Assemblage de points de carbone dans des cadres avec une stabilité améliorée et une activité antibactérienne

Introduction

Les infections bactériennes représentent une menace sérieuse pour la vie humaine, et le développement de médicaments efficaces pour désinfecter les bactéries est très demandé [1]. Divers antibiotiques ont été utilisés pour traiter les infections bactériennes, mais la surutilisation d'antibiotiques provoque d'autres problèmes tels que des effets secondaires et des problèmes de résistance aux médicaments [2]. Les nanomatériaux comprenant des polymères antimicrobiens [3], des nanomatériaux métalliques [4] et des nanomatériaux de carbone [5, 6] ont été utilisés comme alternatives aux antibiotiques classiques [7]. Les problèmes de pharmacorésistance et de toxicité s'atténuent [8]. Récemment, les CD [9, 10] et les nanoclusters (NC) [11] sont bien appliqués pour lutter contre les infections bactériennes car ils sont biocompatibles [12], actifs [13] et peuvent être facilement nettoyés par les circulations en raison de leurs tailles ultra-petites. [14, 15]. En particulier, les chercheurs ont découvert que les CD présentent une excellente capacité de piégeage des radicaux libres, qui peut être plus puissante que de nombreux médicaments anti-infectieux traditionnels [16,17,18]. Cependant, certains antimicrobiens ultra-petits souffrent d'une mauvaise stabilité en raison de la plus grande surface oxydante [19]. Il est hautement souhaitable de développer des agents antibactériens plus efficaces pour lutter contre les infections bactériennes pour une utilisation à long terme.

Pour répondre à la demande d'applications pratiques, les antimicrobiens devraient avoir les caractéristiques suivantes :(a) une excellente stabilité reste inchangée pendant un certain temps dans un environnement ambiant; (b) Excellente biocompatibilité et faible toxicité :(c) activité antibactérienne élevée. Les nanomatériaux plus gros ont tendance à être plus stables, mais ils pourraient avoir une activité antibactérienne relativement plus faible en raison de la plus petite surface active. Compte tenu à la fois de la faiblesse des petits et des grands nanomatériaux, nous rapportons l'assemblage des petits CD en grands CDF en ajoutant simplement de la polyéthylèneimine (PEI) (Fig. 1). Les CD n'ont pas été fusionnés mais ont conservé leur morphologie en tant que blocs de construction. Par conséquent, les CDF entiers ont montré des tailles plus grandes mais ont démontré une stabilité plus excellente sans perdre les propriétés actives des CD. De plus, nous avons trouvé que les CDF présentaient des activités antibactériennes améliorées contre Escherichia coli à Gram négatif (E. coli ) et Staphylococcus aureus Gram positif (S. aureus ) par rapport aux CD, indiquant leur performance antibactérienne à large spectre, bien que de nombreuses CD n'aient éradiqué que les bactéries Gram-positives [20]. De plus, les CDF ont favorisé la prolifération des cellules PC12 (une lignée cellulaire obtenue à partir d'un phéochromocytome de la médullosurrénale de rat), montrant un grand potentiel pour les applications de récupération nerveuse [21]. Ce travail suggère que l'assemblage de petits CD dans de grands CDF améliore non seulement la stabilité, mais amplifie également l'activité antibactérienne.

Schéma pour la synthèse des CD et l'assemblage en CDF par ajout de PEI à activité antibactérienne renforcée

Matériaux et méthodes

Matériaux et instrument

Les spectres de photoélectrons de surface à rayons X (XPS) ont été enregistrés sur un instrument de spectroscopie de photoélectrons de surface à rayons X (XPS) ESCALAB250Xi. Le microscope électronique à transmission (MET) a été réalisé par un microscope JEM-2100 fonctionnant à 200 kV. La fluorescence des matériaux a été obtenue à l'aide du spectromètre à fluorescence F97. La coloration FDA/PI des cellules bactériennes a été enregistrée en mode tapotement avec un microscope Leica DFC450C. La durée de vie de la fluorescence a été mesurée sur un système de comptage de photons uniques en corrélation temporelle (TCSPC) à l'aide d'un spectrofluoromètre Nanolog (Horbia JY, Japon). Les spectres de spectroscopie ultraviolet-visible (UV-vis) sont obtenus à partir de l'instrument UV-1600. L'imagerie bactérienne a été observée par un microscope confocal (Olympus FLUOVIEW FV1000 c). Tous les réactifs étaient de qualité analytique. L'eau déminéralisée a été utilisée pour les expériences. Le kit de comptage cellulaire-8 a été obtenu auprès de Beyotime Biotechnology.

