Nanoplateformes de silice mésoporeuse creuse à coquille de chitosane, sensibles aux enzymes, pour l'administration ciblée de médicaments au côlon

Résumé

Un système d'administration colique sensible aux enzymes a été développé à partir de sphères de silice mésoporeuse creuse (HMSS) auxquelles du chitosane (CS) biodégradable a été greffé via des liaisons azo clivables (HMSS–N=N–CS). La doxorubicine (DOX) a été encapsulée sous forme non cristalline dans la cavité creuse et les mésopores des HMSS avec un taux de chargement élevé de 35,2 %. Les tests de libération in vitro ont démontré que HMSS–N=N–CS/DOX assurait une libération de médicament sensible aux enzymes. Le CS greffé améliore la biocompatibilité et la stabilité tout en réduisant l'adsorption des protéines sur les HMSS. Les résultats d'irritation de la muqueuse gastro-intestinale et de cytotoxicité cellulaire indiquent une bonne biocompatibilité des HMSS et HMSS–N=N–CS. L'absorption cellulaire a montré que l'absorption de la DOX augmentait significativement après préincubation de HMSS–N=N–CS/DOX avec un mélange enzymatique colique. HMSS–N=N–CS/DOX incubé avec des enzymes coliques présentait une cytotoxicité accrue, sa valeur IC₅₀ étant trois fois inférieure à celle du groupe sans enzymes. Ce travail pose les bases pour de futures recherches sur les transporteurs mésoporeux pour l'administration orale ciblée au côlon.

Introduction

Récemment, les systèmes d'administration de médicaments sensibles aux stimuli (DDS) ont suscité un vif intérêt pour le chargement efficace et la libération sélective de médicaments dans les tissus malades ciblés. Ces systèmes peuvent être acheminés vers les sites pathologiques et réaliser une libération à la demande pour améliorer les effets thérapeutiques et prévenir les effets secondaires dus aux fuites prématurées. Tous les stimuli internes et externes, tels que le potentiel redox, le pH, les enzymes, la température et la lumière, ont été utilisés pour concevoir des DDS sensibles aux stimuli. Parmi ceux-ci, les enzymes, en tant que stimuli internes, ont gagné une large attention en raison de leurs concentrations distinctes dans différents tissus.

Au cours des deux dernières décennies, les sphères de silice mésoporeuse (MSS) avec des mésopores de 2 à 50 nm se sont imposées comme des transporteurs de médicaments sensibles aux stimuli, grâce à leur volume poreux remarquable, leur grande surface spécifique, leur structure poreuse bien organisée, leur surface facilement fonctionnalisable et leur bonne biocompatibilité. De plus, les nanoparticules de sphères de silice mésoporeuse creuse (HMSS) avec une structure de coquille mésoporeuse et une cavité creuse sont supérieures aux MSS conventionnelles car la structure creuse peut retenir plus de médicaments avec une capacité de stockage plus élevée. Divers nanotransporteurs sensibles aux stimuli basés sur les MSS ont été développés pour héberger des molécules de médicaments en utilisant divers gardiens de porte : polymères, nanoparticules inorganiques, dendrimères, biomacromolécules, composés macrocycliques, peptides et lipides. Bien que de nombreux DDS basés sur les MSS avec des bouchons fonctionnels puissent réaliser une libération en réponse à divers stimuli externes ou internes, peu ont été utilisés pour l'administration ciblée spécifique au côlon.

Il est bien connu que l'administration orale est la voie favorite et simple pour administrer des médicaments. L'administration ciblée spécifique au côlon est très attractive pour le traitement des maladies coliques, notamment la maladie de Crohn, le cancer colorectal et la colite ulcéreuse. Cependant, elle rencontre plusieurs obstacles : faible teneur en eau et surface d'absorption relativement réduite comparée à d'autres sites du tractus gastro-intestinal (GI). De plus, les DDS oraux font face à un environnement fortement acide dans l'estomac, qui peut accélérer la dégradation des médicaments chargés, compromettant ainsi la libération ciblée au côlon. Pour cette raison, plusieurs DDS dépendants du pH ont été conçus pour réaliser une libération déclenchée par le pH aux valeurs quasi neutres (6-7) du tractus GI, résistant aux conditions acides de l'estomac. Cependant, seule une légère différence d'acidité existe entre les régions intestinales (pH 6,8) et coliques (pH 7,4) ; ces DDS sensibles au pH ont donc du mal à réaliser une libération spécifique au côlon.

