Nanotubes de carbone à paroi unique ciblés pour la thérapie photothermique combinés à l'inhibition du point de contrôle immunitaire pour le traitement du cancer du sein métastatique

Introduction

Les métastases et les conséquences de leur traitement sont la principale cause de décès par cancer [1]. Par exemple, lorsque le cancer du sein se métastase, les taux de survie des patientes à 5 ans tombent en dessous de 25 %. Même si au cours des 60 dernières années, plus de 200 nouveaux médicaments antinéoplasiques ont amélioré les résultats des patients, la survie globale reste faible dans la maladie métastatique [2]. Ici, une nouvelle combinaison de thérapie photothermique facilitée par un bioconjugué de nanotube de carbone à paroi unique (SWCNT) ciblé sur une tumeur et une inhibition du point de contrôle de la protéine 4 associée aux lymphocytes T anti-cytotoxique (anti-CTLA-4) est étudiée pour le traitement du cancer du sein métastatique dans un modèle murin orthotopique.

Les propriétés uniques des SWCNT en tant que nanomatériau ont suscité un intérêt considérable pour leur utilisation comme outil potentiel dans la lutte contre le cancer. Alors que les SWCNT exercent une variété d'effets biologiques, l'utilisation des SWCNT dans le traitement du cancer s'est principalement concentrée sur leur interaction avec la lumière proche infrarouge (NIR) et l'effet photothermique qui en résulte, où les SWCNT chauffent rapidement la tumeur dans le processus appelé thérapie photothermique. (PTT). De nombreux groupes ont étudié le potentiel d'utilisation des SWCNT dans les stratégies de traitement basées sur le PTT dans plusieurs modèles de cancer du sein [3,4,5,6,7,8,9,10]. Ces travaux se sont concentrés en grande partie sur la capacité du PTT à traiter les tumeurs primaires à des profondeurs ne dépassant pas plusieurs mm, où l'atténuation de la lumière NIR est presque complète.

Auparavant, nous avons montré que les tumeurs mammaires orthotopiques primaires chez les souris syngéniques pouvaient être presque complètement éliminées en utilisant une lumière laser NIR douce en conjonction avec un bioconjugué SWCNT améliorant la photothermie [11]. Dans ce bioconjugué, les SWCNTs ont été fonctionnalisés avec la protéine annexine A5 (ANXA5), qui se lie avec une haute affinité au phospholipide anionique phosphatidylsérine exprimé en externe sur les cellules tumorales et sur les cellules endothéliales du système vasculaire tumoral, mais pas sur les cellules normales du système vasculaire. 12,13,14]. Ce conjugué a été visualisé par microscopie à force atomique (AFM) pour montrer que la hauteur du conjugué était comprise entre 2,5 et 5,0 nm, ce qui est similaire à celui des autres conjugués SWCNT-protéine [11]. Bien que capable d'éradiquer les tumeurs primaires dans ce modèle métastatique précédent, la thérapie photothermique seule n'a que modestement prolongé la survie. Cependant, nous avons trouvé des preuves préliminaires suggérant qu'un traitement concomitant avec des immunomodulateurs tels que le cyclophosphamide était capable d'augmenter la survie.

Récemment, le potentiel d'immunomodulateurs tels que le cyclophosphamide pour améliorer de manière synergique le PTT dirigé par SWCNT a fait l'objet de beaucoup d'intérêt. Une catégorie d'agents immunomodulateurs prometteurs sont les inhibiteurs de points de contrôle. Les inhibiteurs de point de contrôle sont des anticorps tels que l'anti-CTLA-4, l'anti-PD-1 et l'anti-PDL-1 qui se lient à des protéines cellulaires critiques responsables de la modulation de la réponse de l'organisme au cancer. Ces anticorps bloquent les principaux « points de contrôle » biologiques où le corps peut réguler à la baisse la réponse du système immunitaire au cancer. Ces protéines jouent normalement un rôle important dans le contrôle de la réponse immunologique du corps. En bloquant l'action de ces protéines, les inhibiteurs de points de contrôle suppriment un mécanisme par lequel le système immunitaire supprime normalement sa réponse antitumorale naturelle. Récemment, plusieurs groupes ont observé que la combinaison de l'inhibition du point de contrôle anti-CTLA-4 avec le PTT amélioré par SWCNT a le potentiel de promouvoir une réponse immunitaire robuste dans le cancer du sein [15, 16].