Préparation des CD et CDF

La L-cystéine (1,0 g) a été dissoute dans 10,0 ml d'eau désionisée et bien mélangée. Ensuite, le pH de la solution a été ajusté à 9,0 avec 1,0 M de NaOH. La solution a été transférée dans un réacteur hydrothermal et chauffée à 160 °C pendant 24 h. Une fois la solution refroidie à température ambiante, la solution résultante a été soumise à une dialyse en utilisant un sac de dialyse (seuil de PM 7000) pendant un jour. Les CD tels qu'ils ont été obtenus ont été utilisés pour les caractérisations et les expériences suivantes. Pour la préparation des CDF, 40 µL de 1% PEI ont été ajoutés à 1 mL des CD. Le mélange a été laissé au repos pendant 1 h. Le produit a été purifié par dialyse en utilisant la même méthode que la purification des CD. Pour la caractérisation HR-TEM, les échantillons ont été concentrés dans un petit volume, transférés dans une colonne de gel de silice et élués avec du méthanol et du dichlorométhane pour obtenir les produits purifiés.

Évaluation de la toxicité

Les cellules PC12 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits pendant 12 h, puis ont été incubées avec des CD et des CDF à différentes concentrations. Le nombre de cellules viables a été étudié en utilisant un test Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-diphényltétrazolium (MTT) (5 mg/mL dans du PBS) a été ajouté à 1/10 du volume de culture, et les cellules ont été remises dans l'incubateur. Après cela, les surnageants ont été jetés et 200 L de diméthylsulfoxyde (DMSO) ont été ajoutés dans chaque puits. Les cristaux ont été dissous en secouant les plaques pendant 10 min. L'absorbance à 490 nm a été mesurée à l'aide du Microreader (Varioskan LUX Multimode Reader). Des puits témoins blancs ont été inclus pour toutes les mesures d'absorbance.

Expérience antibactérienne

E. coli et S. aureus ont été incubés en l'absence et en présence de CD et de CDF à 37 °C avec une agitation à 250 tr/min. La croissance des cellules bactériennes dans le bouillon Lysogénie (LB) a été mesurée par le Microreader à une longueur d'onde de 600 nm (OD600). Le milieu LB a été utilisé comme témoin à blanc. La DO600 représente la densité cellulaire, et la viabilité cellulaire relative a été calculée sur la base de la comparaison entre les cellules bactériennes cultivées en présence des matériaux et le groupe témoin (DO600 des cellules bactériennes en l'absence des CD ou des CDF). Les bactéries vivantes/mortes sont évaluées par le protocole de coloration FDA/PI [22].

Détection des espèces réactives de l'oxygène (ROS) Ros

La production intracellulaire de ROS a été mesurée dans les cellules bactériennes avant et après le traitement par CD et CDF pendant 12 h, avec une sonde 2′, 7′-dichlorofluorescine diacétate (DCFH-DA) en suivant les instructions. La fluorescence a été détectée à une longueur d'onde d'émission de 525 nm avec une excitation à 488 nm.

