ce qui a provoqué un changement de signal de courant indistinct mesuré par SWV. L'électrodéposition d'Au-rGO sur le GCE présente deux avantages :(1) Au-rGO peut améliorer efficacement la conductivité de l'interface de détection ; et (2) il permet aux sites d'immobiliser les peptides. Profitant de la haute impédance et des performances catalytiques des Pd-CNC, ΔI a ensuite été amplifié en remplaçant les Pd-CNC par le clivage du peptide spécifique (NH2-KKKRPLALWRSCCC-SH). Ce phénomène est contribué à la mauvaise conductivité électrique des Pd-CNC et à l'impédance élevée des précipitations générées par l'oxydation du 4-CN avec H₂ O₂ catalysé par les Pd-CNC.

Illustration schématique de la nanosphère de carbone fonctionnalisée au Pd en tant qu'amplificateur d'impédance pour le dosage ampérométrique de MMP-7

La réaction de précipitation catalytique sur le GCE a été davantage caractérisée par microscopie électronique à balayage (MEB) en incubant des Pd-CNC à la surface des peptides/Au-rGO/GCE (Fig. 1a). Les Pd-CNC ont été recouvertes d'une couche insoluble après la réaction de précipitation, ce qui indique que la couche insoluble à faible conductivité s'est formée sur l'électrode modifiée (Fig. 1b). Par conséquent, un biocapteur pour la détection ultrasensible de MMP-7 a été établi avec succès à partir de l'amplification de sensibilité attirée à la fois par le clivage peptidique et la précipitation catalytique.

Images SEM de Pd-CNCs/peptides/Au-rGO/GCE (a ) traité par réaction de précipitation catalytique (b )

Caractérisation des Pd-CNC

Par une méthode hydrothermale typique, des Pd-CNC homogènes ont été préparées avec succès. Les morphologies des nanosphères de carbone, des nanosphères de Pd-carbone et des Pd-CNC ont été caractérisées par microscopie électronique à transmission (MET) et spectrométrie de rayons X à dispersion d'énergie (EDS). Des nanoparticules de Pd ont été formées et distribuées sur les nanosphères de carbone à la suite de la réaction aux micro-ondes (Fig. 2b), démontrant la préparation réussie de nanosphères de Pd-carbone d'un diamètre de 150 nm (Fig. 2a). Les morphologies des Pd-CNC sont présentées sur la figure 2c. Les résultats de l'EDS confirment les compositions chimiques des nanoparticules de carbone, des nanosphères de Pd-carbone et des Pd-CNC, ce qui montre que les nanoparticules de carbone contiennent du C et O (Fig. 2d). Après la fonctionnalisation des nanoparticules de Pd, le Pd existait également dans les spectres des nanosphères de Pd-carbone (Fig. 2e), tandis que S et N trouvés dans les spectres des Pd-CNC proviennent de BSA, qui a été utilisé pour bloquer les nanosphères de Pd-carbone ( 2f). Ces résultats révèlent intuitivement la synthèse réussie des activateurs catalytiques Pd-CNC. Les images HR-TEM de nanosphères de Pd-carbone (Fig. 3a) illustrent que les nanoparticules de Pd fonctionnalisées (Fig. 3b) sont en phase cubique centre-face (FCC) avec un plan de réseau observable (1,1,1) (Fig. 3c). Les images de transformation de Fourier rapide (FFT) correspondantes (Fig. 3d) soutiennent également la nature cristalline FCC des nanoparticules de Pd.

Micrographies MET de nanosphère de carbone (a ), nanosphères de Pd-carbone (b ) et Pd-CNC (c ) EDS de nanosphère de carbone (d ), nanosphères de Pd-carbone (e ) et Pd-CNC (f )

Images HR-TEM de nanosphères de Pd-carbone (a ), des images agrandies de nanoparticules de Pd (b, c ) et images FFT de nanoparticules de Pd (d )