Le chitosane (CS), un polysaccharide naturel cationique et biodégradable, est constitué d'unités de glucosamine et de N-acétyl-D-glucosamine liées en β-(1-4). Le CS a reçu une grande attention en médecine biologique grâce à ses propriétés fascinantes : biodégradabilité, biocompatibilité, mucoadhésivité et activité antibactérienne. Comparé aux polymères, polyélectrolytes et supramolécules synthétisés par des procédés complexes, le CS est relativement bon marché et facilement disponible par déacétylation exhaustive de la chitine. De plus, il a été rapporté que le CS peut ouvrir les jonctions serrées entre les cellules, augmentant ainsi l'absorption des médicaments. C'est pourquoi le polymère CS a été sélectionné comme agent de bouchage en raison de sa bonne biocompatibilité et de sa taille appropriée pour couvrir les mésopores des HMSS et bloquer la libération du médicament.

Dans ce travail, un DDS colique sensible aux enzymes basé sur un matériau HMSS (HMSS–N=N–CS) a été conçu pour la première fois. Dans ce système, les transporteurs HMSS ont été préparés via une stratégie d'attaque sélective. Le polymère CS a été attaché à la surface des HMSS par des liaisons azo pour agir comme gardien de porte bloquant les ouvertures des HMSS. Les liaisons azo entre HMSS et CS peuvent être clivées par les enzymes au niveau du côlon, entraînant la séparation du CS des ouvertures des HMSS. La DOX a été utilisée comme médicament modèle pour être incorporée dans la cavité des HMSS, et des expériences de libération in vitro ont été menées pour évaluer la libération sensible aux enzymes en présence d'enzymes coliques. La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et la cytométrie de flux (FCM) ont été utilisées pour étudier l'absorption cellulaire par les cellules Caco-2. Enfin, la cytotoxicité de HMSS–N=N–CS/DOX vis-à-vis des cellules Caco-2 a été mesurée.

Matériaux et Méthodes

Matériaux

Tétraéthylorthosilicate (TEOS) ; chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N-éthylcarbodiimide (EDC) ; chitosane (DD ≥ 95 %) ; bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) ; 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) ; bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) ; acide azobenzène-3,3′-dicarboxylique ; bromure de potassium (pureté spectrale, ≥ 99,5 %) ; N-hydroxysuccinimide (NHS) et DOX ont été achetés chez Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, Chine). L'acide azobenzène-3,3′-dicarboxylique a été fourni par Inno-chem Technology Co. Ltd. (Pékin, Chine). Les milieux de culture cellulaire DMEM, pénicilline-streptomycine et sérum fœtal bovin (FBS) ont été fournis par GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, USA). Tous les réactifs analytiques ont été utilisés sans purification supplémentaire.

Préparation de HMSS–N=N–CS

Préparation de HMSS–NH₂

Les nanoparticules HMSS ont été préparées selon une méthode d'attaque sélective publiée. Les sphères de silice solides ont d'abord été synthétisées par une méthode de Stöber modifiée. Brièvement, 6 mL de TEOS ont été versés dans un mélange de 10 mL d'eau déionisée, 74 mL d'éthanol et 3 mL de NH₃·H₂O concentré. Le mélange a été agité pendant 60 min pour obtenir des suspensions colloïdales de silice à température ambiante. Les sphères solides ont été centrifugées, lavées et séchées. Ensuite, une coquille de silice mésoporeuse a été déposée sur les sphères de silice solides. 300 mg de silice solide ont été dispersés dans 50 mL d'eau déionisée par ultrasons pendant 45 min. La suspension a été versée dans un mélange de 60 mL d'éthanol, 450 mg de CTAB, 90 mL d'eau et 1,7 mL de NH₃·H₂O. Après agitation pendant 60 min, 0,75 mL de TEOS a été ajouté. Les nanoparticules ont été centrifugées après 6 h d'agitation, puis redispersées dans 40 mL d'eau. Environ 1,2 g de Na₂CO₃ a été ajouté avec agitation vigoureuse. Après maintien à 55 °C pendant 12 h, les nanoparticules HMSS ont été collectées et lavées à l'éthanol anhydre. La méthode de post-greffage avec un rapport HMSS/APTES de 4:1 (m/v) a permis de préparer HMSS–NH₂ à 80 °C sous N₂ pendant 8 h, le CTAB étant éliminé par reflux.

Préparation de HMSS–N=N–COOH

L'acide azobenzène-3,3′-dicarboxylique (50 mg) a été ajouté dans du PBS pH 5,8. Puis EDC (5 mg/mL) et NHS (3 mg/mL) ont été ajoutés pour activer l'acide à 30 °C pendant 1 h. 10 mL de PBS contenant 15 mg/mL de HMSS–NH₂ ont été ajoutés, et le mélange a été agité pendant 24 h. Le HMSS–N=N–COOH résultant a été séparé par centrifugation et lavé à l'éthanol.

