Thérapie photothermique ciblée par nanotubes de carbone plus inhibition de point de contrôle : une nouvelle stratégie pour le cancer du sein métastatique

Résumé

Les plus grands contributeurs à la mortalité par cancer sont les métastases et les conséquences de leur traitement. Ici, nous présentons un nouveau traitement du cancer du sein métastatique qui combine la thérapie photothermique avec des nanotubes de carbone à paroi unique (SWCNTs) ciblés et l'immunostimulation avec un inhibiteur de point de contrôle. Nous trouvons que l'ablation photothermique sélective dans le proche infrarouge de tumeurs orthotopiques primaires EMT6 du sein chez des souris syngéniques BALB/cJ en utilisant un bioconjugué SWCNT fonctionnalisé par l'annexine A5 (ANXA5) améliore de manière synergique une réponse abscopale dépendante de l'anti-protéine 4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques (anti-CTLA-4), résultant en une survie accrue (55 %) à 100 jours après l'inoculation tumorale. En comparaison, il n'y avait aucune survie à 100 jours pour la thérapie photothermique seule ou l'immunostimulation seule. Avant la thérapie photothermique, le bioconjugué SWCNT-ANXA5 a été administré systémiquement à une dose relativement faible de 1,2 mg/kg, où il s'est ensuite accumulé dans la vasculature tumorale via une liaison dépendante de l'ANXA5. Pendant la thérapie photothermique, la température maximale moyenne dans la tumeur a atteint 54 °C (durée 175 s). Le mécanisme de survie prolongée résultant de l'ablation photothermique combinatoire et de la stimulation immunitaire a été évalué par quantification cytométrique en flux des cellules effectrices immunitaires antitumoral spléniques et quantification des cytokines sériques.

Introduction

Les métastases et les conséquences de leur traitement sont la cause unique la plus grande de décès dans le cancer [1]. Par exemple, lorsque le cancer du sein métastase, les taux de survie à 5 ans des patients chutent en dessous de 25 %. Même si au cours des 60 dernières années plus de 200 nouveaux médicaments antinéoplasiques ont amélioré les résultats des patients, la survie globale reste médiocre dans la maladie métastatique [2]. Ici, une nouvelle combinaison de thérapie photothermique facilitée par un bioconjugué de nanotube de carbone à paroi unique (SWCNT) ciblant la tumeur et l'inhibition du point de contrôle anti-protéine 4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques (anti-CTLA-4) est étudiée pour traiter le cancer du sein métastatique dans un modèle murin orthotopique.

Les propriétés uniques des SWCNTs en tant que nanomatériau ont généré un intérêt significatif pour leur utilisation comme outil potentiel dans la lutte contre le cancer. Bien que les SWCNTs exercent une variété d'effets biologiques, l'utilisation des SWCNTs dans le traitement du cancer s'est concentrée principalement sur leur interaction avec la lumière proche infrarouge (NIR) et l'effet photothermique résultant, où les SWCNTs chauffent rapidement la tumeur dans le processus appelé thérapie photothermique (PTT). De nombreux groupes ont étudié le potentiel des SWCNTs à être utilisés dans des stratégies de traitement basées sur PTT dans plusieurs modèles de cancer du sein [3,4,5,6,7,8,9,10]. Ces travaux se sont concentrés principalement sur la capacité de PTT à traiter les tumeurs primaires à des profondeurs ne dépassant pas quelques mm, où l'atténuation de la lumière NIR est presque complète.

Auparavant, nous avons montré que les tumeurs orthotopiques primaires du sein chez des souris syngéniques pouvaient être presque complètement éliminées en utilisant une lumière laser NIR douce en conjonction avec un bioconjugué SWCNT améliorant la photothermie [11]. Dans ce bioconjugué, les SWCNTs étaient fonctionnalisés avec la protéine annexine A5 (ANXA5), qui se lie avec une haute affinité au phospholipide anionique phosphatidylsérine exprimé à l'extérieur sur les cellules tumorales et sur les cellules endothéliales de la vasculature tumorale, mais pas sur les cellules normales dans la vasculature [12,13,14]. Ce conjugué a été visualisé en utilisant la microscopie à force atomique (AFM) pour montrer que la hauteur du conjugué était entre 2,5 et 5,0 nm, ce qui est similaire à celui pour d'autres conjugués SWCNT-protéine [11]. Bien que capable d'éradiquer les tumeurs primaires dans ce modèle métastatique précédent, la thérapie photothermique seule n'a que modestement prolongé la survie. Cependant, nous avons trouvé des preuves préliminaires suggérant que le traitement concomitant avec des immunomodulateurs tels que le cyclophosphamide était capable d'augmenter la survie.