Dans la présente étude, nous évaluons la combinaison de notre nouvelle modalité PTT en conjonction avec l'agent immunostimulant anti-cytotoxique T-lymphocyte-associated protein 4 (anti-CTLA-4). Initialement approuvé pour le traitement du mélanome métastatique [17], l'anti-CTLA-4 est maintenant testé pour le traitement du cancer du sein dans des essais cliniques en association avec d'autres agents immunostimulants [18]. Nous évaluons le mécanisme de l'immunité antinéoplasique renforcée dans le PTT en combinaison avec l'inhibition du point de contrôle anti-CTLA-4, ainsi que le devenir à plus long terme des SWCNT dans les organes cibles.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Le plasmide codant pour ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, a été préalablement construit dans ce laboratoire [11]. L'albumine sérique bovine (BSA), le Triton X-100, l'EDTA, le β-mercaptoéthanol, le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et le tampon Tris-acétate-EDTA provenaient de Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Le phosphate de sodium et le dodécyl sulfate de sodium (SDS) provenaient de Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). L'éthanol de qualité HPLC provenait d'Acros Organics (Waltham, MA). Les colonnes His-trap provenaient de GE Healthcare (Chicago, IL). Le tampon de coloration de cytométrie en flux, le tampon de fixation/perméabilisation, le tampon de perméabilisation, le kit de quantification des endotoxines chromogènes et les cassettes de dialyse Slide-A-Lyzer (3,5 kDa) provenaient de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Les membranes de dialyse de 2 et 100 kDa provenaient de Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Le milieu cellulaire du Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) et la solution saline équilibrée de Hank provenaient de l'ATCC (Manassas, VA). Le sérum fœtal bovin (FBS) provenait d'Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). La tryptone, l'extrait de levure et le monosulfate de kanamycine ont été obtenus auprès d'Alfa Aesar (Ward Hill, MA). L'hydroxyde de sodium, le chlorure de potassium et le chlorure de sodium provenaient de VWR Inc (Radnor, PA). La protéase HRV-C3 provenait de Sino Biologics (Portland, OR). L'anticorps monoclonal de souris anti-CTLA-4 (clone :9H10) et les kits ELISA de cytokine de souris (TNF-α, IFN-γ, IL-6) ont été obtenus auprès de BioLegend (San Diego, CA). Les SWCNT CoMoCAT (diamètre moyen 0,8 ± nm, longueur moyenne 1,5 ± 0,5 µm) ont été obtenus auprès de CHASM (Boston, MA). La méthode CoMoCAT est connue pour produire des SWCNT d'un petit nombre de (n ,m ) chiralités à haute sélectivité [19]. L'échantillon utilisé dans cette étude est fortement enrichi en [5, 6] SWCNTs, qui présente une forte absorption de la lumière NIR à une longueur d'onde de 980 nm. Cette absorption correspond au S₁₁ transition pour ce type de nanotube entre une singularité de van Hove occupée et une inoccupée correspondante. Par conséquent, pour maximiser l'absorption du rayonnement par le SWCNT déposé sur les tumeurs, la longueur d'onde du laser utilisé dans cette étude était de 980 nm pour correspondre exactement à celle du S₁₁ transition optique [20]. La figure S1 dans le fichier supplémentaire 1 montre les spectres de fluorescence, montrant clairement le S₁₁ Émission NIR après excitation de la transition S22 avec la lumière visible.

Culture cellulaire

Des cellules de cancer du sein EMT6 d'ATCC (Manassas, VA) ont été cultivées dans du milieu MB 752/1 de Waymouth avec 2 mM de L-glutamine additionnée de 15 % de FBS. Toutes les cellules ont été cultivées à 37 °C et 100 % d'humidité sous 5 % de CO₂ . Toutes les cellules ont été repiquées en utilisant 0,25% (p/v) de trypsine dans 0,53 mM d'EDTA. La lignée cellulaire et le statut d'absence de mycoplasmes ont été confirmés par des tests STR (Charles River) et testés comme étant exempts d'endotoxines par test de limulus.