Préparation de HMSS–N=N–CS

0,15 g de CS et 0,5 mL d'acide acétique ont été ajoutés dans 50 mL d'eau pour préparer la solution de CS. 100 mg de HMSS–N=N–COOH ont été dispersés dans 25 mL de PBS pH 5,0 et activés par EDC et NHS pendant 0,5 h. Ensuite, 10 mL de solution de CS ont été versés dans la suspension avec agitation continue pendant 1 jour. Finalement, le HMSS–N=N–CS synthétisé a été centrifugé et lavé pour collecter les échantillons.

Extraction du mélange enzymatique colique à partir de la microflore

La microflore colique a été collectée selon un travail publié. La culture a été inoculée pour obtenir le mélange enzymatique sécrété par la microflore colique à 37 °C. Le milieu colique simulé contenant le mélange enzymatique a été filtré à travers un filtre de 0,22 µm pour éliminer tous les débris cellulaires. Le filtrat a ensuite été lyophilisé pour obtenir le mélange enzymatique sous forme de poudre, utilisé pour les études ultérieures.

Processus de chargement du médicament et libération sensible aux enzymes

25 mg de DOX ont été dissous dans 5 mL de solution HCl pH 3,5. 100 mg de HMSS–N=N–CS ont été ajoutés dans la solution de DOX et agités à température ambiante pendant 12 h. Ensuite, une solution de NaOH 0,2 M a été utilisée pour ajuster le pH du mélange à 7,0, et la suspension a été agitée pendant 12 h supplémentaires. Le HMSS–N=N–CS chargé en DOX (dénommé HMSS–N=N–CS/DOX) a été centrifugé et lavé pour éliminer la DOX adsorbée en surface. Le surnageant a été recueilli à chaque étape pour mesurer l'efficacité de chargement (LE) de la DOX à 480 nm par spectrophotométrie UV-Vis. La masse totale de DOX chargée dans HMSS–N=N–CS a été calculée en soustrayant la DOX non chargée après les processus de chargement de la masse initiale de DOX ajoutée. HMSS/DOX a été préparé comme contrôle en utilisant HMSS comme transporteur initial. Le LE de la DOX a été calculé selon l'équation : LE (%) = (m_A - m_B) / (m_A - m_B + m_C) × 100, où m_A est la masse de DOX ajoutée, m_B la masse de DOX dans le surnageant, et m_C la masse totale de HMSS–N=N–CS.

La libération in vitro sensible aux enzymes de la DOX à partir de HMSS–N=N–CS/DOX a été évaluée comme suit. 2 mg de HMSS–N=N–CS/DOX et de nanoparticules HMSS/DOX ont été dispersés dans du PBS pH 7,4 sous agitation à 125 rpm avec différentes concentrations de mélange enzymatique colique (0, 0,3 et 1 mg/mL). À intervalles de temps définis, 1 mL du milieu de libération a été prélevé pour mesurer l'absorbance. La libération de DOX a été mesurée à 480 nm. HMSS/DOX a servi de contrôle.

Adsorption de BSA

La quantité d'adsorption de BSA a été évaluée selon des travaux publiés. Le BSA a été ajouté dans du PBS pH 7,4 (0,5 mg/mL). 5 mg de HMSS, HMSS–NH₂ et HMSS–N=N–CS ont été ajoutés dans 2,5 mL de PBS (pH 7,4). Un volume égal de solution de BSA a été ajouté, et la suspension a été placée dans un agitateur à 100 rpm. Après 6 h, la centrifugation a permis de récupérer le surnageant. Enfin, la concentration de BSA a été mesurée à 595 nm après coloration avec la solution de bleu de Coomassie brillant.

Caractérisation

La structure du réseau mésoporeux et la morphologie des nanoparticules HMSS ont été évaluées par images MET (EM–208S, CSIS, USA). La surface spécifique et la distribution de la taille des pores ont été caractérisées par analyse d'adsorption d'azote (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, Chine). Les potentiels ξ et les tailles de particules ont été caractérisés sur un Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK). L'analyse TGA a été réalisée sur un équipement TGA-50 (Shimadzu, Kyoto, Japon) avec un taux de chauffe de 10 °C/min sous flux d'azote. Les spectres de spectrophotométrie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) ont été mesurés sur un spectromètre FT-IR (Bruker Tensor27, Suisse) de 400 à 4000 cm⁻¹ avec la technique des pastilles KBr. La diffraction des rayons X sur poudre a été effectuée sur un diffractomètre Siemens D5005 (Karlsruhe, Allemagne) avec rayonnement Cu-Kα (λ = 1,5418 Å).