Récemment, le potentiel des immunomodulateurs tels que le cyclophosphamide à améliorer de manière synergique la PTT dirigée par SWCNT a fait l'objet de beaucoup d'intérêt. Une catégorie d'agents immunomodulateurs prometteurs sont les inhibiteurs de point de contrôle. Les inhibiteurs de point de contrôle sont des anticorps tels que anti-CTLA-4, anti-PD-1 et anti-PDL-1 qui se lient à des protéines cellulaires critiques responsables de la modulation de la réponse du corps au cancer. Ces anticorps bloquent des « points de contrôle » biologiques clés où le corps peut réguler à la baisse la réponse du système immunitaire au cancer. Ces protéines servent normalement un rôle important dans le contrôle de la réponse immunologique du corps. En bloquant l'action de ces protéines, les inhibiteurs de point de contrôle éliminent un mécanisme par lequel le système immunitaire supprime normalement sa réponse antitumoral naturelle. Récemment, plusieurs groupes ont observé que la combinaison de l'inhibition du point de contrôle anti-CTLA-4 avec la PTT améliorée par SWCNT a le potentiel de promouvoir une réponse immune robuste dans le cancer du sein [15, 16].

Dans l'étude actuelle, nous évaluons la combinaison de notre nouvelle modalité PTT en conjonction avec l'agent immunostimulateur anti-protéine 4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques (anti-CTLA-4). À l'origine approuvé pour le traitement du mélanome métastatique [17], l'anti-CTLA-4 est maintenant testé pour traiter le cancer du sein dans des essais cliniques combinés avec d'autres agents immunostimulateurs [18]. Nous évaluons le mécanisme de l'immunité antinéoplasique améliorée dans la PTT en combinaison avec l'inhibition du point de contrôle anti-CTLA-4, ainsi que le sort à plus long terme des SWCNTs dans les organes cibles.

Matériaux et Méthodes

Matériaux

Le plasmide codant l'ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, a été précédemment construit dans ce laboratoire [11]. L'albumine sérique bovine (BSA), Triton X-100, EDTA, β-mercaptoéthanol, fluorure de phénylméthylsulfonyl (PMSF), et tampon Tris-acétate-EDTA étaient de Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Le phosphate de sodium et le dodécylsulfate de sodium (SDS) étaient de Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). L'éthanol de grade HPLC était d'Acros Organics (Waltham, MA). Les colonnes His-trap étaient de GE Healthcare (Chicago, IL). Le tampon de coloration cytométrie en flux, le tampon de fixation/perméabilisation, le tampon de perméabilisation, le kit de quantification chromogénique d'endotoxine, et les cassettes de dialyse Slide-A-Lyzer (3,5 kDa) étaient de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Les membranes de dialyse 2 et 100 kDa étaient de Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Le milieu cellulaire Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) et la solution saline équilibrée de Hank étaient de ATCC (Manassas, VA). Le sérum bovin fœtal (FBS) était d'Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). La tryptone, l'extrait de levure, et le monosulfate de kanamycine étaient d'Alfa Aesar (Ward Hill, MA). L'hydroxyde de sodium, le chlorure de potassium, et le chlorure de sodium étaient de VWR Inc (Radnor, PA). La protéase HRV-C3 était de Sino Biologics (Portland, OR). L'anticorps monoclonal anti-CTLA-4 de souris (clone : 9H10) et les kits ELISA de cytokines de souris (TNF-α, IFN-γ, IL-6) étaient de BioLegend (San Diego, CA). Les SWCNTs CoMoCAT (diamètre moyen 0,8 ± nm, longueur moyenne 1,5 ± 0,5 µm) étaient de CHASM (Boston, MA). La méthode CoMoCAT est connue pour produire des SWCNT d'un petit nombre de chiralités (n,m) avec une haute sélectivité [19]. L'échantillon utilisé dans cette étude est hautement enrichi en SWCNTs [5, 6], qui présente une forte absorption de lumière NIR à une longueur d'onde de 980 nm. Cette absorption correspond à la transition S₁₁ pour ce type de nanotube entre une singularité de van Hove occupée à la correspondante inoccupée. Par conséquent, pour maximiser l'absorption de rayonnement par les SWCNTs déposés sur les tumeurs, la longueur d'onde du laser utilisé dans cette étude était de 980 nm pour correspondre exactement à celle de la transition optique S₁₁ [20]. La Figure S1 dans le Fichier supplémentaire 1 montre les spectres de fluorescence, montrant clairement l'émission NIR S₁₁ après excitation de la transition S22 avec la lumière visible.

