Nanosphères de Silice Creuses Encapsulant la Peroxydase de Radis Noir pour la Détection Intracellulaire des ROS

Résumé

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) jouent un rôle clé dans la signalisation cellulaire, mais leur surproduction entraîne des dommages oxydatifs. Une quantification précise des ROS dans les cellules vivantes est donc essentielle pour la biologie fondamentale et le diagnostic clinique. Les sondes fluorogènes traditionnelles associées à la peroxydase de radis noir (HRP) souffrent de la faible perméabilité membranaire de l'HRP. Nous présentons ici des nanosphères de silice creuses encapsulant l'HRP (HRP@HSNs) fabriquées par une approche sol-gel templatée par microémulsion. Ces nanoréacteurs conservent une activité enzymatique robuste, traversent aisément les membranes cellulaires et présentent une excellente biocompatibilité. L'association HRP@HSNs avec la sonde dihydrorhodamine 123 (DHR123) a permis la détection qualitative et semi-quantitative du peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) intracellulaire dans des macrophages RAW 264.7 activés. La plateforme peut être facilement fonctionnalisée avec des ligands ciblant, offrant des capacités d'imagerie ROS spécifiques à des organelles ou types cellulaires.

Contexte

Les ROS — incluant le superoxyde, le peroxyde d'hydrogène, les radicaux hydroxyles, l'oxygène singulet et le peroxytrite — sont générés continuellement pendant le métabolisme aérobie, principalement par la chaîne de transport d'électrons mitochondriale. Les défenses antioxydantes, à la fois enzymatiques (ex. superoxyde dismutase, catalase, peroxydases) et non-enzymatiques (vitamines A, C, E, urate, bilirubine), neutralisent normalement ces espèces. Le déséquilibre conduit au stress oxydatif, endommageant l'ADN, les lipides, les protéines, et contribuant à des maladies comme le diabète, le cancer, les troubles cardiovasculaires et neurodégénératifs (Alzheimer, Parkinson) [1–5].

Les avancées récentes en microscopie fluorescente ont permis l'imagerie non-invasive des ROS au niveau monocellulaire, principalement via des sondes ratiométriques ou à base d'intensité qui deviennent fluorescentes lors de l'oxydation d'un précurseur non-fluorescent [6–8]. La spécificité est cruciale ; les sondes à base de boronate ciblent par exemple le H₂O₂ via une oxydation bioorthogonale [9]. Cependant, beaucoup de sondes sont instables in vivo, peu pénétrantes dans les tissus, et rapidement éliminées par voie rénale [12–14]. Des stratégies comme les liaisons stabilisatrices, les capteurs encodés génétiquement, les rapporteurs bioluminescents, ou les traceurs TEP ont été explorées [15–18]. Les nanoformulations améliorent davantage l'imagerie ROS en augmentant la spécificité et la sensibilité [19–22].

Les enzymes à forte activité catalytique sont de puissants biosenseurs, mais leur forme libre manque de stabilité et de perméabilité membranaire, limitant leur usage intracellulaire. Les capteurs HRP à base d'électrodes sont inadaptés à l'imagerie cellulaire vivante. L'encapsulation de l'HRP dans des coquilles nanoparticulaires peut protéger l'enzyme et faciliter sa délivrance intracellulaire, comme démontré avec les nanosphères de silice creuses (HSNs) [25–27]. Cette étude évalue les HRP@HSNs pour la détection intracellulaire des ROS, en évaluant le chargement, l'activité, l'internalisation cellulaire, la cytotoxicité, et l'imagerie fonctionnelle dans les macrophages.

Méthodes/Expérimental

Produits Chimiques et Réactifs

Décane, n-hexanol (98 %), hydroxyde d'ammonium (35 % p/p), TEOS (98 %), APTMS (95 %), FITC, et autres réactifs provenaient d'ACROS et Sigma-Aldrich. HRP (type VI-A), DHR123, PMA, et H₂O₂ (35 %) ont été achetés chez Cayman et SHOWA Chemical Industry. Tous les réactifs ont été utilisés tels que reçus.

Synthèse des Nanosphères de Silice Creuses (HSNs)

Les HSNs ont été préparées par microémulsion eau-dans-huile avec gravure sélective, suivant des protocoles de nos travaux antérieurs [25, 29]. Brièvement, 20 mL décane, 1,63 mL CA-520, et 550 µL n-hexanol ont été agités à 650 tr/min, puis 350 µL eau ont été ajoutés pour former la microémulsion. APTMS (25 µL, 200 µL dans 1,4 mL éthanol) et TEOS (100 µL) ont été introduits, suivis de 250 µL ammoniaque 35 % à 20 °C. Après 10 h, 95 % éthanol a déstabilisé l'émulsion ; les nanoparticules de silice solides (SSNs) ont été récupérées par centrifugation (11 000 tr/min, 20 min). Les SSNs ont été gravées dans l'eau à 40 °C pendant 40 min pour obtenir des coquilles creuses, puis lavées et stockées dans l'éthanol 99,5 %.