Culture cellulaire et expérience d'absorption cellulaire

Les cellules Caco-2 ont été cultivées dans un milieu supplémenté avec 10 % FBS, 1 % d'acides aminés non essentiels, 1 % (v/v) de pyruvate de sodium et 1 % de streptomycine. Les cellules NIH-3T3 ont été cultivées dans du DMEM avec 1 % de streptomycine et 10 % FBS. L'absorption des nanotransporteurs par les cellules Caco-2 a été caractérisée par FCM et CLSM. Les cellules Caco-2 ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits. Après culture pendant la nuit, de la DOX libre, HMSS–N=N–CS/DOX et HMSS–N=N–CS/DOX préincubé avec des nanoparticules d'enzymes coliques (équivalent à 5 µg/mL de DOX) ont été ajoutés aux puits correspondants. Après incubation continue pendant 2 h, le milieu cellulaire a été retiré et lavé soigneusement au PBS. Les cellules ont été fixées au formaldéhyde 4 % et colorées au Hoechst 33258 pour observation en CLSM. La FCM a permis une évaluation quantitative de l'absorption cellulaire. Les cellules Caco-2 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits et incubées pendant 24 h. Après lavage au PBS, les cellules ont été incubées avec de la DOX libre, HMSS–N=N–CS/DOX et HMSS–N=N–CS/DOX préincubé avec des nanoparticules d'enzymes coliques (équivalent à 5 µg/mL de DOX) dans du DMEM sans sérum pendant 2 h. Les cellules ont été rincées au PBS froid, trypsinisées et resuspendues dans 0,5 mL de PBS. La fluorescence de la DOX dans les cellules a été mesurée à l'aide d'un cytomètre FACS Canto (Becton, Dickinson, USA).

Essai de prolifération cellulaire in vitro

La cytotoxicité des transporteurs vides HMSS et HMSS–N=N–CS vis-à-vis des cellules NIH-3T3 et Caco-2 a été testée par essai MTT. Brièvement, les cellules Caco-2 et NIH-3T3 ont été ensemencées séparément dans des plaques à 96 puits et incubées pendant la nuit. L'ancien milieu a été remplacé par un milieu sans sérum contenant différentes concentrations de nanoparticules. Après incubation pendant 2 jours, 50 µL de solution MTT (2 mg/mL) ont été ajoutés et incubés pendant 4 h pour mesurer les cellules vivantes. La solution MTT a été retirée, et 150 µL de DMSO ont été ajoutés pour dissoudre le formazan. L'absorbance a été mesurée sur un lecteur de microplaques (Tecan, Männedorf, Suisse) à 570 nm. La cytotoxicité de la DOX libre, HMSS–N=N–CS/DOX et HMSS–N=N–CS/DOX préincubé avec des mélanges enzymatiques extraits de la microflore colique a été mesurée sur des cellules Caco-2 avec des concentrations de DOX correspondantes de (0,1, 1, 5, 10 et 20 µg/mL). Le temps d'incubation était de 48 h, les autres procédures étant identiques.

Études de toxicité

Les tests d'irritation de la muqueuse gastro-intestinale sont essentiels pour évaluer la biosécurité in vivo de l'administration orale. Des rats Sprague-Dawley mâles (180 ± 10 g) ont été répartis aléatoirement en trois groupes (trois rats par groupe). Les rats ont reçu par voie orale du sérum physiologique, des HMSS et des nanoparticules HMSS–N=N–CS à une dose de 100 mg/kg par jour. Après 7 jours, tous les rats ont été sacrifiés, les tissus collectés et examinés par examen histopathologique (H&E). Pour évaluer la biosécurité des nanoparticules HMSS et HMSS–N=N–CS, les poids corporels de souris BALB/c (18-20 g) ont été enregistrés après administration orale à une dose de 100 mg/kg tous les deux jours. Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux directives pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Université médicale de Qiqihar et approuvées par le Comité d'éthique de cette université.

Statistiques

Les données statistiques ont été analysées avec le logiciel SPSS en utilisant le test t de Student bilatéral. Les barres d'erreur présentées sont des écarts-types. Une valeur p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative.

