Cadres stables à base de points de carbone dotés d'une efficacité antibactérienne supérieure

Résumé

Les points de carbone (CDs) sont largement utilisés comme agents antimicrobiens en raison de leur surface active, mais certains souffrent d'instabilité. Par conséquent, leurs applications, notamment l'activité antibactérienne, peuvent ne pas être fiables pour une utilisation à long terme. Dans cette étude, nous synthétisons des CDs à fluorescence bleue par un procédé hydrothermal. Ensuite, la polyéthylèneimine (PEI) est utilisée pour assembler les CDs en cadres à base de points de carbone (CDFs). Les CDFs présentent une fluorescence éteinte, mais des propriétés plus stables, comme le révèlent les analyses au microscope électronique à balayage et au potentiel zêta. Tant les CDs que les CDFs montrent une activité antibactérienne contre Escherichia coli (Gram-négatif) et Staphylococcus aureus (Gram-positif), mais les CDFs offrent une performance supérieure, inhibant complètement S. aureus à une concentration minimale inhibitrice (CMI) de 30 μg/mL. Cela démontre que les CDFs améliorent à la fois la stabilité et l'activité antibactérienne, ce qui les rend plus prometteurs pour des applications pratiques.

Résumé graphique

Introduction

Les infections bactériennes constituent une menace sérieuse pour la vie humaine, et le développement de médicaments efficaces pour désinfecter les bactéries est en forte demande. Divers antibiotiques ont été utilisés, mais leur surutilisation entraîne des effets secondaires et des problèmes de résistance. Les nanomatériaux — polymères antimicrobiens, nanomatériaux métalliques et nanomatériaux de carbone — ont été explorés comme alternatives aux antibiotiques classiques, atténuant les problèmes de résistance et de toxicité. Récemment, les points de carbone (CDs) et les nanoclusters (NCs) sont largement appliqués pour combattre les infections bactériennes grâce à leur biocompatibilité, leur activité et leur élimination facile par la circulation en raison de leur taille ultra-petite. Les CDs présentent notamment une excellente capacité de piégeage des radicaux libres, supérieure à de nombreux médicaments anti-infectieux traditionnels. Cependant, certains agents antimicrobiens ultra-petits souffrent d'une mauvaise stabilité due à leur grande surface oxydante. Il est donc crucial de développer des agents antibactériens plus efficaces pour une utilisation à long terme.

Pour répondre aux exigences des applications pratiques, les agents antimicrobiens doivent présenter : (a) une excellente stabilité inchangée pendant un certain temps en environnement ambiant ; (b) une excellente biocompatibilité et faible toxicité ; (c) une forte activité antibactérienne. Les nanomatériaux plus grands tendent à être plus stables, mais peuvent avoir une activité antibactérienne plus faible en raison d'une surface active plus petite. En tenant compte des faiblesses des nano-objets petits et grands, nous rapportons l'assemblage de petits CDs en grands CDFs par simple ajout de polyéthylèneimine (PEI). Les CDs ne fusionnent pas mais conservent leur morphologie comme blocs de construction. Ainsi, les CDFs présentent des tailles plus grandes mais une stabilité excellente sans perdre les propriétés actives des CDs. De plus, les CDFs affichent une activité antibactérienne accrue contre E. coli et S. aureus par rapport aux CDs, indiquant un spectre large, alors que de nombreux CDs n'éliminent que les bactéries Gram-positives. En outre, les CDFs favorisent la prolifération des cellules PC12 (ligne cellulaire issue d'un phéochromocytome de la médullosurrénale du rat), montrant un grand potentiel pour la récupération nerveuse. Ce travail suggère que l'assemblage de petits CDs en grands CDFs améliore non seulement la stabilité, mais amplifie aussi l'activité antibactérienne.