Synthèse des Nanosphères de Silice Creuses Encapsulant l'HRP (HRP@HSNs)

La procédure miroir la synthèse des HSNs, en remplaçant 350 µL d'eau par 350 µL d'HRP aqueuse (10 mg mL⁻¹). Les HRP@HSNs ont été stockées dans l'eau déionisée à 4 °C.

Synthèse des FITC-HSNs et HRP@FITC-HSNs

Pour introduire une fluorescence verte, le FITC-APTMS (10 mg FITC, 200 µL APTMS dans 1,4 mL éthanol, 18 h, obscurité) a remplacé l'APTMS éthanolique dans la synthèse, donnant des FITC-HSNs et HRP@FITC-HSNs.

Efficacité d'Encapsulation et Capacité de Chargement de l'HRP

L'HRP a été marquée au RITC pour créer RITC-HRP, encapsulée pour former RITC-HRP@HSNs. Après dissolution dans 1 M NaOH, la fluorescence a été mesurée (Hitachi F-4500, λ_ex = 543 nm, λ_em = 550–650 nm) et comparée à une courbe d'étalonnage. Efficacité d'encapsulation (%) = (masse de RITC-HRP dans nanosphères / RITC-HRP initial) × 100 ; capacité de chargement (µg HRP mg⁻¹ HSNs) calculée en conséquence.

Essai d'Activité HRP

L'activité HRP a été quantifiée avec le substrat chromogène TMB. Solutions enzymatiques (HRP native et HRP@HSN) mélangées avec 20 µM TMB et 20 µM H₂O₂ dans tampon phosphate/citrate (pH 5,2). L'absorbance à 655 nm enregistrée avec un lecteur BioTek Synergy ; activité déduite de la courbe d'étalonnage HRP native.

Essai de Réactivité avec Divers ROS

DHR123 (20 µM) avec ou sans HRP@HSNs (50 µg mL⁻¹) incubé avec 100 µM de ROS (H₂O₂, TBHP, superoxyde, •OH, •OtBu) dans DMEM (pH 7,4). Fluorescence (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm) mesurée toutes les 5 min sur 120 min.

Culture Cellulaire et Essai de Viabilité

Macrophages RAW264.7 cultivés dans DMEM + 10 % FBS + antibiotiques à 37 °C, 5 % CO₂. Pour la viabilité, 2 × 10⁵ cellules/puits ensemencées en plaques 24 puits ; après 24 h, exposition à 0–200 µg mL⁻¹ de nanoparticules dans DMEM sans sérum pendant 2 h. Réactif WST-1 (Clontech) utilisé pour évaluer la viabilité (450 nm, référence 650 nm) avec lecteur Bio-Rad 680.

Analyse d'Internalisation Cellulaire

1 × 10⁶ cellules RAW264.7/puits incubées avec 0–200 µg mL⁻¹ de nanoparticules marquées FITC pendant 2 h. Après lavage et trypsination, l'internalisation quantifiée par cytométrie de flux ; bleu de trypan a éteint la fluorescence extracellulaire.

Cytométrie de Flux de la Production ROS dans Macrophages Stimulés par PMA

Après 2 h exposition aux nanoparticules et 30 min chargement DHR123, cellules stimulées avec 1 µg mL⁻¹ PMA pendant 1 h avant analyse sur FACS Canto II.

Analyse Quantitative

Plaques 96 puits ensemencées avec 3 × 10⁴ cellules RAW264.7/puits. Après 2 h traitement nanoparticules et 1 h incubation PMA (varié) + DHR123 (20 µM), fluorescence (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm) mesurée. Courbe d'étalonnage (H₂O₂ + HRP@HSN) a permis conversion fluorescence en concentration H₂O₂.

Caractérisation

MET (JEOL JEM-1200 EX II, 100 kV) a confirmé cœurs creux de 45 nm ; coloration acétate d'uranyle a vérifié l'HRP interne. Diffusion dynamique de la lumière (Malvern Zetasizer Nano ZS) a évalué taille hydrodynamique et potentiel zêta ; cellules imagées avec Zeiss Axio Observer Z1.

Résultats et Discussion

Conception et Synthèse des HSNs et HRP@HSNs

Les HRP@HSNs ont été produites par chimie sol-gel catalysée par l'ammoniaque dans une microémulsion e/h (Schéma 1). MET (Fig. 1) montre des sphères monodisperses de 45 nm ; coloration acétate d'uranyle confirme l'encapsulation HRP dans la cavité creuse. DLS révèle diamètres hydrodynamiques de 188 ± 4 nm (HSNs) et 184 ± 6 nm (HRP@HSNs) dans l'eau, augmentant à 1,8–1,7 µm en DMEM sans sérum par agrégation. L'albumine sérique bovine (BSA) réduit cette agrégation, donnant des particules stables de 195–197 nm.