Culture Cellulaire

Les cellules de cancer du sein EMT6 de ATCC (Manassas, VA) ont été cultivées dans le milieu Waymouth's MB 752/1 avec 2 mM L-glutamine supplémenté avec 15 % FBS. Toutes les cellules ont été cultivées à 37 °C et 100 % d'humidité sous 5 % CO₂. Toutes les cellules ont été passagées en utilisant 0,25 % (p/v) trypsine dans 0,53 mM EDTA. La lignée cellulaire et le statut exempt de mycoplasme ont été confirmés via test STR (Charles River) et testés exempts d'endotoxine par essai limulus.

Production d'ANXA5 et SWCNT-ANXA5

Le conjugué SWCNT-ANXA5 a été préparé en utilisant une procédure que nous avons précédemment développée qui donne 2,5 mg ANXA5/mg SWCNT [11]. Brièvement, E. coli transfecté avec un plasmide codant l'ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, a été cultivé et purifié en utilisant la chromatographie d'affinité par métal immobilisé avec Ni²⁺ immobilisé pour isoler l'ANXA5, ce qui impliquait une clivage enzymatique pour retirer une étiquette (His)₆. Les SWCNTs CoMoCAT lyophilisés ont été dispersés dans 1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) en utilisant deux cycles de sonication par sonde à 20 W et centrifugation à 29 600 g pendant 30 min chacun. Les SWCNTs en suspension ont été caractérisés par fluorescence NIR (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1) et ensuite conjugués à un lien 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-polyéthylène glycol-maléimide (DSPE-PEG-maléimide) pendant 30 min à température ambiante pour permettre l'interaction hydrophobe entre les SWCNTs et le groupe fonctionnel DSPE. Cela a été suivi par une dialyse de 8 h dans l'eau distillée pour éliminer l'excès de lien et de SDS. Le conjugué dialysé a ensuite été réagi avec l'ANXA5, qui contient un groupe cystéine, pendant 2 h et bloqué avec 1,5 mg ml⁻¹ L-cystéine. Le produit final, SWCNT-ANXA5, a été dialysé contre un tampon phosphate de sodium 20 mM pendant 8 h pour éliminer l'excès d'ANXA5 et de L-cystéine. Le poids et la pureté des protéines ont été caractérisés via SDS-PAGE. Le contenu en SWCNT et ANXA5 du bioconjugué a été caractérisé par spectroscopie de fluorescence UV-Vis-NIR, analyse Raman par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR), et essai de Bradford (Fichier supplémentaire 1 : Figure S2).

Études In Vivo

Toutes les procédures étaient conformes à un protocole approuvé par le Comité Institutionnel de Soins et d'Utilisation des Animaux (IACUC) de l'Université de l'Oklahoma. Des souris femelles BALB/cJ de 6 semaines d'âge ont été utilisées (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Les souris étaient nourries avec un régime standard. Pendant l'irradiation photothermique des tumeurs avec une lumière laser NIR, les souris étaient anesthésiées avec 2 % d'isoflurane et 98 % d'oxygène en utilisant un cône nasal.