Production ANXA5 et SWCNT-ANXA5

Le conjugué SWCNT-ANXA5 a été préparé en utilisant une procédure que nous avons développée précédemment qui donne 2,5 mg d'ANXA5/mg SWCNT [11]. Brièvement, E. coli transfectés avec un plasmide codant pour ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, ont été cultivés et purifiés par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé avec Ni ²⁺ immobilisé pour isoler l'ANXA5, ce qui impliquait un clivage enzymatique pour éliminer un (His)₆ étiqueter. Des SWCNT CoMoCAT lyophilisés ont été dispersés dans du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 1 % en utilisant deux cycles de sonication de sonde à 20 W et une centrifugation à 29 600 g pendant 30 min chacun. Les SWCNT en suspension ont été caractérisés par fluorescence NIR (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1), puis conjugués à un linker 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-polyéthylène glycol-maléimide (DSPE-PEG-maléimide) pendant 30 min à température ambiante pour permettre une interaction hydrophobe entre les SWCNTs et la fonction DSPE. Cela a ensuite été suivi d'une dialyse de 8 h dans de l'eau distillée pour éliminer l'excès de lieur et de SDS. Le conjugué dialysé a ensuite été mis à réagir avec ANXA5, qui contient un groupe cystéine, pendant 2 h et bloqué avec 1,5 mg ml ⁻¹ L-cystéine. Le produit final, SWCNT-ANXA5, a été dialysé contre 20 mM de tampon phosphate de sodium pendant 8 h pour éliminer l'excès d'ANXA5 et de L-cystéine. Le poids et la pureté des protéines ont été caractérisés par SDS-PAGE. La teneur en SWCNT et ANXA5 du bioconjugué a été caractérisée par spectroscopie de fluorescence UV-Vis-NIR, analyse Raman par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) et dosage de Bradford (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2).

Études in vivo

Toutes les procédures étaient conformes à un protocole approuvé par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l'Université de l'Oklahoma. Des souris femelles BALB/cJ âgées de 6 semaines ont été utilisées (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Les souris ont été nourries avec un régime alimentaire standard. Au cours de l'irradiation photothermique des tumeurs avec une lumière laser NIR, des souris ont été anesthésiées avec 2 % d'isoflurane et 98 % d'oxygène à l'aide d'un cône nasal.

Les tumeurs ont été induites par injection orthotopique de 10 ⁶ Cellules de cancer du sein de souris EMT6 dans 100 µL de PBS dans le coussinet adipeux mammaire IV. Les tumeurs ont pu se développer pendant 12 jours et lorsqu'elles ont atteint un volume de 60 mm ³ (~ 5 mm de diamètre), les souris ont reçu une injection systémique i.v. injection de 1,2 mg/kg de SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT par kg de poids corporel) bioconjugué via la veine caudale latérale. Après 3 h, une région de 5 mm au-dessus de la limite de la tumeur a été irradiée avec de la lumière NIR (980 nm) à un niveau d'énergie et de puissance de 175 J/cm ² et 1 W/cm ² , respectivement (temps de 175 s ; laser Diodevet-50 NIR, B&W Tek Inc., Newark, DE). L'inhibition du point de contrôle a été accomplie par l'i.p. administration de 200 µg d'anticorps anti-CTLA-4 dans 100 µl de PBS aux jours 8, 11 et 16 après l'inoculation de la tumeur. Le volume tumoral a été calculé avec la formule ellipsoïde modifiée \(V =\frac{1}{2} \times {\text{length}} \times {\text{width}}^{2}\) en utilisant des mesures au pied à coulisse de la dimension la plus longue et largeur perpendiculaire. La température de la tumeur a été surveillée par une caméra thermique portable FLIR TG165 Spot (Raymarine ITC, Fareham, Royaume-Uni) réglée pour rechercher automatiquement la température maximale détectée. Les organes cibles ont été prélevés pour l'évaluation de la toxicité et fixés dans du formol tamponné neutre à 10 %, et des lames FFPE colorées ont été préparées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour une analyse de toxicité.