Résultats et Discussion

Préparation et caractérisation de HMSS–N=N–CS

Les HMSS ont été préparés selon des travaux antérieurs avec de légères modifications. D'abord, des nanosphères de SiO₂ solides ont été préparées, puis une coquille mésoporeuse a été déposée sur leur surface contenant le modèle CTAB. Ensuite, le Na₂CO₃ a été utilisé pour attaquer sélectivement les nanosphères de SiO₂ solides tandis que la coquille mésoporeuse était protégée par le modèle CTAB. La préparation de HMSS–N=N–CS avec le CS attaché comme « gardien de porte » par une liaison azo est décrite dans la Figure 1a. Premièrement, les surfaces des nanoparticules HMSS ont été modifiées avec l'APTES comme réactif de couplage alkyle pour devenir des HMSS amino-fonctionnalisés (HMSS–NH₂) par une méthode de post-modification. Ensuite, HMSS–N=N–COOH a été préparé par une réaction d'amidation entre les groupes amino de HMSS–NH₂ et les groupes carboxyle de l'acide azobenzène-3,3′-dicarboxylique. Puis, le CS a été greffé de manière covalente sur la surface des nanoparticules HMSS par une réaction d'amidation entre les groupes carboxyle de HMSS–N=N–COOH et les groupes amino du CS.

L'image en microscopie électronique à transmission (MET) de la Figure 1a montre que le diamètre moyen des HMSS était de 280 nm, avec une structure creuse uniforme et une coquille mésoporeuse hautement ordonnée. L'épaisseur moyenne de la coquille mésoporeuse était d'environ 90 nm. Comparée à la surface lisse des HMSS, la surface du HMSS–N=N–CS greffé de polymère (Figure 1b) était rugueuse, indiquant que le CS recouvrait le transporteur HMSS.

Les surfaces spécifiques et les distributions de pores des matériaux mésoporeux jouent un rôle crucial dans le chargement et la libération contrôlée des molécules hôtes. Les courbes de distribution de la taille des pores et les isothermes ont été mesurées par analyse d'adsorption-désorption d'azote (Figure 2). Les paramètres détaillés (surface BET S_BET, volume poreux total V_P, distribution de la taille des pores D_P) sont affichés dans le Tableau 1. Le S_BET et le V_P des HMSS purs étaient de 810,7 m²/g et 0,969 cm³/g respectivement, et le D_P d'environ 3,8 nm. Le D_P des HMSS–NH₂ était presque identique à celui des HMSS après amination, indiquant que les mésopores n'étaient pas bloqués après la fonctionnalisation amino. Le S_BET et le V_P des HMSS–N=N–CS ont diminué de manière marquée après modification par le composé azo et revêtement de CS, indiquant que le CS avait recouvert la surface des HMSS.

Le greffage réussi de HMSS–N=N–CS a été vérifié par diverses méthodes. Le potentiel ξ de HMSS–NH₂ a subi un grand changement après fonctionnalisation, passant de -27,9 à +31,4 mV (Figure 3a), attribué à l'ajout de groupes amines à la surface des HMSS. Après réaction de HMSS–NH₂ avec l'acide azobenzène-3,3′-dicarboxylique pour former HMSS–N=N–COOH, le potentiel ξ a encore diminué à -2,0 mV en raison des groupes carboxyle en surface. Après greffage du polymère CS pour former HMSS–N=N–CS, le potentiel ξ est revenu à +32,4 mV, attribué au revêtement de CS abondant en amines et chargé positivement. Les courbes d'analyse thermogravimétrique (ATG) des espèces HMSS, HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH et HMSS–N=N–CS sont montrées en Figure 3b. Comparé à HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS a perdu un poids supplémentaire d'environ 19 %, dû à l'élimination des chaînes de CS. Le greffage de liaisons azo sur la surface des HMSS a également été confirmé par un changement de couleur lors de la préparation de HMSS–N=N–COOH (encart Figure 3b). Le réactif HMSS–NH₂ est blanc, tandis que le produit HMSS–N=N–COOH était jaunâtre-brun après réaction de l'acide azobenzène-3,3′-dicarboxylique avec les groupes amino des HMSS. Le diamètre hydrodynamique (D_H) et l'indice de polydispersité (PDI) des HMSS, HMSS–NH₂ et HMSS–N=N–CS ont été déterminés dans l'eau distillée (Figure 3c). Les HMSS avaient un diamètre de 309 nm et un PDI de 0,190. Après ajout de groupes amines pour former HMSS–NH₂, le D_H a augmenté à 324 nm. Le diamètre de HMSS–N=N–CS était de 342 nm, plus grand que celui de HMSS–NH₂ en raison des chaînes de CS greffées. Le PDI de HMSS–N=N–CS (0,177) était plus faible que celui de HMSS–NH₂, indiquant une distribution de taille plus uniforme après greffage du CS. Comparés aux diamètres obtenus par MET, les diamètres mesurés par DLS étaient plus grands, car le D_H est mesuré en milieu aqueux avec une couche d'hydratation, tandis que la taille par MET provient de nanoparticules sèches. Les spectres FT-IR des HMSS–NH₂, HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS et CS sont montrés en Figure 3d. Comparés aux pics pour HMSS–NH₂, l'augmentation des pics d'absorption à 2853 et 2925 cm⁻¹ est attribuée à la vibration de –CH₂ dans le greffage de liaisons azo carboxy-terminées. Après ajout de CS sur la surface de HMSS–N=N–COOH, des augmentations des pics à 1660 cm⁻¹ et 3435 cm⁻¹ ont été observées, attribuées à υ_(C=O) dans la bande amide et à la vibration de N–H dans le CS. Tous ces résultats prouvent la préparation réussie de HMSS–N=N–CS.