Les tumeurs étaient induites par injection orthotopique de 10⁶ cellules de cancer du sein murin EMT6 dans 100 µL de PBS dans le coussinet graisseux mammaire IV. Les tumeurs étaient laissées à croître pendant 12 jours, et lorsqu'elles atteignaient un volume de 60 mm³ (~ 5 mm de diamètre), les souris recevaient une injection systémique i.v. de 1,2 mg/kg de bioconjugué SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT par kg de poids corporel) via la veine caudale latérale. Après 3 h, une région de 5 mm en excès de la limite de la tumeur était irradiée avec la lumière NIR (980 nm) à une énergie et un niveau de puissance de 175 J/cm² et 1 W/cm², respectivement (temps de 175 s ; laser NIR Diodevet-50, B&W Tek Inc., Newark, DE). L'inhibition du point de contrôle était accomplie par administration sérielle i.p. de 200 µg d'anticorps anti-CTLA-4 dans 100 µl de PBS aux jours 8, 11 et 16 suivant l'inoculation tumorale. Le volume de la tumeur était calculé avec la formule ellipsoïde modifiée \(V = \frac{1}{2} \times {\text{longueur}} \times {\text{largeur}}^{2}\) en utilisant des mesures au pied à coulisse de la plus grande dimension et de la largeur perpendiculaire. La température de la tumeur était surveillée par une caméra thermique portable FLIR TG165 Spot (Raymarine ITC, Fareham, UK) réglée sur balayage automatique pour la température maximale détectée. Les organes cibles étaient prélevés pour l'évaluation de la toxicité et fixés dans du formol tamponné neutre à 10 %, et des lames fixées au formol et incluses dans la paraffine (FFPE) teintées étaient préparées et teintées avec l'hématoxyline et l'éosine pour l'analyse de toxicité.

Détection Ex Vivo des SWCNTs

Les souris recevaient une injection systémique de 1,2 mg/kg de SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT/kg poids corporel) via la veine caudale latérale. À des points de temps sélectionnés, les souris (n = 3) étaient euthanasiées, nécropsiées, et les organes cibles étaient retirés pour analyse. Les échantillons de tissu étaient préparés comme décrit précédemment [21]. La présence de SWCNTs dans les échantillons de tissu ex vivo était ensuite déterminée par spectroscopie de fluorescence NIR relative en utilisant un NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).

Cytométrie en Flux

Les souris étaient euthanasiées 14 jours post-traitement, et les cellules effectrices immunitaires antitumoral spléniques étaient quantifiées comme décrit précédemment [21].

Détection des Cytokines

Après le traitement comme décrit ci-dessus, les souris (n = 4-5) étaient euthanasiées 7 jours après la thérapie photothermique pour la collecte de sang. La concentration du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), de l'interféron gamma (IFN-γ), et de l'interleukine 6 (IL-6) dans des échantillons de sérum dilués était quantifiée par ELISA selon le protocole du fournisseur.

Analyse Statistique

Les données étaient analysées avec le logiciel Graphpad Prism. La significativité statistique était évaluée en utilisant une ANOVA à un facteur et le test de comparaisons multiples de Tukey-Kramer. La significativité statistique des courbes de survie était déterminée par le test log-rank de Mantel-Haenszel. La significativité statistique de la concentration sérique des cytokines était analysée par ANOVA à un facteur et le test de comparaisons multiples de Dunnett. Les comparaisons multiples étaient corrigées par le seuil de Bonferroni. L'erreur est représentée graphiquement comme l'erreur standard de la moyenne à moins que l'erreur ne dépasse la taille du symbole de point moyen tracé, auquel cas les barres étaient exclues pour la clarté.

Résultats

Cinétique Thermique

En utilisant une dose de 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5, la température maximale des tumeurs a été enregistrée au cours du traitement avec la lumière NIR, comme indiqué à la Fig. 1. Les souris qui ont reçu SWCNT-ANXA5 avant l'irradiation avaient des températures tumorales plus élevées pour l'ensemble du traitement de lumière NIR comparé aux souris qui ont reçu du sérum physiologique. La température moyenne de la tumeur pour les souris recevant SWCNT-ANXA5 était significativement différente de celle pour les souris recevant du sérum physiologique (54 °C vs. 37 °C, p < 0,05). En raison de cette thérapie photothermique améliorée, seulement dans le groupe SWCNT-ANXA5 l'ablation tumorale visible s'est produite. L'ablation tumorale était caractérisée par une décoloration rapide, suivie par une contraction de la peau et l'apparition de rides. Dans les 48 h, une eschar significative s'est formée au site de l'ablation photothermique. La régénération cutanée complète a pris plusieurs semaines.