Détection SWCNT Ex Vivo

Les souris ont reçu une injection systémique de 1,2 mg/kg de SWCNT-ANXA5 (mg de SWCNT/kg de poids corporel) via la veine caudale latérale. À certains moments, les souris (n = 3) ont été euthanasiés, autopsiés et les organes cibles prélevés pour analyse. Des échantillons de tissus ont été préparés comme décrit précédemment [21]. La présence de SWCNT dans des échantillons de tissus ex vivo a ensuite été déterminée par spectroscopie de fluorescence NIR relative à l'aide d'un NanoSpectralyzer NS3 (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).

Cytométrie en flux

Les souris ont été euthanasiées 14 jours après le traitement, et les cellules effectrices immunitaires antitumorales spléniques ont été quantifiées comme décrit précédemment [21].

Détection de cytokines

Après le traitement décrit ci-dessus, les souris (n = 4–5) ont été euthanasiés 7 jours après la thérapie photothermique pour le prélèvement sanguin. La concentration du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), de l'interféron gamma (IFN-γ) et de l'interleukine 6 (IL-6) dans des échantillons de sérum dilué a été quantifiée par ELISA selon le protocole du fournisseur.

Analyse statistique

Les données ont été analysées avec le logiciel Graphpad Prism. La signification statistique a été évaluée à l'aide d'une ANOVA à un facteur et d'un test de comparaisons multiples de Tukey-Kramer. La signification statistique des courbes de survie a été déterminée par le test du log-rank de Mantel-Haenszel. La signification statistique de la concentration sérique de cytokines a été analysée par ANOVA à un facteur et le test de comparaisons multiples de Dunnett. Les comparaisons multiples ont été corrigées par le seuil de Bonferroni. L'erreur est représentée graphiquement comme une erreur standard de la moyenne à moins que l'erreur n'ait pas dépassé la taille du symbole du point moyen tracé, auquel cas les barres ont été exclues pour plus de clarté.

Résultats

Cinétique thermique

En utilisant une dose de 1,2 mg/kg de SWCNT-ANXA5, la température maximale des tumeurs a été enregistrée au cours du traitement avec la lumière NIR, comme indiqué sur la figure 1. Les souris ayant reçu SWCNT-ANXA5 avant l'irradiation présentaient des températures tumorales plus élevées pour le tout le traitement à la lumière NIR par rapport aux souris qui ont reçu une solution saline physiologique. La température moyenne de la tumeur pour les souris recevant SWCNT-ANXA5 était significativement différente de celle des souris recevant une solution saline physiologique (54 °C contre 37 °C, p < 0,05). À la suite de cette thérapie photothermique améliorée, seul le groupe SWCNT-ANXA5 a vu l'ablation de la tumeur visible. L'ablation de la tumeur était caractérisée par une décoloration rapide, suivie d'une contracture cutanée et de l'apparition de rides. En moins de 48 h, une escarre importante s'est formée sur le site de l'ablation photothermique. La repousse complète de la peau a pris plusieurs semaines.

Cinétique thermique résultant du rayonnement des tumeurs avec la lumière NIR à 980 nm. Des souris BALB/cJ portant des tumeurs EMT6 ont été injectées par voie i.v. dans la veine caudale avec 1,2 mg/kg de SWCNT-ANXA5. Après avoir attendu 3 h pour permettre l'élimination des SWCNT de la circulation, les tumeurs ont été irradiées avec un laser NIR à une densité d'énergie et de puissance de 175 J/cm ² et 1 W/cm ² , respectivement (t = 175 s). La température maximale de la tumeur a été enregistrée en fonction du temps. La température des tumeurs des souris recevant SWCNT était significativement plus élevée que celle des souris recevant du sérum physiologique à t = 175 s (p < 0,05). Les données sont présentées sous forme de moyenne  ± SE (n = 3)

