Fe(II) et MOF recouvert d'acide tannique comme vecteur d'artémisinine pour la fourniture d'ions ferreux afin d'améliorer le traitement du cancer du sein triple négatif

Introduction

La ferroptose, un sous-type de mort cellulaire récemment découvert, pourrait entraîner une accumulation d'hydroperoxydes lipidiques dépendants du fer (LPO), entraînant des dommages à la structure et à l'intégrité cellulaires [1,2,3]. Des preuves émergentes impliquaient que l'activation de la ferroptose par plusieurs petites molécules est une approche efficace pour la suppression tumorale dans divers modèles de cancer expérimentaux et ont créé de grandes attentes quant au potentiel de la ferroptose en tant que nouvelle thérapie anticancéreuse [4,5,6]. Le cancer du sein triple négatif (TNBC) est le sous-type le plus agressif des thérapies ciblées pour le cancer du sein et est souvent associé à une récidive tumorale, des métastases à distance et une résistance au traitement [7]. Des études antérieures ont souligné que l'antiporteur cystine/glutamate xCT est fortement exprimé dans de nombreuses cellules TNBC, jouant un rôle important dans le maintien des niveaux de glutathion (GSH) et de l'équilibre redox [8]. La réduction de la teneur en GSH intracellulaire peut rendre les cellules TNBC sensibles à la ferroptose, tuant ainsi les cellules tumorales [8]. Notamment, la ferroptose peut également contourner la résistance des TNBC à l'apoptose programmée de routine [9]. Par conséquent, les stratégies ou les médicaments basés sur l'induction de la ferroptose peuvent avoir un potentiel thérapeutique pour le traitement clinique du TNBC réfractaire.

L'artémisinine (ART), une lactone sesquiterpénique qui contient un groupe peroxyde, a été isolée de la plante traditionnelle chinoise Artemisia annua et a démontré une activité antitumorale souhaitable dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses [10, 11]. De plus en plus de preuves ont montré que les cellules cancéreuses contiennent significativement plus de pool de fer intracellulaire que les cellules normales, tandis que le clivage médié par le fer du pont endoperoxyde permet à l'ART de provoquer sélectivement la mort cellulaire dans plusieurs lignées cellulaires cancéreuses [12, 13]. L'activité antitumorale dépendante des ions fer a attiré une attention croissante sur la ferroptose régulée par l'ART [13]. D'un point de vue mécanique, l'ART peut induire une dégradation lysosomale de la ferritine d'une manière indépendante de l'autophagie, augmentant les niveaux cellulaires d'ions ferreux et sensibilisant les cellules à la ferroptose [11].

Cependant, si l'ART induit la ferroptose dans TNBC reste incertain. De plus, une série de facteurs, tels qu'une faible solubilité dans l'eau et une disponibilité insuffisante des ions ferreux intracellulaires, limitent l'application ultérieure de l'ART dans le traitement antitumoral [13]. On s'attend à ce que les nano-complexes d'ART soient utilisés avec succès comme système d'administration de nano-médicaments pour les médicaments antitumoraux à base d'ART [14,15,16]. Ces dernières années, les structures métal-organiques (MOF), une classe de matériaux polymères poreux, ont attiré l'attention en raison des démonstrations de leurs grandes tailles de pores, de leurs surfaces apparentes élevées et de leur absorption sélective de petites molécules [17,18,19]. En tant que représentant des matériaux de type MOF, le cadre imidazolate zéolitique (ZIF-8) est largement utilisé dans le développement de nano-médicaments avec des caractéristiques de réponse au pH, une charge médicamenteuse élevée et une bonne biocompatibilité [20,21,22,23 ]. De plus, la possibilité d'incorporer une surface ajustable sur MOF permet le contrôle des propriétés de la surface et sa dotation en multifonctionnalités [24, 25]. L'assemblage supramoléculaire d'une couche de coordination métal-phénolique sur la surface du MOF a récemment suscité l'intérêt en raison des propriétés souhaitables, telles que le désassemblage sensible aux stimuli, la stabilité colloïdale et la biocompatibilité [26, 27]. Les matériaux de coordination métal-phénoliques sur le MOF pourraient être un véhicule idéal pour délivrer l'ART hydrophobe.

Inspirés par cela, nous avons développé un nano-système ZIF-8 masqué par coordination ion ferreux-acide tannique encapsulant l'ART (TA-Fe/ART@ZIF) pour réguler la ferroptose dans les cellules TNBC, comme le montre la figure 1. sélectionné comme nano-support pour encapsuler l'ART en raison de sa bonne bio-compatibilité et de sa libération sensible au pH. La couche de coordination ions ferreux-TA a été immobilisée sur la surface de ART@ZIF dans le but de stabiliser la dispersion et de fournir des ions ferreux (Fe(II)). Suite à l'internalisation du nano-système tel que préparé dans les cellules, la dégradation acide des véhicules faciliterait la libération d'ART et l'accumulation de Fe(II). La régulation à la hausse des niveaux de Fe(II) dans les cellules décomposerait l'ART en radicaux par clivage du pont endoperoxyde médié par le fer, renforçant ainsi de manière marquée les effets de la ferroptose. En conclusion, la découverte de la ferroptose médiée par TA-Fe/ART@ZIF peut offrir de nouvelles perspectives pour le développement de nouveaux traitements contre le TNBC.

Représentation schématique de la préparation des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF et de l'induction synergique de l'apoptose/ferroptose dans les cellules tumorales

Matériel et méthodes

Réactifs

Artémisinine (99%), 2-méthylimidazole (98%), nitrate de zinc (ZnNO₃; 98%), Ta (98%), sulfate ferreux (FeSO₄; 98 %), et le méthanol anhydre ont été fournis par Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Chine).