Cinétique thermique résultant de l'irradiation des tumeurs avec la lumière NIR à 980 nm. Des souris BALB/cJ portant des tumeurs EMT6 ont été injectées par i.v. dans la veine caudale avec 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. Après avoir attendu 3 h pour permettre l'élimination des SWCNTs de la circulation, les tumeurs ont été irradiées avec un laser NIR à une densité d'énergie et de puissance de 175 J/cm² et 1 W/cm², respectivement (t = 175 s). La température maximale de la tumeur a été enregistrée en fonction du temps. La température des tumeurs des souris recevant SWCNT était significativement plus élevée que pour les souris recevant du sérum physiologique à t = 175 s (p < 0,05). Les données sont présentées comme moyenne ± SE (n = 3)

Thérapie Photothermique et Inhibition de Point de Contrôle

Les résultats de la combinaison de la thérapie photothermique avec l'inhibition de point de contrôle utilisant l'anticorps monoclonal anti-CTLA-4 sont montrés à la Fig. 2. Bien que la thérapie photothermique seule éradique facilement la néoplasie primaire du cancer du sein, l'incapacité de la lumière laser NIR à pénétrer au-delà de quelques mm limitait le traitement de la métastase du cancer du sein. Afin de surmonter les lacunes du traitement antinéoplasique photothermique NIR localisé, nous avons exploré la combinaison de cette modalité thérapeutique unique avec l'inhibition systémique de point de contrôle (Fig. 2). Alors que la thérapie photothermique excellait à détruire les tumeurs EMT6 primaires (Fig. 2a), ce traitement a échoué à éradiquer les métastases et n'a que modestement augmenté la survie des souris portant des tumeurs orthotopiques EMT6 (Fig. 2b). En revanche, l'inhibition du point de contrôle avec anti-CTLA-4 a amélioré la survie globale mais n'a que temporairement retardé la croissance de la tumeur primaire. Alors qu'aucune thérapie seule n'a produit d'augmentation de la survie globale, la combinaison de la thérapie photothermique améliorée par SWCNT-ANXA5 et de l'inhibition du point de contrôle anti-CTLA-4 a amélioré la survie globale, menant à 55 % de survie à 100 jours post-inoculation tumorale.

Résultats de la thérapie photothermique (PTT) combinatoire et de l'inhibition de point de contrôle (anti-CTLA-4) dans les tumeurs EMT6. Des souris avec des tumeurs syngéniques orthotopiques bien développées (d ≥ 5 mm) ont reçu une dose systémique i.v. de 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. a Les volumes de tumeurs ont ensuite été surveillés après irradiation (flèche) avec la lumière laser NIR pendant 175 s à une densité de puissance de 1 W/cm² au jour 12 suivant l'inoculation. En plus de PTT, certains groupes ont reçu anti-CTLA-4 (100 µg) aux jours 8, 11 et 16. Les souris du groupe témoin ont été injectées i.v. avec du sérum physiologique. Volume de tumeur montré comme moyenne ± SE (n = 7). Significativité comparée au témoin indiquée par * (p < 0,05). b La combinaison de thérapie photothermique et d'inhibition de point de contrôle immune a significativement augmenté la survie comparée aux témoins (p < 0,05, n = 7). c, d Seulement lorsque les souris ont reçu la thérapie photothermique en conjonction avec l'inhibition de point de contrôle anti-CTLA-4, des augmentations significatives des nombres relatifs de splénocytes CD4⁺ et CD8⁺ ont été observées 2 semaines après PTT. Splénocytes montrés comme moyenne ± SE (n = 3). Significativité indiquée par *** (p < 0,005)

L'analyse cytométrique des cellules effectrices spléniques après le traitement a révélé un mécanisme putatif de survie améliorée chez les souris recevant la thérapie photothermique combinatoire et l'inhibition de point de contrôle. Les souris étaient inoculées avec EMT6 et traitées comme décrit précédemment. Deux semaines après le traitement, les souris étaient sacrifiées et les pourcentages et nombres relatifs de plusieurs types d'effecteurs immunitaires étaient quantifiés. Les populations de cellules T auxiliaires, cellules T cytotoxiques, neutrophiles, monocytes cellules suppressives dérivées myéloïdes (MDSC), cellules T régulatrices FoxP3, et macrophages étaient évaluées (Fichier supplémentaire 1 : Figure S3). L'analyse de ces populations a révélé des différences significatives entre les populations de traitement et les témoins seulement chez les souris qui ont reçu la combinaison de la thérapie photothermique et de l'inhibition de point de contrôle anti-CTLA-4 ensemble. Chez ces animaux qui ont reçu cette combinaison, nous avons observé une augmentation des nombres relatifs de cellules T auxiliaires (CD4⁺) et de cellules T cytotoxiques (CD8⁺), (Fig. 2c, d). Les augmentations des comptes de cellules CD4⁺ et CD8⁺ étaient corrélées avec des augmentations brutes des tailles de rate observées après nécropsie.