Thérapie photothermique et inhibition des points de contrôle

Les résultats de la combinaison de la thérapie photothermique et de l'inhibition du point de contrôle à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-CTLA-4 sont illustrés à la Fig. 2. Alors que la thérapie photothermique seule a facilement éradiqué la néoplasie primaire du cancer du sein, l'incapacité de la lumière laser NIR à pénétrer au-delà de quelques mm a limité la traitement des métastases du cancer du sein. Afin de surmonter les lacunes du traitement antinéoplasique photothermique NIR localisé, nous avons exploré la combinaison de cette modalité de traitement thérapeutique unique avec l'inhibition systémique des points de contrôle (Fig. 2). Alors que la thérapie photothermique a excellé dans la destruction des tumeurs primaires EMT6 (Fig. 2a), ce traitement n'a pas réussi à éradiquer les métastases et n'a augmenté que modestement la survie des souris porteuses de tumeurs orthotopiques EMT6 (Fig. 2b). En revanche, l'inhibition du point de contrôle avec l'anti-CTLA-4 a amélioré la survie globale mais n'a retardé que temporairement la croissance de la tumeur primaire. Bien qu'aucune des thérapies seule n'ait entraîné d'augmentation de la survie globale, la combinaison de la thérapie photothermique améliorée SWCNT-ANXA5 et de l'inhibition du point de contrôle anti-CTLA-4 a amélioré la survie globale, conduisant à une survie de 55 % 100 jours après l'inoculation de la tumeur.

Résultats de la thérapie photothermique combinatoire (PTT) et de l'inhibition des points de contrôle (anti-CTLA-4) dans les tumeurs EMT6. Souris avec des tumeurs syngéniques orthotopiques bien développées (d ≥ 5 mm) ont reçu une injection i.v. dose systémique de 1,2 mg/kg de SWCNT-ANXA5. un Les volumes tumoraux ont ensuite été surveillés après irradiation (flèche) avec une lumière laser NIR pendant 175 s à une densité de puissance de 1 W/cm ² au jour 12 suivant l'inoculation. En plus du PTT, des groupes sélectionnés ont reçu de l'anti-CTLA-4 (100 ug) aux jours 8, 11 et 16. Les souris du groupe témoin ont reçu une injection i.v. avec du sérum physiologique. Volume tumoral indiqué comme moyen ± SE (n = 7). La significativité par rapport au témoin est indiquée par * (p < 0,05). b L'association de la thérapie photothermique et de l'inhibition du point de contrôle immunitaire a significativement augmenté la survie par rapport aux témoins (p < 0,05, n = 7). c , d Ce n'est que lorsque les souris ont reçu une thérapie photothermique en conjonction avec l'inhibition du point de contrôle anti-CTLA-4 que le nombre relatif de CD4 ⁺ a augmenté de manière significative. et CD8 ⁺ splénocytes observés 2 semaines après le PTT. Splénocytes indiqués comme moyens ± SE (n = 3). L'importance est indiquée par *** (p < 0.005)

L'analyse cytométrique des cellules effectrices de la rate après le traitement a révélé un mécanisme putatif d'amélioration de la survie chez les souris recevant une thérapie photothermique combinatoire et une inhibition des points de contrôle. Les souris ont été inoculées avec EMT6 et traitées comme décrit précédemment. Deux semaines après le traitement, les souris ont été sacrifiées et les pourcentages et le nombre relatif de plusieurs types d'effecteurs immunitaires ont été quantifiés. Les populations de cellules T auxiliaires, de cellules T cytotoxiques, de neutrophiles, de monocytes de cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC), de cellules T régulatrices FoxP3 et de macrophages ont été évaluées (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3). L'analyse de ces populations a révélé des différences significatives entre les populations de traitement et les témoins uniquement chez les souris qui ont reçu la combinaison à la fois de la thérapie photothermique et de l'inhibition du point de contrôle anti-CTLA-4. Chez les animaux qui ont reçu cette combinaison, nous avons observé une augmentation du nombre relatif de cellules T auxiliaires (CD4 ⁺ ) et les cellules T cytotoxiques (CD8 ⁺ ), (Fig. 2c, d). Augmentation des CD4 ⁺ et CD8 ⁺ le nombre de cellules était en corrélation avec les augmentations importantes de la taille de la rate observées après l'autopsie.