Matériaux et méthodes

Matériaux et instrumentation

Les spectres de photoélectrons X (XPS) ont été enregistrés sur un spectromètre ESCALAB250Xi. La microscopie électronique à transmission (MET) a été réalisée sur un microscope JEM-2100 à 200 kV. La fluorescence a été mesurée avec un spectromètre F97. La coloration FDA/PI des cellules bactériennes a été observée en mode tapping avec un microscope Leica DFC450C. La durée de vie de fluorescence a été mesurée sur un système de comptage de photons uniques corrélé dans le temps (TCSPC) avec un spectrofluoromètre Nanolog (Horbia JY, Japon). Les spectres UV-vis ont été obtenus sur un instrument UV-1600. L'imagerie bactérienne a été observée par microscopie confocale (Olympus FLUOVIEW FV1000 c). Tous les réactifs étaient de grade analytique. L'eau déionisée a été utilisée tout au long des expériences. Le kit de comptage cellulaire-8 provenait de Beyotime Biotechnology.

Préparation des CDs et CDFs

La L-cystéine (1,0 g) a été dissoute dans 10,0 mL d'eau déionisée et le pH ajusté à 9,0 avec NaOH 1,0 M. La solution a été transférée dans un réacteur hydrothermal et chauffée à 160 °C pendant 24 h. Après refroidissement, la solution a été dialysée (poids moléculaire 7000) pendant un jour. Les CDs obtenus ont été utilisés pour les caractérisations et expériences. Pour les CDFs, 40 µL de PEI à 1 % ont été ajoutés à 1 mL de CDs. Le mélange a reposé 1 h, puis a été purifié par dialyse selon la même méthode. Pour la caractérisation MET à haute résolution, les échantillons ont été concentrés, déposés sur une colonne de gel de silice et élués avec du méthanol et du dichlorométhane pour obtenir des produits plus purs.

Évaluation de la toxicité

Les cellules PC12 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits pendant 12 h, puis incubées avec CDs et CDFs à différentes concentrations. Le nombre de cellules viables a été évalué par le test CCK-8. Le MTT (5 mg/mL dans PBS) a été ajouté à 1/10 du volume de culture, puis les cellules ont été réincubées. Les surnageants ont été éliminés et 200 μL de DMSO ajoutés par puits. Les cristaux ont été dissous par agitation pendant 10 min. L'absorbance à 490 nm a été mesurée (Varioskan LUX Multimode Reader). Des puits témoins blancs étaient inclus pour toutes les mesures.

Expérience antibactérienne

E. coli et S. aureus ont été incubés en l'absence et en présence de CDs et CDFs à 37 °C avec agitation à 250 tr/min. La croissance dans le bouillon LB a été mesurée à 600 nm (OD600). Le milieu LB servait de témoin. L'OD600 représente la densité cellulaire, et la viabilité relative a été calculée par comparaison au groupe témoin (OD600 sans CDs ni CDFs). Les bactéries vivantes/mortes ont été évaluées par coloration FDA/PI.

Détection des espèces réactives de l'oxygène (ROS)

La production intracellulaire de ROS a été mesurée dans les cellules bactériennes avant et après traitement par CDs et CDFs pendant 12 h, avec une sonde DCFH-DA (2′,7′-dichlorofluorescin diacétate) selon les instructions. La fluorescence a été détectée à 525 nm (excitation 488 nm).

Résultats et discussion

Caractérisation des matériaux

Études de taille

La figure 2 montre les images MEB des CDFs en poudre à différents grossissements après exposition à l'air pendant plusieurs heures. Les CDFs sont bien répartis avec une taille moyenne d'environ 25 nm. Les CDs, supposés monodisperses et petits d'après les études MET et AFM (fichier supplémentaire 1 : Figure S1), s'agrègent observés au MEB après exposition à l'air (fichier supplémentaire 1 : Figure S2). En revanche, les CDFs conservent leur morphologie même exposés à l'environnement ambiant, ce qui les rend plus prometteurs pour des applications pratiques. La MET (Fig. 2b1) révèle des structures d'assemblage avec de petits CDs comme blocs de construction. L'imagerie MET à haute résolution (HR-TEM, Fig. 2b2) montre des franges de réseau avec un espacement d de 0,21 nm, correspondant au plan (100) du graphite, similaire aux CDs classiques. Ainsi, les CDFs assemblés ne perdent pas les caractéristiques des CDs, combinant les avantages des grands cadres et des petits blocs de construction internes.