Caractérisation des procédures de construction du biocapteur

Les procédures de construction du biocapteur ont été surveillées par des mesures SWV (Fig. 4a) et par spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) (Fig. 4b). Par rapport au signal de courant du GCE nu (courbe GCE nu), le courant de crête dans la plage de potentiel a augmenté jusqu'à environ 420 μA (courbe Au-rGO/GCE) après l'électrodéposition de Au-rGO, ce qui peut être attribué à l'excellente conductivité de Au-rGO. Ensuite, le pic de courant de signal a diminué après l'immobilisation des peptides sur l'électrode (courbe peptides) et a été encore réduit après la liaison entre les peptides et les Pd-CNC en raison de la haute impédance des peptides et des activateurs (courbe Pd-CNC). Après incubation avec la MMP-7, le courant de crête a augmenté (clivage de la courbe MMP-7), ce qui peut être causé par le clivage spécifique des peptides par la MMP-7 et l'élimination partielle des activateurs de la surface de l'électrode. Dans les mêmes conditions, le changement en cours (ΔI₁ ) entre les courbes « Pd-CNCs » et « clivage MMP-7 » a été calculé à 48,7 μA. Ensuite, le courant de pic a été réduit après la réaction de précipitation catalytique du 4-CN, avec un pic de courant de 136,1 μA (courbe de précipitation par clivage MMP-7). En revanche, le biocapteur sans MMP-7 a induit un pic de courant plus faible (54,9 μA, courbe de précipitation), qui a été indiqué comme le signal à blanc, après la réaction de précipitation catalysée. Dans les circonstances, ΔI₂ était la différence de signal de courant entre les courbes « précipitation » et la courbe « Précipitation par clivage MMP-7 », passant de 48,7 à 81,2 μA. L'EIS a également été utilisé pour surveiller la fabrication du biocapteur. La résistance de transfert d'électrons correspondait au diamètre du demi-cercle des tracés de Nyquist (Fig. 4b). A titre de comparaison, le tracé des peptides/Au-rGO/GCE (courbe peptides) affiche un demi-cercle plus grand, et donc une plus grande résistance, que ceux de Au-rGO/GCE (courbe Au-rGO/GCE) et GCE nu (courbe nue GC) qui a le plus petit cercle, indiquant que les peptides ont été modifiés avec succès sur le GCE. La résistance augmentait lorsque les peptides étaient liés à l'amplificateur via le glutaraldéhyde (courbe Pd-CNC). Le diamètre du demi-cercle a légèrement diminué (courbe de clivage de la MMP-7) après incubation avec la MMP-7, ce qui peut être attribué à la MMP-7 qui a spécifiquement clivé les peptides. En revanche, la résistance a augmenté de manière significative lorsque le biocapteur a été plongé dans la solution de 4-CN et H₂ O₂ (courbe de précipitation)_. Subissant à la fois une réaction de clivage peptidique et de précipitation catalytique, la résistance a manifestement diminué (courbe de précipitation de clivage MMP-7).

SWV (a ) et EIS (b ) réponses du processus de modification de l'électrode en 5 mM [Fe(CN)₆ ] ^3−/4- tamponné phosphate (0,1 M, pH = 7,4)

Optimisation des conditions de détection

La quantité et le temps d'incubation des peptides, en tant que facteurs importants pour les performances de détection du biocapteur, ont été optimisés davantage. Il a été constaté que le signal de courant diminuait en conséquence lorsque la concentration en peptide augmentait de 20 à 40 μM et restait constante entre 50 et 80 μM (Fig. 5a). Pour éviter une adsorption non spécifique, nous avons choisi 50 μM pour les mesures ultérieures, puis optimisé le temps d'incubation du peptide 50 μM (Fig. 5b). Le courant SWV a diminué progressivement de 20 à 40 min, puis est resté constant après 40 min. Ainsi, 40 min ont été choisis comme temps d'incubation pour les peptides. Le temps de réaction de clivage est également un facteur important pour les performances analytiques du biocapteur (Fig. 5c). Le signal du biocapteur augmentait lorsque le temps de clivage était compris entre 30 et 50 min, puis restait constant après 50 min, suggérant que le peptide était complètement clivé. Ainsi, 50 min a été choisi comme temps de clivage pour les expériences suivantes. La réaction de précipitation, qui influence également la sensibilité du biocapteur (Fig. 5d), s'est avérée augmenter en 50 min, et le signal électrochimique a diminué de façon continue. Étant donné que le signal de courant est resté constant avec une nouvelle augmentation du temps de réaction, 50 min a été sélectionné comme temps de réaction de précipitation pour le test suivant.

Effets de la concentration peptidique (a ), temps d'incubation de 50 μM de peptide (b ), temps de clivage peptidique (c ) et le temps de réaction de précipitation (d ) sur les réponses actuelles du biocapteur

Performance du biocapteur proposé

Après incubation avec différentes concentrations de MMP-7 dans des conditions optimales, les performances du biocapteur proposé ont été déterminées. Comme le montre la figure 6, avec une concentration décroissante de MMP-7, le signal SWV a diminué. Le tracé d'étalonnage révèle une bonne relation linéaire entre les pics actuels et le logarithme des concentrations d'analyte dans la plage de 0,1 pg mL ⁻¹ à 100 ng mL ⁻¹ . L'équation linéaire a été déterminée comme étant (I = − 16,53lgCMMP-7-137,26) avec un coefficient de corrélation de 0,9967. La limite de détection du biocapteur était de 17,38 fg mL ⁻¹ pour MMP-7 à un rapport signal/bruit de 3 (S/N = 3; est l'écart type du signal dans une solution à blanc). Par rapport aux rapports récents sur la détection du clivage peptidique de la MMP-7, le biocapteur a présenté de meilleures performances analytiques (tableau 1).