En plus de l'analyse cytométrique des cellules effectrices de la rate, la concentration sérique de cytokines a été déterminée 7 jours après le PTT pour aider à élucider les mécanismes de l'immunité antitumorale. Les niveaux des cytokines pro-inflammatoires IL-6, IFN-γ et TNF-α sont présentés sur la figure 3. Ni le SWCNT ni le traitement anti-CTLA-4 seuls n'ont significativement augmenté les niveaux de cytokines par rapport au groupe témoin non traité. Cependant, le traitement PTT seul a pu augmenter significativement le TNF-α. L'ajout supplémentaire d'anti-CTLA-4 au traitement PTT a significativement augmenté les niveaux de TNF-α, IL-6 et IFN-γ.

Concentration sérique de cytokines. La quantification des niveaux de cytokines sériques dans le sérum de souris 7 jours après le PTT a montré une augmentation significative des niveaux d'IL-6, d'IFN-γ et de TNF-α chez les souris après le PTT en conjonction avec l'inhibition du point de contrôle (anti-CTLA-4). Les résultats sont présentés pour le contrôle non traité, le traitement SWCNT uniquement, le traitement anti-CTLA-4 uniquement, le traitement PTT et le traitement PTT + anti-CTLA-4. Les données sont présentées sous forme de moyenne  ± SE (n = 4–5). La signification statistique a été analysée pour les groupes traités par rapport au groupe témoin non traité par ANOVA à un facteur avec le test de comparaisons multiples de Dunnett. La signification statistique est indiquée par * (p < 0,05) et **** (p < 0,0001)

Biodistribution et toxicité de SWCNT-ANXA5

La biodistribution de SWCNT-ANXA5 après administration pour l'amélioration de la thérapie photothermique dans divers organes a été surveillée avec une quantification fluorescente de SWCNT dans des lysats tissulaires ex situ par rapport aux normes (Fichier supplémentaire 1 :Figure S4). La biodistribution dans les organes cibles a été suivie sur une période de 4 mois après i.v. injection de 1,2 mg/kg de SWCNT-ANXA5 chez des souris saines (Fig. 4a, b). En revanche, l'accumulation de SWCNT-ANXA5 chez des souris porteuses de tumeurs EMT6 après l'administration, selon le protocole d'injection décrit précédemment, a été déterminée 3 h après l'administration. (L'heure à laquelle la thérapie photothermique a été effectuée dans l'étude de traitement.) Au cours de la période de 4 mois précédant le prélèvement d'organes, les souris ont été surveillées pour les effets secondaires physiques et le comportement anormal. Aucun effet secondaire n'a été observé chez les souris ayant reçu une injection de SWCNT-ANXA5 pendant cette période. Aucune toxicité histopathologique n'a été observée lors de l'examen des coupes FFPE colorées à l'hématoxyline et à l'éosine des organes cibles à la fin de l'étude (Fichier supplémentaire 1 :Figure S5).

Biodistribution de SWCNT-ANXA5 mesurée en % de la dose injectée (a ) et concentration tissulaire en g/L (b ). Le conjugué SWCNT-ANXA5 était i.v. injecté à des souris Balb/cJ à une dose de 1,2 mg/kg. La concentration de SWCNT a été mesurée dans divers organes de souris sans tumeurs après 1, 2, 3 et 4 mois (de gauche à droite). Pour les souris atteintes de tumeurs, la concentration de SWCNT a été mesurée à l'époque comme elle le serait immédiatement avant le traitement de thérapie photothermique. Les données sont affichées sous forme de moyenne ± SE (n = 3)

Discussion

Les données présentées ici soutiennent l'efficacité de la combinaison d'une thérapie photothermique ciblée et d'une inhibition des points de contrôle immunitaire pour le traitement du cancer du sein métastatique. Ce phénomène est connu sous le nom d'« effet abscopal », qui décrit la capacité d'un rayonnement localisé à initier une réponse antitumorale qui supprime la croissance tumorale à distance de la cible principale. Dès les années 1950, les chercheurs ont observé que l'irradiation tumorale localisée avait un effet significatif sur les tumeurs distantes [22]. Des études ont établi que la nature systémique de l'effet abscopal est due à la réponse immunitaire de l'hôte [23,24,25]. Alors que l'irradiation γ a été le principal objectif de la plupart des recherches abscopales, un nombre croissant de travaux démontre que la thérapie photothermique peut également induire un effet abscopal. De nombreuses études ont démontré que l'ablation thermique en combinaison avec l'inhibiteur de point de contrôle anti-CTLA-4, produit une réponse immunitaire accrue [16, 26, 27, 28, 29]. Nous observons une réponse abscopale similaire après une ablation photothermique ciblée et un blocage anti-CTLA-4 dans le modèle EMT6 de cancer du sein.