Résultats et discussions

Caractérisation des matériaux

Enquêtes sur la taille

La figure 2 montre le SEM de la poudre pour les CDF avec un grossissement relativement plus faible (Fig. 2a0) et plus élevé (Fig. 2b0) après exposition à l'air pendant plusieurs heures. On peut voir que les CDF étaient bien distribués et montraient une taille moyenne d'env. 25 nm. Les CD étaient censés montrer de petites tailles mono-dispersées sur la base de l'étude MET et AFM (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1), mais ces petites particules présentaient une agrégation observée par SEM après exposition à l'air pendant un certain temps (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2 ). D'autre part, les CDF ont conservé leur morphologie bien qu'ils soient exposés à l'environnement ambiant. Cela indique que les CDF tels qu'ils sont obtenus sont plus prometteurs pour des applications pratiques. Les CDF ont été davantage caractérisés par MET (Fig. 2b1). On peut voir que les CDF présentaient des structures d'assemblage avec de petits CD comme blocs de construction. L'analyse par microscopie électronique à transmission à haute résolution (HR-TEM) (Fig. 2b2) a révélé que le bloc de construction des CDF présentait des franges de réseau avec un espacement d de 0,21 nm, correspondant au réseau plan (100) du graphite, qui était similaire aux CD classiques [23,24,25]. Par conséquent, les CDF d'assemblage ne perdent pas la caractéristique des CD, qui peuvent combiner les avantages à la fois des grands cadres entiers et des petits blocs de construction intérieurs.

SEM pour les CDF avec relativement faible (a0 ) et un grossissement supérieur (b0 ); TEM (b1 ) RH-TEM (b2 ) des CDF

Potentiel Zeta

Des études de potentiel zêta ont été utilisées pour mesurer le degré de répulsion électrostatique des CD et des CDF entre les particules chargées adjacentes dans le système dispersé (Fig. 3). On peut voir que le pic de potentiel zêta des CD n'était pas bien présenté, qui étaient exposés à l'environnement ambiant. En outre, plusieurs pics de potentiel zêta ont été obtenus avec de grandes déviations zêta (tableau 1), indiquant que les CD étaient assez instables et non répétables. D'autre part, le pic de potentiel zêta pour les CDF s'est concentré sur une plage relativement stable. Nous avons également eu des écarts zêta beaucoup plus faibles sur la base de mesures triples, révélant que les CDF étaient plus stables et que les systèmes dispersés avaient des échantillons d'une pureté plus élevée.

Potentiel zêta des CD (a ) et CDF (b )

Propriétés de fluorescence

Les spectres d'émission de fluorescence ont été utilisés pour surveiller le processus d'assemblage des CD aux CDF (Fig. 4). Au fur et à mesure du titrage du PEI, l'émission de fluorescence à 350 nm s'est progressivement éteinte (Fig. 4a). Mais aucun décalage significatif du spectre de fluorescence n'a été observé, révélant qu'aucune agrégation ne s'est produite. La structure d'assemblage des CDF modifie la taille entière des CD, ce qui influence la fluorescence. Pendant ce temps, les CD voisins marquaient la fluorescence les uns des autres. De plus, la chimie de surface joue un rôle important dans les propriétés de fluorescence. Les atomes d'azote et les atomes de soufre à la surface des CD peuvent générer des pièges à énergie. La fluorescence brillante des CD est attribuée à la surface du défaut avec de nombreux groupes carbonyle et amino. Après la fonctionnalisation du PEI, la surface des CDF était dominée par les groupes aminés, qui ont éteint la fluorescence avec les tailles croissantes. La comparaison du comportement de fluorescence des CD et des CDF a été examinée plus en détail par TCSPC pour comprendre les voies de recombinaison de charges photogénérées des matériaux (Fig. 4b). L'émission a été surveillée à 430 nm. Les décroissances de fluorescence nécessitaient un ajustement exponentiel à deux composants. Les constantes de temps et les amplitudes relatives sont ajustées et résumées dans le tableau S1. On a pu voir que la durée de vie du composant dominant pour les CD était de 2,45 ns, tandis que celle de l'autre composant était de 7,47 ns. D'autre part, la durée de vie du composant dominant pour les CD était de 1,98 ns, tandis que l'autre composant montrait une durée de vie de 7,30 ns. Aucun changement significatif de durée de vie n'a été observé entre les CD et les CDF, ce qui a également indiqué que les propriétés des CD n'étaient pas substantiellement modifiées lors de l'assemblage en CDF [26].