État du médicament et efficacité de chargement

La DOX a été choisie pour étudier les comportements de chargement et de libération de HMSS–N=N–CS. Lorsque le pH de la suspension de nanoparticules HMSS–N=N–CS était ajusté à 3,5, le biopolymère CS devenait chargé positivement (pK_a du CS = 6,3) en raison des groupes amino protonés en milieu acide. Le polymère CS se chargeait positivement et gonflait, ouvrant les mésopores des HMSS par répulsion électrostatique entre les charges du CS. Ainsi, la DOX accédait aux mésopores des HMSS–N=N–CS par diffusion. Cependant, après ajustement du mélange chargé à pH 7,4, les chaînes de CS se déprotonaient et s'effondraient pour empêcher la libération prématurée de la DOX.

Le LE de HMSS–N=N–CS/DOX était de 35,2 %, bien supérieur à celui d'autres systèmes de libération de DOX basés sur la silice mésoporeuse. Ce LE élevé est attribué à la cavité creuse, à la grande surface spécifique et au réseau mésoporeux, servant de réservoir de médicament. L'état physique de la DOX dans HMSS–N=N–CS/DOX a été évalué par diffraction des rayons X sur poudre (DRX). Comme montré dans les profils DRX (Figure 4), la DOX brute présentait des pics de diffraction cristallins caractéristiques et intenses. Le mélange physique (MP) de HMSS–N=N–CS et DOX montrait également des pics cristallins évidents. Cependant, aucun pic cristallin distinct n'était exhibé par HMSS–N=N–CS/DOX, prouvant que l'état physique de la DOX était non cristallin en raison des contraintes de la structure mésoporeuse des HMSS.

Libération in vitro sensible aux enzymes en environnement colique simulé

Pour étudier la libération sensible aux enzymes de HMSS–N=N–CS, des nanoparticules HMSS–N=N–CS/DOX et HMSS/DOX ont été ajoutées dans du PBS pH 7,4 avec différentes concentrations de mélange enzymatique colique. Comme montré en Figure 5a, HMSS–N=N–CS/DOX présentait une libération lente de la DOX dans le PBS pH 7,4, le pourcentage cumulatif de libération n'étant que d'environ 10 % en 24 h, indiquant une bonne capacité de bouchage des polymères CS et liaisons azo. Comme prévu, en présence d'enzymes diluées dans le PBS pH 7,4, la libération cumulative de DOX s'améliorait à plus de 20 % sur la même période. De plus, la quantité de DOX libérée augmentait dramatiquement à près de 40 % en présence d'enzymes concentrées. Comparée à la libération sensible aux enzymes depuis HMSS–N=N–CS/DOX, la libération de DOX depuis HMSS/DOX montrait des tendances similaires en présence ou absence d'enzymes concentrées. Le pourcentage de libération relativement faible était dû à l'interaction électrostatique entre les HMSS chargés négativement et la DOX chargée positivement. Ces résultats prouvent que la libération de DOX depuis HMSS–N=N–CS/DOX était nettement accélérée par les enzymes extraites de la microflore des régions coliques. Le mécanisme de libération sensible aux enzymes pourrait être que les liaisons azo dans HMSS–N=N–CS sont dégradées par l'enzyme, causant le détachement du CS de la surface des HMSS et la libération rapide depuis les HMSS. Il a été rapporté que les liaisons azo peuvent être clivées par les enzymes sécrétées par la microflore colique.

De plus, pour évaluer davantage la libération sensible aux enzymes depuis HMSS–N=N–CS/DOX dans un environnement GI mimétique, les nanoplatformes HMSS–N=N–CS/DOX ont été initialement dispersées dans du JGS (jus gastrique simulé) pendant 2 h, puis dans du JIS (jus intestinal simulé) pendant 6 h, et enfin ajoutées dans du PBS pH 7,4 contenant 1 mg/mL d'enzymes extraites. Comme montré en Figure 5b, dans le jus gastrique simulé, la libération de DOX était relativement rapide, le montant cumulatif atteignant 15 % en 2 h. Cette libération rapide était due à l'interaction plus faible entre HMSS–N=N–CS et DOX en conditions acides qu'en conditions neutres. Ensuite, la libération de DOX ralentissait dans le JIS pendant 2-8 h. Cependant, après incubation de HMSS–N=N–CS/DOX avec les enzymes extraites dans le PBS pH 7,4, la libération de DOX continuait d'augmenter nettement, le montant cumulatif atteignant plus de 50 % en 24 h. La libération incomplète de la DOX depuis HMSS–N=N–CS/DOX était due à la forte interaction entre la DOX chargée positivement et les HMSS chargés négativement.