En plus de l'analyse cytométrique des cellules effectrices spléniques, la concentration sérique de cytokines a été déterminée 7 jours après PTT pour aider à élucider les mécanismes de l'immunité antitumoral. Les niveaux des cytokines pro-inflammatoires IL-6, IFN-γ, et TNF-α sont présentés à la Fig. 3. Ni le traitement SWCNT ni le traitement anti-CTLA-4 seul n'ont significativement augmenté les niveaux de cytokines comparé au groupe témoin non traité. Cependant, le traitement PTT seul a pu augmenter significativement le TNF-α. L'ajout supplémentaire d'anti-CTLA-4 au traitement PTT a significativement augmenté les niveaux de TNF-α, IL-6 et IFN-γ.

Concentration sérique de cytokines. Quantification des niveaux de cytokines sériques dans le sérum de souris 7 jours après PTT a montré une augmentation significative des niveaux d'IL-6, IFN-γ et TNF-α chez les souris suivant PTT en conjonction avec l'inhibition de point de contrôle (anti-CTLA-4). Les résultats sont montrés pour le témoin non traité, traitement SWCNT seulement, traitement anti-CTLA-4 seulement, traitement PTT, et traitement PTT + anti-CTLA-4. Les données sont présentées comme moyenne ± SE (n = 4-5). La significativité statistique a été analysée pour les groupes traités comparés au groupe témoin non traité par ANOVA à un facteur avec le test de comparaisons multiples de Dunnett. La significativité statistique est indiquée par * (p < 0,05) et **** (p < 0,0001)

Biodistribution et Toxicité de SWCNT-ANXA5

La biodistribution de SWCNT-ANXA5 après administration pour l'amélioration de la thérapie photothermique dans divers organes a été surveillée avec la quantification fluorescente de SWCNT dans les lysats de tissu ex situ comparés aux standards (Fichier supplémentaire 1 : Figure S4). La biodistribution dans les organes cibles a été suivie sur une période de 4 mois suivant l'injection i.v. de 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 chez des souris saines (Fig. 4a, b). En revanche, l'accumulation de SWCNT-ANXA5 chez les souris porteuses de tumeurs EMT6 après administration, selon le protocole d'injection décrit précédemment, a été déterminée à 3 h après administration. (Le moment où la thérapie photothermique a été réalisée dans l'étude de traitement.) Pendant la période de 4 mois précédant le prélèvement d'organes, les souris étaient surveillées pour les effets secondaires physiques et les comportements anormaux. Aucun effet secondaire n'a été observé chez aucune souris injectée avec SWCNT-ANXA5 pendant cette période. Aucune toxicité histopathologique n'a été observée lors de l'examen de sections FFPE teintées à l'hématoxyline et à l'éosine des organes cibles à la conclusion de l'étude (Fichier supplémentaire 1 : Figure S5).

Biodistribution de SWCNT-ANXA5 mesurée en % de dose injectée (a) et concentration tissulaire en g/L (b). Le conjugué SWCNT-ANXA5 a été injecté i.v. dans des souris Balb/cJ à une dose de 1,2 mg/kg. La concentration de SWCNT a été mesurée dans divers organes de souris sans tumeurs après 1, 2, 3 et 4 mois (de gauche à droite). Pour les souris avec tumeurs, la concentration de SWCNTs a été mesurée au moment où elle serait immédiatement avant le traitement de thérapie photothermique. Les données sont montrées comme moyenne ± SE (n = 3)