L'effet abscopal est illustré par les données de la Fig. 2a, b. Les tumeurs orthotopiques EMT6 se développent rapidement et ont métastasé au moment où elles sont traitées par thérapie photothermique. C'est la raison pour laquelle les souris atteintes de tumeurs traitées uniquement par thérapie photothermique n'ont eu qu'une légère augmentation de la survie par rapport aux souris témoins non traitées, même si la tumeur primaire avait été complètement supprimée. L'administration d'anti-CTLA-4 seul a retardé la croissance tumorale par rapport au témoin et augmenté le temps de survie à 68 jours, mais n'a pas conduit à la guérison. Un résultat similaire de croissance tumorale EMT6 retardée a été observé par Jure-Kunkel et al. lors de l'administration d'anti-CTLA-4 [30]. Pour l'association de la thérapie photothermique et de l'anti-CTLA-4, 55 % des souris traitées ont survécu 100 jours après l'inoculation de la tumeur et sont probablement guéries.

Un aperçu du mécanisme de l'immunité antitumorale a été évalué en utilisant la cytométrie en flux pour quantifier les populations de cellules effectrices immunitaires dans la rate. Par rapport à la thérapie photothermique ou à l'anti-CTLA-4 seul, la thérapie combinée a entraîné une multiplication par sept des CD4 auxiliaires ⁺ Cellules T et multiplication par trois des CD8 cytolytiques ⁺ lymphocytes T, ces deux résultats étant statistiquement très significatifs (p < 0,005). Ces résultats fournissent une preuve supplémentaire d'une réponse abscopale potentielle par la combinaison de la photothérapie et de la thérapie de co-stimulation des lymphocytes T avec inhibition du point de contrôle immunitaire.

Augmentation des CD4 ⁺ et CD8 ⁺ le nombre de cellules était en corrélation avec les augmentations de la taille de la rate observées lors de l'autopsie. Une augmentation de la taille de la rate indique une réponse immunitaire accrue. La rate est composée de plusieurs types cellulaires, dont les plus courants sont les CD4 ⁺ , CD8 ⁺ , et des lignées de cellules B [31, 32]. Bien que cela ne soit pas exploré dans cet ensemble de travaux, nous nous attendons à ce que le nombre de lymphocytes B augmente avec les CD4 ⁺ et CD8 ⁺ nombre de lymphocytes T [33]. Aide CD4 ⁺ Les cellules T contribuent à l'immunité humorale en facilitant d'autres cellules immunitaires par la stimulation des cytokines et les interactions cellule-cellule directes. CD8 cytolytique ⁺ Les cellules T tuent directement les cellules tumorales. Augmentation des CD4 ⁺ et CD8 ⁺ le nombre de cellules indique une réponse immunitaire abscopale systémique.

La présence d'une réponse immunitaire abscopale systémique après le traitement combiné est en outre confirmée par des augmentations des taux de cytokines pro-inflammatoires dans le sérum de souris (Fig. 3). Le TNF-α active les macrophages associés aux tumeurs pour présenter des effets antitumoraux [34, 35]. L'IFN-γ joue un rôle important dans la surveillance des tumeurs [36, 37]. L'IL-6 favorise la prolifération des macrophages et des lymphocytes [38]. L'augmentation significative de ces molécules effectrices dans le sérum de souris 7 jours après le traitement par PTT associé à un anti-CTLA-4 soutient en outre l'existence d'une réponse immunitaire antitumorale.