Efficacité d'Encapsulation et Capacité de Chargement HRP

L'encapsulation RITC-HRP a donné ~6 % d'efficacité pour 11–33 nmol chargement ; capacité maximale 12,5 ± 1,2 µg HRP mg⁻¹ HSN à 33,3 nmol entrée. Bien que l'efficacité soit modeste, cela démontre que l'HRP peut être retenue dans la nanocavité, et le chargement ajustable par concentration enzymatique.

Cytotoxicité et Internalisation Cellulaire

Essais WST-1 montrent aucune réduction significative de la prolifération RAW264.7 après 2 h ou 26 h exposition jusqu'à 200 µg mL⁻¹ HSNs ou HRP@HSNs, indiquant faible cytotoxicité. Particules marquées FITC ont atteint >80 % efficacité de marquage à >50 µg mL⁻¹ après 2 h, confirmant une délivrance intracellulaire efficace sans compromettre la viabilité.

Réactivité des HRP@HSNs à Divers ROS

Essai activité HRP montre ~40 % rétention activité native après encapsulation, probablement par limitations de diffusion à travers la coquille de silice. En essais acellulaires, DHR123 seul ne répond pas au H₂O₂ ou superoxyde mais réagit fortement avec •OH et •OtBu. HRP ou HRP@HSNs amplifient nettement la fluorescence pour tous ROS testés, signal plus fort pour HRP native corrélant avec son activité supérieure. Ratios fluorescence relative à 60 min révèlent que les deux variants HRP améliorent la détection de H₂O₂ et superoxyde, confirmant que la nanocavité préserve la fonction catalytique tout en permettant la diffusion des substrats.

Détection Intracellulaire ROS avec HRP@HSNs

Cellules RAW264.7 pré-traitées HRP@HSNs (2 h) et chargées DHR123 (30 min) ont affiché fluorescence nettement supérieure après stimulation PMA versus contrôles. Cytométrie de flux montre augmentation >2 fois fluorescence R123 dans cellules stimulées ; HRP@HSNs apportent activité catalytique additionnelle, tandis que HSNs simples produisent hausse modeste, reflétant probablement réponses cellulaires au stress. Intensité fluorescence augmentée dose-dépendamment avec PMA (0,1–2 µg mL⁻¹) et HRP@HSNs (50–200 µg mL⁻¹). Images confocales représentatives confirment imagerie ROS intracellulaire améliorée (Fig. 3d).

Application des HRP@HSNs pour Analyse Quantitative H₂O₂

Utilisant courbe d'étalonnage H₂O₂ externe (0,625–15 µM), H₂O₂ endogène généré par macrophages RAW264.7 stimulés PMA quantifié. Cellules traitées 100 µg mL⁻¹ HRP@HSNs et 20 µM DHR123, puis exposées 0,1–2 µg mL⁻¹ PMA, ont donné concentrations H₂O₂ endogène ~10 µM à ≥0,25 µg mL⁻¹ PMA. Cette mesure semi-quantitative démontre l'utilité de la plateforme pour évaluer le stress oxydatif en cellules vivantes.

Conclusions

Nous avons conçu des nanosphères de silice creuses encapsulant l'HRP active, créant des capteurs ROS intracellulaires robustes. La coquille de silice poreuse permet aux petits substrats d'atteindre l'enzyme piégée tout en protégeant l'HRP de la protéolyse. Associées au DHR123, les HRP@HSNs offrent une détection amplifiée, semi-quantitative, du H₂O₂ endogène dans les macrophages sous stress oxydatif. La fonctionnalisation de surface avec anticorps ou peptides permettra le ciblage organelle- ou cellule-tumorale-spécifique, et charges alternatives (ex. nanocatalyseurs ou sondes boronate) élargiront le répertoire de détection. Ces nanoréacteurs représentent une plateforme polyvalente pour l'imagerie, la quantification et la délivrance thérapeutique ciblée simultanées de ROS en recherche biomédicale et diagnostic clinique.

Abréviations

APTMS

3-Aminopropyltriméthoxysilane

BSA

Albumine sérique bovine

DHR123

Dihydrorhodamine 123

DLS

Diffusion dynamique de la lumière

FITC

Fluorescéine isothiocyanate

HRP

Peroxydase de radis noir

HSNs

Nanosphères de silice creuses

Igepal CA‑520

Polyoxyéthylène (5) éther isooctylphényle

mETC

Chaîne de transport d'électrons mitochondriale

PET

Tomographie par émission de positons

PMA

Phorbol 12-myristate 13-acétate

R123

Rhodamine 123

RITC

Rhodamine B isothiocyanate

ROS

Espèces réactives de l'oxygène

SSN

Nanoparticule de silice solide

TBHP

Peroxyde de tert-butyle

TEM

Microscopie électronique à transmission

TEOS

Tétraéthyl orthosilicate

TMB

3,3'5,5'-Tétraméthylbenzidine