Adsorption des protéines et stabilité de HMSS–N=N–CS

Pour l'administration orale, les propriétés de surface des nanotransporteurs affectent inévitablement les comportements de libération du médicament et la bioadsorption. Un essai d'adsorption de protéines sur la surface a été utilisé pour évaluer l'effet du CS greffé sur la surface des HMSS. Comme montré en Figure 6a, les nanotransporteurs HMSS nus présentaient une adsorption dramatique de BSA jusqu'à 16,5 %, attribuée à la grande surface spécifique et à la cavité creuse des HMSS, leur forte capacité d'adsorption et les interactions non spécifiques entre les groupes silanol des HMSS et le BSA. De plus, HMSS–NH₂ présentait également une quantité relativement élevée de BSA adsorbé (10,2 %). Néanmoins, le pourcentage de BSA adsorbé sur la surface diminuait nettement à 2,5 % après l'ajout du polymère CS comme revêtement, réduisant ainsi considérablement l'effet sur le comportement in vivo de HMSS–N=N–CS. Pour observer davantage la stabilité des échantillons HMSS–N=N–CS et HMSS, 20 mg de chacun ont été ajoutés dans du PBS pH 7,4 et de l'eau déionisée. Comme montré en Figure 6b, bien que HMSS–N=N–CS et HMSS soient relativement stables dans l'eau, HMSS floculait rapidement dans le PBS pH 7,4. En revanche, la dispersibilité de HMSS–N=N–CS était évidemment améliorée après greffage du polymère CS sur les surfaces des HMSS. De plus, les transporteurs HMSS–N=N–CS restaient stables pendant plus de 12 h sans précipitation dans le PBS pH 7,4. Ces résultats prouvent que le revêtement par le polymère CS hydrophile améliore la dispersibilité et diminue l'adsorption de protéines sur la surface de HMSS–N=N–CS.

Absorption cellulaire

Les cellules Caco-2, cellules d'adénocarcinome colorectal épithélial humain, sont largement utilisées comme cellules modèles dans l'administration orale de médicaments. Comme montré en Figure 7a, les cellules Caco-2 incubées avec de la DOX libre montraient un signal de fluorescence relativement fort provenant de la DOX, car la DOX chargée positivement pouvait entrer dans la cellule puis dans le noyau. Comparé au groupe DOX libre, le groupe HMSS–N=N–CS/DOX montrait une intensité de signal de fluorescence plus faible en raison de la libération incomplète du médicament depuis HMSS–N=N–CS/DOX. Cependant, après préincubation de HMSS–N=N–CS/DOX avec le mélange enzymatique colique pendant 1 h, il montrait un signal de fluorescence nettement accru. Cela était attribué au clivage des liaisons azo par le mélange enzymatique, entraînant l'élimination du CS des surfaces des HMSS, accélérant ainsi significativement la libération de DOX depuis HMSS–N=N–CS/DOX. Pour évaluer quantitativement les différences d'absorption cellulaire pour HMSS–N=N–CS/DOX et HMSS–N=N–CS/DOX incubé avec enzymes extraites, la FCM a été utilisée. Comme montré en Figure 7b, l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) pour le groupe HMSS–N=N–CS/DOX était de 124,7, plus faible que celle du groupe DOX libre (p < 0,001). Excitamment, après préincubation de HMSS–N=N–CS/DOX avec le mélange enzymatique colique pendant 1 h, la MFI augmentait nettement à 357, dépassant même celle du groupe DOX libre grâce à la libération accélérée du médicament après rupture des liaisons azo. Tous ces résultats indiquaient que les liaisons azo dans HMSS–N=N–CS/DOX pouvaient être clivées en présence d'enzymes coliques, entraînant le détachement du CS de la surface des HMSS et l'accélération de la libération de DOX depuis les HMSS.