Spectres d'émission de fluorescence a de CD comme titrage de PEI, et durée de vie b pour CD et CDF

Toxicité

Pour évaluer la sécurité des matériaux, la toxicité des CD et des CDF pour les cellules PC12 est étudiée. Des tests de MTT ont été effectués pour étudier l'influence des matériaux sur la viabilité des cellules (Fig. 5). Après incubation de PC12 avec des CD et des CDF, les viabilités cellulaires n'étaient pas beaucoup affectées dans les 24 h. Fait intéressant, les deux matériaux carbonés favorisent la prolifération de PC12, qui joue un rôle important dans le traitement des lésions nerveuses. Ces résultats indiquent la faible toxicité des matériaux, et les matériaux sont prometteurs pour la protection nerveuse avec les cellules PC12 impliquées [27].

Viabilité cellulaire de PC12 en présence de CD (a ) et CDF (b ). Viabilité cellulaire (%) = (absorbance du groupe expérimental - absorbance du groupe témoin)/(absorbance du groupe témoin - absorbance du groupe témoin) × 100%

Enquêtes antibactériennes

Les activités antibactériennes des CD et des CDF ont été initialement évaluées en mesurant la densité bactérienne en présence de ces agents à 600 nm [28]. La figure 6 montre un effet antibactérien substantiel des CD et des CDF contre le S. aureus et E. coli cellules. En particulier, la viabilité du S. aureus cellules était presque de 0 lorsque plus de 30 µg/mL de CDF étaient utilisés. De même, le E. coli les cellules ont été désinfectées par les CD et les CDF. Les CD présentaient plusieurs charges (Fig. 3a). D'autre part, les CDF étaient avec des charges insignifiantes (Fig. 3b), ce qui pourrait supprimer l'adhésion bactérienne sous une faible répulsion interagissant ainsi plus facilement avec la surface bactérienne. Par comparaison, les CDF présentent une activité antibactérienne plus élevée basée sur le phénomène selon lequel un rapport relativement plus important de cellules est tué lorsque plus de 6 µg/mL de matériaux sont utilisés. L'activité antibactérienne accrue des CDF est peut-être attribuée à l'effet de synergie des CD en tant que blocs de construction ainsi qu'aux charges de surface plus stables. Pour comprendre en profondeur le mécanisme antibactérien, les ROS qui pourraient oxyder le DCFH non fluorescent en DFC fluorescent ont été mesurés (Fig. 6C). Les deux matériaux carbonés n'ont pas induit de manière significative la production de ROS après avoir traité E. coli . Cependant, les CDF ont remarquablement amélioré les ROS intracellulaires tout en interagissant avec S. aureus . Étant donné que les ROS peuvent endommager l'ADN, l'ARN et les protéines bactériens, la valeur améliorée a facilité la désinfection des bactéries. De plus, le ROS a été stimulé avec H₂ O_2. Il convient de noter que les productions de ROS ont toutes été considérablement promues par rapport au H₂ O₂ traitement seul, tandis que les CDF ont montré l'amélioration la plus élevée. Cela indiquait la combinaison de H₂ O₂ avec ces deux matériaux carbonés pourrait encore améliorer l'activité antibactérienne, en particulier pour les CDF.

Activité antibactérienne des CD et des CDF contre S. aureus (un ) et E.coli (b ), c intensité de fluorescence du DCF à 525 nm, qui montre une relation linéaire avec le niveau de ROS, avec le traitement des CD et des CDF en l'absence et en présence de H₂ O₂ (100 μM)

Certains CD ont déjà été signalés pour la désinfection de S. aureus , qui est répertorié dans le tableau 2 à des fins de comparaison. Les CDF actuels ont montré un CMI compétitif. En outre, plutôt que de seulement diminuer la viabilité cellulaire étudiée, les CDF ont favorisé la prolifération cellulaire de PC12, indiquant leur polyvalence lors du traitement des infections bactériennes.