Potentiel zêta

Les investigations de potentiel zêta mesurent le degré de répulsion électrostatique entre particules chargées adjacentes en dispersion (Fig. 3). Le pic de potentiel zêta des CDs n'est pas bien défini après exposition à l'air. De plus, plusieurs pics avec de grandes déviations sont obtenus (Tableau 1), indiquant que les CDs sont instables et non reproductibles. En revanche, le pic de potentiel zêta des CDFs se concentre dans une plage stable, avec des déviations beaucoup plus faibles sur trois mesures, révélant une plus grande stabilité et une plus grande pureté des systèmes dispersés.

Propriétés de fluorescence

Les spectres d'émission de fluorescence ont suivi le processus d'assemblage des CDs en CDFs (Fig. 4). Avec la titration de PEI, l'émission à 350 nm s'éteint progressivement (Fig. 4a), sans décalage spectral significatif, indiquant qu'aucune agrégation ne se produit. La structure d'assemblage modifie la taille globale des CDs, influençant la fluorescence. De plus, les CDs voisins éteignent mutuellement leur fluorescence. La chimie de surface joue aussi un rôle clé : les atomes d'azote et de soufre en surface créent des pièges d'énergie. La fluorescence brillante des CDs provient de leur surface défectueuse riche en groupes carbonyl et amino. Après fonctionnalisation par PEI, la surface des CDFs est dominée par les groupes amino, qui éteignent la fluorescence conjointement à l'augmentation de taille. La comparaison du comportement de fluorescence des CDs et CDFs a été examinée par TCSPC pour comprendre les voies de recombinaison des charges photogénérées (Fig. 4b). L'émission a été monitorée à 430 nm. Les décroissances de fluorescence nécessitent un ajustement exponentiel à deux composantes. Les constantes de temps et amplitudes relatives sont résumées dans le Tableau S1. La durée de vie de la composante dominante pour les CDs est de 2,45 ns, l'autre de 7,47 ns. Pour les CDFs, la composante dominante est de 1,98 ns, l'autre de 7,30 ns. Aucun changement significatif de durée de vie n'est observé, indiquant que les propriétés des CDs ne sont pas substantiellement modifiées lors de l'assemblage en CDFs.

Toxicité

Pour évaluer la sécurité, la toxicité des CDs et CDFs sur les cellules PC12 a été étudiée. Des tests MTT ont évalué l'influence sur la viabilité cellulaire (Fig. 5). Après incubation de 24 h, les viabilités n'étaient pas significativement affectées. Fait intéressant, les deux matériaux carbonés favorisent la prolifération des PC12, ce qui joue un rôle important dans la thérapie des lésions nerveuses. Ces résultats indiquent une faible toxicité et un potentiel pour la neuroprotection via les cellules PC12.

Investigations antibactériennes

Les activités antibactériennes des CDs et CDFs ont été évaluées en mesurant la densité bactérienne à 600 nm. La figure 6 montre un effet antibactérien substantiel des deux agents contre S. aureus et E. coli. Notamment, la viabilité de S. aureus chute près de 0 avec plus de 30 µg/mL de CDFs. De même, E. coli est désinfecté par les deux. Les CDs présentent des charges multiples (Fig. 3a), tandis que les CDFs ont des charges insignifiantes (Fig. 3b), ce qui pourrait réduire la répulsion bactérienne et favoriser l'interaction avec la surface bactérienne. Par comparaison, les CDFs montrent une activité antibactérienne supérieure, avec un ratio plus élevé de cellules tuées à partir de 6 µg/mL. L'activité accrue est possiblement due à l'effet synergique des CDs comme blocs de construction et aux charges de surface plus stables. Pour comprendre le mécanisme, les ROS oxydant le DCFH non fluorescent en DFC fluorescent ont été mesurées (Fig. 6c). Les deux matériaux n'induisent pas significativement de ROS après traitement de E. coli. Cependant, les CDFs augmentent remarquablement les ROS intracellulaires en interaction avec S. aureus. Comme les ROS endommagent l'ADN, l'ARN et les protéines bactériennes, cette augmentation facilite la désinfection. De plus, les ROS sont stimulées par H₂O₂. Notons que les productions de ROS sont toutes dramatiquement augmentées par rapport au H₂O₂ seul, les CDFs montrant la plus forte augmentation. Cela suggère que la combinaison de H₂O₂ avec ces matériaux carbonés pourrait renforcer l'activité antibactérienne, surtout pour les CDFs.