Évaluation de la viabilité cellulaire in vitro

Pour prouver l'effet de libération sensible aux enzymes de HMSS–N=N–CS/DOX en conditions coliques simulées, un essai de viabilité cellulaire in vitro a été réalisé sur des cellules Caco-2. Le médicament anticancéreux classique DOX a été utilisé. Avant cet essai, différentes concentrations de HMSS et HMSS–N=N–CS vides ont été employées pour déterminer la biocompatibilité de la nanoplatforme vis-à-vis des cellules Caco-2 et des cellules NIH-3T3 normales (fibroblastes d'embryon de souris) à diverses concentrations de 10 à 250 µg/mL par essai MTT. Comme montré en Figure 8a, b, HMSS et HMSS–N=N–CS à différentes concentrations montraient une cytotoxicité négligeable après incubation avec des cellules Caco-2 ou NIH-3T3, la viabilité des cellules Caco-2 étant de 87,9 % et 88,3 % à la concentration élevée de 100 µg/mL respectivement, ce qui est suffisant pour des applications cliniques en raison du chargement élevé de médicament des HMSS. De plus, les cellules NIH-3T3 incubées avec HMSS et HMSS–N=N–CS pendant 48 h présentaient une viabilité cellulaire élevée (supérieure à 80 %) à la concentration relativement élevée de 100 µg/mL. Ces résultats indiquent que HMSS et HMSS–N=N–CS sont cytocompatibles et peuvent être employés pour l'administration orale.

L'effet du nanotransporteur chargé en DOX HMSS–N=N–CS/DOX sur la viabilité des cellules Caco-2 est affiché en Figure 8c. La DOX libre montrait une cytotoxicité forte et concentration-dépendante vis-à-vis des cellules 4T1, attribuée au fait que la DOX libre chargée positivement pouvait traverser facilement les membranes des cellules 4T1. La valeur IC₅₀ pour le groupe DOX libre était de 10,18 µg/mL. Comparée à la DOX libre, HMSS–N=N–CS/DOX présentait une viabilité cellulaire plus élevée à la même concentration de DOX en raison de la libération incomplète de la DOX depuis HMSS–N=N–CS induite par les fortes interactions électrostatiques entre les transporteurs HMSS chargés négativement et la DOX chargée positivement. La valeur IC₅₀ pour le groupe HMSS–N=N–CS/DOX était de 32,22 µg/mL, bien plus élevée que pour la DOX libre. Cependant, HMSS–N=N–CS/DOX préincubé avec des enzymes coliques concentrées montrait une cytotoxicité évidente concentration-dépendante, et la valeur IC₅₀ était calculée à 9,41 µg/mL, bien plus faible que celle de HMSS–N=N–CS/DOX. Cette raison pourrait être attribuée à la dégradation des liaisons azo dans HMSS–N=N–CS par les enzymes coliques, entraînant le détachement du CS greffé de la surface des HMSS, causant la libération rapide de DOX depuis les transporteurs HMSS.

Études de toxicité

Les risques d'utilisation de HMSS–N=N–CS sont un facteur vital à considérer avant ses applications cliniques futures. La coloration H&E de l'irritation de la muqueuse gastro-intestinale est essentielle pour évaluer la biosécurité in vivo du système d'administration pour administration orale (Figure 9a). Comparé à un groupe sérum physiologique, les groupes HMSS et HMSS–N=N–CS ne présentaient pas de changements histopathologiques marqués ni d'hyperémie après administration orale pendant une semaine à une dose de 100 mg/kg. Aucun décès ou comportement inhabituel des rats n'a été observé. Une diminution du poids corporel est largement considérée comme un indice important et simple de toxicité systémique in vivo. Comme montré en Figure 9b, les poids corporels des souris dans les groupes HMSS et HMSS–N=N–CS augmentaient légèrement et étaient similaires à ceux du groupe sérum physiologique. Ces résultats indiquent que HMSS et HMSS–N=N–CS présentent une bonne biocompatibilité en tant que transporteurs de médicaments pour administration orale.

Conclusions

En résumé, du CS biodégradable a été attaché via des liaisons azo pour boucher les ouvertures des HMSS afin d'atteindre une administration de médicaments spécifique au côlon sensible aux enzymes. La DOX a été chargée dans la cavité creuse et les mésopores des HMSS sous forme non cristalline avec une efficacité de chargement élevée de 35,2 %. Les résultats de stabilité et d'adsorption de BSA illustrent que les portes de CS augmentent la biocompatibilité et la stabilité des HMSS. Les résultats de libération in vitro prouvent que HMSS–N=N–CS/DOX présente un comportement de libération de médicament sensible aux enzymes en présence d'enzymes coliques. Les résultats d'absorption par CLSM et FCM indiquent que l'absorption cellulaire de la DOX augmente évidemment après incubation de HMSS–N=N–CS/DOX avec le mélange enzymatique colique. Les résultats de viabilité cellulaire indiquent que HMSS–N=N–CS/DOX incubé avec des enzymes coliques montre une cytotoxicité accrue, la valeur IC₅₀ diminuant évidemment de 32,22 µg/mL pour HMSS–N=N–CS/DOX à 9,41 µg/mL après incubation.