L'intégrité de la membrane bactérienne après le traitement des CD et des CDF a été étudiée par l'expérience de coloration vivant/mort (Fig. 7). La coloration verte fluorescente FDA ne peut montrer que les cellules vivantes, tandis que la fluorescence rouge PI colore spécifiquement les bactéries mortes avec des membranes brisées, mais celles vivantes avec des membranes bactériennes intactes ne sont pas colorées [30, 31]. Comme le montrent les images de fluorescence, une fluorescence rouge évidente a été observée dans les échantillons traités par CD et une densité beaucoup plus élevée de cellules mortes a été observée par les échantillons traités par CDF.

Coloration FDA/PI S. aureus et E. coli en l'absence et en présence de CD et de CDF à 30 µg/mL. Barre d'échelle, 200 µm

Sur la base des comparaisons ci-dessus, nous concluons que les CDF sont prometteurs pour tuer les cellules bactériennes Gram-positives et Gram-négatives. Par conséquent, E. coli et S. aureus avant et après traitement avec 30 µg/mL de CDF ont été caractérisés par SEM (Fig. 8). Comme le montre la figure 8a, c, les bactéries avant le traitement avec les CDF présentent une surface régulière. Cependant, après incubation avec des CDF, la morphologie des cellules bactériennes incluant S. aureus (Fig. 8b) etd E. coli (Fig. 8d) a radicalement changé. De plus, les membranes de nombreuses cellules bactériennes se sont brisées. Certains petits matériaux ont été observés à la surface des bactéries, qui provenaient des CDF attachés. Cela indique que les CDF peuvent désinfecter les cellules bactériennes en endommageant les membranes [32].

SEM pour S. aureus (un , b ) et E.coli avant (a , c ) et après (b , d ) le traitement avec 30 µg/mL de CDF. Barre d'échelle :2 µm

Étant donné que les CD et les CDF sont tous deux fluorescents, 6 µg/mL des agents ont été étudiés pour l'imagerie bactérienne au cours de la progression de la désinfection. L'imagerie de S. aureus a été étudié et illustré à la Fig. 9. Fait intéressant, il a été constaté que les CD et les CDF pouvaient être utilisés pour l'imagerie du S. aureus . Cependant, les CDF présentent une efficacité d'absorption plus élevée puisque les cellules bactériennes observant à partir des champs clairs et sombres se chevauchent presque. En revanche, seule une partie de S. aureus les cellules ont été colorées par les CD. En outre, les densités cellulaires bactériennes étaient plus faibles par le traitement des CDF, représentant des CDF désinfectés S. aureus plus efficacement par rapport aux CD aux mêmes dosages. Ces résultats révèlent également que les CDF peuvent être utilisés comme colorants alternatifs pour l'imagerie de diverses cellules bactériennes.

Imagerie de S. aureus par l'absorption de CD et CDF après 12 h

Conclusions

L'assemblage des CD en CDF se traduit par une activité antibactérienne plus robuste. Il est conclu que la structure d'assemblage permet des propriétés plus stables mais amplifie l'activité antibactérienne des CD. Ce travail fournit également une nouvelle voie d'assemblage de petits nanomatériaux dans des cadres pour des applications plus pratiques.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données étayant les conclusions de cet article sont incluses dans l'article.

Abréviations

CD :

Points de carbone

CDF :

Cadres basés sur les points de carbone

Île-du-Prince-Édouard :

Polyéthylèneimine

E. coli :

Escherichia coli

S. aureus :

Staphylococcus aureus

TEM :

Microscope électronique à transmission

HR-TEM :

TEM haute résolution

XPS :

Spectres de photoélectrons de surface aux rayons X

MIC :

Concentration minimale inhibitrice

NC :

Nanoclusters

TCSPC :

Comptage de photons uniques en corrélation temporelle

CCK-8 :

Dosage du kit de comptage cellulaire-8

ROS :

Ros espèces réactives de l'oxygène

SEM :

Microscope électronique à balayage

ZP :

Potentiel Zêta