À la fin de l'irradiation des souris ayant reçu des SWCNT, la température maximale moyenne de la tumeur était de 54 °C ; cette température était suffisante pour l'ablation complète de la tumeur (Fig. 1). C'est dans la plage de 45 à 60 °C dans laquelle l'inactivation enzymatique et les lésions mitochondriales se produisent [39]. La température des tumeurs dans le groupe témoin salin est restée inférieure à 40 °C, une température qui offre un bénéfice thérapeutique minimal [39,40,41].

Nous avons observé que la majorité de l'accumulation de SWCNT-ANXA5 basée sur la concentration était principalement dans le foie, le cœur, la rate, les reins, les poumons et la tumeur (Fig. 4a). Chez les souris atteintes de tumeurs EMT6, nous avons observé que la concentration de SWCNT-ANXA5 était similaire à celle du foie et des reins (Fig. 4a, b). Des traces de SWCNT-ANXA5 ont été détectées dans le cerveau, le gros intestin et l'intestin grêle. Il est important de noter que la biodistribution des SWCNT sur la base du % de dose injectée (ID) n'est pas bien corrélée avec la concentration absolue de SWCNT dans un tissu cible. Ceci est principalement dû aux différences entre les poids des organes. Par exemple, un % ID donné dans un organe correspondra à une concentration plus élevée dans les organes plus petits et à des concentrations plus faibles dans les organes plus grands. La comparaison des échantillons sur la base de la concentration de SWCNT révèle que la concentration la plus élevée se trouve dans le rein, suivi de près par le foie et la rate (Fig. 4a).

Il existe des preuves de dégradation des SWCNT dans les différents organes au cours de la période de l'étude de biodistribution (Fig. 4a, b). La dégradation des SWCNT dans les organes est attendue sur la base d'une découverte précédente selon laquelle les nanotubes de carbone multi-parois sont dégradés dans les macrophages [42]. Les SWCNTs utilisés dans notre étude ont un diamètre moyen de 0,8 nm et une longueur moyenne de 1500 µm. Cette taille n'est pas prédite comme étant cytotoxique d'après une étude de Zhu et al. [43], qui ont classé le potentiel d'endommagement de la bicouche lipidique par la toxicité des nanotubes de carbone en fonction de la longueur et du diamètre. Selon cette classification, les SWCNT que nous avons utilisés sont dans la catégorie « biologiquement doux », minimisant la cytotoxicité, ce qui est cohérent avec nos observations dans les études chez la souris où nous n'avons observé aucun effet secondaire ou toxicité histopathologique à la suite de l'administration du SWCNT -ANXA5 conjugué.

Conclusions

Ici, nous démontrons une nouvelle modalité de traitement combinatoire où nous obtenons un taux de survie relativement élevé chez les souris atteintes d'un cancer du sein métastatique agressif en utilisant une thérapie photothermique avec le bioconjugué SWCNT-ANXA5 combiné à une inhibition de point de contrôle basée sur l'anti-CTLA-4. L'utilisation de la protéine de ciblage vasculaire tumoral ANXA5 a minimisé la quantité de SWCNT administrée par voie systémique nécessaire pour éradiquer les tumeurs primaires à une faible dose unique. Fait intéressant, nous avons noté une augmentation de la survie des souris atteintes d'un cancer métastatique traitées par thérapie combinatoire, même si seule la tumeur primaire a été irradiée. Une étude mécanistique quantifiant le nombre de cellules effectrices antitumorales spléniques importantes a révélé que seule la combinaison des deux modalités de traitement augmentait le nombre de CD4 ⁺ assistant et CD8 ⁺ cellules T cytotoxiques. Nous émettons l'hypothèse que cette augmentation des cellules T reflète une réponse abscopale, où les cellules effectrices antitumorales ont supprimé les métastases tumorales. Although SWCNTs were still found to be present in organs 4 months after administration, no side effects or apparent tissue toxicity were observed during the course of experiments.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données sont entièrement disponibles sans restriction.

Abréviations

SWCNT:

Nanotube de carbone monoparoi

ANXA5:

Annexin A5

anti-CTLA-4:

Anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4

EDTA :

Ethylenediamine tetraacetic acid

SDS-PAGE:

Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis

DSPE:

1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine

PTT:

Photothermal therapy