Le tableau 2 compare les CDFs actuels à d'autres CDs rapportés pour la désinfection de S. aureus. Les CDFs actuels présentent une CMI compétitive. De plus, au lieu de seulement diminuer la viabilité cellulaire, les CDFs favorisent la prolifération des PC12, indiquant leur polyvalence dans le traitement des infections bactériennes.

L'intégrité de la membrane bactérienne après traitement par CDs et CDFs a été étudiée par coloration vivante/morte (Fig. 7). La coloration verte FDA ne marque que les cellules vivantes, tandis que la coloration rouge PI marque spécifiquement les bactéries mortes aux membranes rompues, les vivantes aux membranes intactes restant non colorées. Les images de fluorescence montrent une fluorescence rouge évidente dans les échantillons traités aux CDs, et une densité bien plus élevée de cellules mortes avec les CDFs.

Basé sur ces comparaisons, nous concluons que les CDFs sont prometteurs pour tuer à la fois les bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Par conséquent, E. coli et S. aureus avant et après traitement avec 30 µg/mL de CDFs ont été caractérisés par MEB (Fig. 8). Avant traitement, les bactéries présentent une surface régulière (Fig. 8a, c). Après incubation avec les CDFs, la morphologie de S. aureus (Fig. 8b) et E. coli (Fig. 8d) change drastiquement, les membranes de nombreuses cellules se rompant. De petits matériaux sont observés à la surface des bactéries, provenant des CDFs attachés. Cela indique que les CDFs désinfectent en endommageant les membranes.

Puisque les CDs et CDFs sont fluorescents, 6 µg/mL des agents a été étudié pour l'imagerie bactérienne pendant la désinfection. L'imagerie de S. aureus est présentée à la figure 9. Les deux CDs et CDFs peuvent imager S. aureus, mais les CDFs montrent une efficacité d'absorption plus élevée, les champs clairs et sombres se superposant presque complètement. En revanche, seule une partie des cellules est colorée par les CDs. De plus, les densités cellulaires sont plus faibles avec les CDFs, indiquant une désinfection plus efficace à doses égales. Ces résultats révèlent que les CDFs peuvent servir de colorants alternatifs pour l'imagerie de diverses cellules bactériennes.

Conclusions

L'assemblage des CDs en CDFs entraîne une activité antibactérienne plus robuste. La structure d'assemblage confère des propriétés plus stables tout en amplifiant l'activité antibactérienne des CDs. Ce travail ouvre une nouvelle voie d'assemblage de nanomatériaux petits en cadres pour des applications plus pratiques.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données soutenant les conclusions de cet article sont incluses dans l'article.

Abréviations

CDs :

Points de carbone

CDFs :

Cadres à base de points de carbone

PEI :

Polyéthylèneimine

E. coli :

Escherichia coli

S. aureus :

Staphylococcus aureus

MET :

Microscopie électronique à transmission

HR-TEM :

MET à haute résolution

XPS :

Spectroscopie de photoélectrons X

CMI :

Concentration minimale inhibitrice

NCs :

Nanoclusters

TCSPC :

Comptage de photons uniques corrélé dans le temps

CCK-8 :

Test de kit de comptage cellulaire-8

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

MEB :

Microscope électronique à balayage

ZP :

Potentiel zêta