Discussion

Les données présentées ici fournissent un soutien à l'efficacité de la combinaison de la thérapie photothermique ciblée et de l'inhibition de point de contrôle immune pour le traitement du cancer du sein métastatique. Ce phénomène est connu sous le nom d'« effet abscopal », qui décrit la capacité d'une irradiation localisée à initier une réponse antitumoral qui supprime la croissance tumorale distante de la cible primaire. Dès les années 1950, les chercheurs ont observé que l'irradiation tumorale localisée avait un effet significatif sur les tumeurs distantes [22]. Des études ont établi que la nature systémique de l'effet abscopal est due à la réponse immunitaire de l'hôte [23,24,25]. Bien que l'irradiation γ ait été le principal objectif de la plupart des recherches abscopales, un corps croissant de travaux démontre que la thérapie photothermique peut également induire un effet abscopal. De nombreuses études ont démontré que l'ablation thermique en combinaison avec l'inhibiteur de point de contrôle anti-CTLA-4 produit une réponse immune accrue [16, 26,27,28,29]. Nous observons une réponse abscopale similaire suivant l'ablation photothermique ciblée et le blocage anti-CTLA-4 dans le modèle EMT6 de cancer du sein.

L'effet abscopal est illustré par les données dans Fig. 2a, b. Les tumeurs EMT6 orthotopiques croissent rapidement et ont métastasé au moment où elles sont traitées par thérapie photothermique. C'est la raison pour laquelle les souris avec tumeurs traitées seulement avec la thérapie photothermique n'avaient qu'une légère augmentation de la survie comparée aux souris témoins non traitées, même si la tumeur primaire avait été complètement ablatée. L'administration d'anti-CTLA-4 seul a retardé la croissance tumorale comparée au témoin et a augmenté le temps de survie à 68 jours mais n'a pas mené à la guérison. Un résultat similaire de croissance retardée de tumeur EMT6 a été observé par Jure-Kunkel et al. lorsque l'anti-CTLA-4 était administré [30]. Pour la combinaison de thérapie photothermique et anti-CTLA-4, 55 % des souris traitées ont survécu à 100 jours après l'inoculation tumorale et sont probablement guéries.

Un aperçu du mécanisme de l'immunité antitumorale a été évalué en utilisant la cytométrie en flux pour quantifier les populations de cellules effectrices immunitaires dans la rate. Comparé à la thérapie photothermique ou à l'anti-CTLA-4 seul, la thérapie combinatoire a entraîné une augmentation de sept fois des cellules T auxiliaires CD4⁺ et une augmentation de trois fois des cellules T cytolytiques CD8⁺, ces deux résultats étant hautement statistiquement significatifs (p < 0,005). Ces résultats fournissent des preuves supplémentaires d'une réponse abscopale potentielle par la combinaison de la photothérapie et de la thérapie de co-stimulation des cellules T avec l'inhibition de point de contrôle immune.

Les augmentations des comptes de cellules CD4⁺ et CD8⁺ étaient corrélées avec les augmentations des tailles de rate observées pendant la nécropsie. La rate est composée de plusieurs types de cellules, les plus communes étant des lignées CD4⁺, CD8⁺, et cellules B [31, 32]. Bien que non exploré dans ce corps de travail, nous nous attendrions à ce que les comptes de cellules B augmentent avec les comptes de cellules T CD4⁺ et CD8⁺ [33]. Les cellules T auxiliaires CD4⁺ aident à l'immunité humorale en facilitant d'autres cellules immunitaires par stimulation cytokique et interactions cellulaires directes. Les cellules T cytolytiques CD8⁺ tuent directement les cellules tumorales. Les augmentations des comptes de cellules CD4⁺ et CD8⁺ sont indicatives d'une réponse immune abscopale systémique.

La présence d'une réponse immune abscopale systémique après le traitement combinatoire est davantage soutenue par les augmentations des niveaux de cytokines pro-inflammatoires du sérum de souris (Fig. 3). Le TNF-α active les macrophages associés aux tumeurs pour présenter des effets antitumoral [34, 35]. L'IFN-γ joue un rôle important dans la surveillance tumorale [36, 37]. L'IL-6 favorise la prolifération des macrophages et des lymphocytes [38]. L'augmentation significative de ces molécules effectrices dans le sérum de souris 7 jours après le traitement PTT combiné avec anti-CTLA-4 soutient davantage l'existence d'une réponse immune antitumoral.