un Réponses SWV de la détection électrochimique pour MMP-7 dans 5 mM [Fe(CN)₆ ] ^3−/4− tamponné au phosphate (0,1 M, pH = 7,4) aux concentrations de 100 fg mL ⁻¹ à 100 ng mL ⁻¹ . b Courbe d'étalonnage linéaire du courant et du logarithme de la concentration de MMP-7. Les barres d'erreur sont des écarts types pour n = 3

Évaluation des performances de l'immunocapteur

Pour évaluer la reproductibilité du biocapteur, trois électrodes modifiées ont été incubées avec 0,01, 0,1, 1, 10 et 100 ng mL ⁻¹ MMP-7. Les écarts types correspondants ont été calculés à 1,3 %, 1,4 %, 4,0 %, 1,0 % et 3,0 %, respectivement, indiquant une bonne reproductibilité du biocapteur. MMP-2, NSE, PSA, TBS et BSA ont été utilisés comme distractions pour analyser la spécificité de ce biocapteur. Aucune réponse évidente n'a été observée lorsque le biocapteur a été incubé avec des mélanges individuels de 1 ng mL ⁻¹ MMP-7 avec (100 ng mL ⁻¹ chacun) MMP-2, NSE, PSA, TBS et BSA. Par rapport au biocapteur incubé avec seulement 1 ng mL ⁻¹ MMP-7, les signaux actuels de chaque mélange étaient presque les mêmes (Fig. 7a), ce qui démontre que le biocapteur affiche une excellente spécificité pour la MMP-7. Pour étudier la stabilité, le biocapteur construit a été stocké à 4 °C pendant 28 jours, et ses performances pour la détection de MMP-7 ont été évaluées tous les 7 jours (Fig. 7b). Les écarts types relatifs (RSD) entre les expériences parallèles étaient tous inférieurs à 10 %, ce qui implique une stabilité remarquable du biocapteur.

Réponses SWV actuelles (a ) sur la capacité anti-interférence du biocapteur (les barres d'erreur sont des écarts types pour n = 3). Les concentrations de distractions :MMP-2 (100 ng mL ⁻¹ ), NSE (100 ng mL ⁻¹ ), PSA (100 ng mL ⁻¹ ), THR (100 ng mL ⁻¹ ) et BSA (100 ng mL ⁻¹ ), respectivement. Le mélange contient toutes ces distractions (100 ng mL ⁻¹ ) et MMP-7 (1 ng mL ⁻¹ ). Réponses SWV (b ) des biocapteurs proposés conservés à 4 °C pendant différents temps pour la détection de 1 ng mL ⁻¹ MMP-7

Pour étudier la faisabilité de la méthode proposée, des expériences de récupération ont été réalisées. Les récupérations allaient de 86,3 à 117,2 % (tableau 2), ce qui indique en outre la faisabilité prometteuse du biocapteur dans les analyses cliniques.

Conclusions

En résumé, un nanocomposite de carbone fonctionnalisé au Pd a été fabriqué en tant que nouvel amplificateur d'impédance, ce qui révèle un H₂ prometteur. O₂ performances catalytiques pour l'oxydation 4-CN. En utilisant la haute impédance de la précipitation insoluble de 4-CN oxydé sur l'électrode, un biocapteur ampérométrique pour la détection de MMP-7 a été construit. Le biocapteur possède une sensibilité comparable, une large plage de détection, une bonne praticabilité et une sélectivité exceptionnelle pour la détection de MMP-7, ce qui suggère son application potentielle dans diverses bio-applications. Notre travail met en outre en évidence l'importance de l'amplificateur d'impédance dans l'amélioration des performances des tests ampérométriques, encourageant la fabrication de nouveaux amplificateurs avec une activité catalytique avancée et une résistance élevée.

Abréviations

4-CN :

4-Chloro-1-naphtol

BSA :

Sérum albumine bovine

EDS :

Spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie

FCC :

Cube face centre

FFT :

Transformation de Fourier rapide

GCE :

Electrode de carbone vitreux

GO :

Oxyde de graphène

HR-TEM :

Microscope électronique à transmission haute résolution

LOD :

Limite de détection

MMP-2 :

Matrice métalloprotéinase-2

MMP-7 :

Matrice métalloprotéinase-7

NSE :

Enolase spécifique des neurones

PBS :

Solution tampon phosphate

Pd-CNC :

Nanocomposites de carbone fonctionnalisés au Pd

PSA :

Antigène spécifique de la prostate

RSD :

Écarts types relatifs

SEM :

Microscope électronique à balayage

SWV :

Voltamétrie carrée

TBS :

Thrombine de sérum bovin

TEM :

Microscope électronique à transmission