À la conclusion de l'irradiation des souris qui ont reçu SWCNT, la température maximale moyenne de la tumeur était de 54 °C ; cette température était suffisante pour ablater complètement la tumeur (Fig. 1). Cela se situe dans la gamme de 45-60 °C dans laquelle l'inactivation enzymatique et la lésion mitochondriale se produisent [39]. La température des tumeurs dans le groupe témoin sérum physiologique est restée en dessous de 40 °C, une température qui fournit un bénéfice thérapeutique minimal [39,40,41].

Nous avons observé que la majorité de l'accumulation de SWCNT-ANXA5 basée sur la concentration était principalement dans le foie, le cœur, la rate, les reins, les poumons, et la tumeur (Fig. 4a). Chez les souris avec tumeurs EMT6, nous avons observé que la concentration de SWCNT-ANXA5 était similaire à celle dans le foie et les reins (Fig. 4a, b). Des quantités traces de SWCNT-ANXA5 ont été détectées dans le cerveau, les gros intestins, et les petits intestins. Il est important de noter que la biodistribution de SWCNT sur la base de % de dose injectée (ID) ne se corrèle pas bien avec la concentration absolue de SWCNT dans un tissu cible. Cela est principalement dû aux différences entre les poids des organes. Par exemple, un % ID donné dans un organe correspondra à une concentration plus élevée dans les organes plus petits, et des concentrations plus faibles dans les organes plus grands. En comparant les échantillons sur la base de la concentration de SWCNT, on révèle que la concentration la plus élevée est dans le rein, suivie de près par le foie et la rate (Fig. 4a).

Il y a des preuves de dégradation des SWCNTs dans les divers organes sur la période de l'étude de biodistribution (Fig. 4a, b). La dégradation des SWCNTs dans les organes est attendue basée sur une découverte précédente que les nanotubes de carbone multi-parois sont dégradés dans les macrophages [42]. Les SWCNTs utilisés dans notre étude ont un diamètre moyen de 0,8 nm et une longueur moyenne de 1500 µm. Cette taille n'est pas prédite pour être cytotoxique basée sur une étude de Zhu et al. [43], qui a classé le potentiel de dommage de bicouche lipidique par la toxicité des nanotubes de carbone basée sur la longueur et le diamètre. Selon cette classification, les SWCNTs que nous avons utilisés sont dans la catégorie « biologiquement mous », minimisant la cytotoxicité, ce qui est cohérent avec nos observations dans les études chez les souris où nous n'avons observé aucun effet secondaire ou toxicité histopathologique en raison de l'administration du conjugué SWCNT-ANXA5.

Conclusions

Ici, nous démontrons une nouvelle modalité de traitement combinatoire où nous obtenons un taux de survie relativement élevé chez des souris avec un cancer du sein métastatique agressif en utilisant la thérapie photothermique avec le bioconjugué SWCNT-ANXA5 combinée avec l'inhibition de point de contrôle basée sur anti-CTLA-4. L'utilisation de la protéine de ciblage vasculaire tumoral ANXA5 a minimisé la quantité de SWCNT livrée systémiquement nécessaire pour éradiquer les tumeurs primaires en une seule dose faible. Intéressant, nous avons noté une augmentation de la survie des souris avec cancer métastatique traitées avec la thérapie combinatoire, même si seule la tumeur primaire était irradiée. Une étude mécanistique quantifiant les nombres de cellules effectrices antitumoral spléniques importantes a révélé que seule la combinaison des deux modalités de traitement augmentait le nombre de cellules T auxiliaires CD4⁺ et cytotoxiques CD8⁺. Nous hypothétisons que cette augmentation des cellules T reflète une réponse abscopale, où les cellules effectrices antitumoral suppriment la métastase tumorale. Bien que les SWCNTs aient encore été trouvés présents dans les organes 4 mois après l'administration, aucun effet secondaire ou toxicité tissulaire apparente n'a été observé pendant le cours des expériences.

Disponibilité des Données et Matériaux

Toutes les données sont pleinement disponibles sans restriction.

Abréviations

SWCNT :

Nanotube de carbone à paroi unique

ANXA5 :

Annexine A5

anti-CTLA-4 :

Anti-protéine 4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques

EDTA :

Acide éthylènediaminetétraacétique

SDS-PAGE :

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium

DSPE :

1,2-Distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine

PTT :

Thérapie photothermique