Fabrication de nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF

Pour la préparation des nanoparticules ART@ZIF, 200 mg d'ART ont été dissous dans 1 ml de méthanol anhydre et 2 g de 2-méthylimidazole (le solvant était 8 ml de méthanol absolu) ont été ajoutés lentement à la solution d'ART obtenue. Sous agitation magnétique, 0,2 g de nitrate de zinc (le solvant était 1 ml de méthanol absolu) a été ajouté lentement. Enfin, le volume de la solution a été ajusté à 15 mL et agité pendant 10 min pour obtenir une solution blanc clair. Après centrifugation à 10 000 tr/min, l'échantillon a été lavé trois fois avec du méthanol. Le surnageant devait mesurer la teneur en ART, tandis que le précipitant était lyophilisé pour obtenir l'état solide pour une utilisation ultérieure.

Pour la préparation des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF, une solution de TA (40 mg/mL dans de l'eau déminéralisée, 2 mL) a été ajoutée lentement à la solution ART@ZIF (10 mg/mL, 4 mL). Après agitation pendant 20 min, 5 mg/mL de FeSO₄ a été ajouté lentement à la solution ci-dessus. Après agitation répétée pendant 30 min, une solution violet foncé a été obtenue. Enfin, le précipité a été recueilli par centrifugation à 10 000 tr/min. Le précipité a été lavé trois fois avec de l'eau déminéralisée et lyophilisé pour obtenir le TA-Fe/ART@ZIF pour une utilisation ultérieure.

Caractérisation

La MET (JEM-1230; JEOL, Tokyo, Japon) a été utilisée pour déterminer la composition morphologique et élémentaire de chaque partie de la nanoparticule. La diffusion dynamique de la lumière et le potentiel zêta (DLS; Zetasizer Nano system Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni) ont été utilisés pour évaluer la taille des particules et la stabilité électrique des nanoparticules. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (VERTEX 70; Bruker, Brême, Allemagne) et l'analyse thermogravimétrique ont été utilisées pour analyser la composition des constituants des nanoparticules. Des mesures par spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) ont été prises en utilisant une sonde PHI 5000 Versa Probe III (Physical Electronics). La composition élémentaire du matériau TA-Fe/ART@ZIF a été réalisée en utilisant EDX (Carl Zeiss Model :Neon-40).

Mesure de l'efficacité d'encapsulation et de la capacité de chargement

Chromatographie liquide haute performance (HPLC) (Agilent 1200 ; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) a été utilisé pour mesurer la quantité d'ART dans le surnageant. Les taux de charge médicamenteuse et d'encapsulation du TAR peuvent être calculés comme suit :

Libération in vitro et réponse au pH des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF

La membrane de dialyse traitée enveloppée de 2 mg de nanoparticules a été placée dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec un pH de 7,4 et 5,0, respectivement, et secouée en continu à 37 °C. La solution à l'extérieur de la membrane de dialyse a été échantillonnée à 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h et 10 h après le début de l'expérience. Le contenu de l'ART dans la solution tampon a été mesuré par HPLC.

Culture cellulaire

Les lignées cellulaires MDA‐MB‐231 et L929 ont été acquises auprès de l'American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). Les cellules ont été cultivées à 37 °C et 5 % de CO₂ d'humidité dans le milieu RPMI-1640 (Solarbio, Pékin, Chine), qui a été complété par 10 % de sérum de veau fœtal (Cyclone, Utah, États-Unis), 100 µg/mL de pyruvate de sodium, de pénicilline et de streptomycine (Solarbio Pékin, Chine).

Test de toxicité cellulaire in vitro

La viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) conformément aux procédures de la littérature [28, 29].

Les cellules MDA-MB-231 et les cellules L929 ont été cultivées dans des milieux cellulaires standard dans des plaques à 96 puits (5 000 cellules par puits) et incubées dans 5% de CO₂ à 37 °C pendant 24 h. Le fluide dans le puits a été jeté, et 100 μL par puits de milieu sans sérum avec du PBS et différentes concentrations d'ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, déféroxamine (DFO, MedChemExpress, Shanghai, Chine ), la N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluorométhyl cétone (Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Shanghai, Chine) et la ferrostatine-1 (Fer1, MedChemExpress, Shanghai, Chine) ont été ajoutées aux 96 -puits plaques. Après 48 h, 10 μL de MTT (5 mg/mL) ont été ajoutés et incubés pendant 4 h supplémentaires. Enfin, un marqueur enzymatique automatique (BioTek Instruments Inc., USA) a été utilisé pour mesurer l'absorbance dans chaque puits. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de viabilité cellulaire.

Dosage de coloration Calcéine-Acétoxyméthyle (Calcéine-AM)

Les cellules MDA-MB-231 ont été cultivées dans des plaques 24 puits (2 × 10 ⁴ cellules par puits) et incubé pendant 24 h. Par la suite, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF pendant 24 h. Après avoir jeté le milieu, les cellules ont été colorées avec de la Calcein-AM (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine) dans l'obscurité à 4 °C pendant 20 min et observées au microscope à fluorescence inversée (Olympus, Tokyo, Japon).

Cytométrie en flux pour l'apoptose

Les cellules MDA-MB-231 ont été placées dans une plaque à six puits à une densité de 2,5 × 10 ⁵ cellules par puits dans les mêmes conditions. Après traitement avec du PBS, ART, TA-Fe/ZIF et TA-Fe/ART@ZIF ont été appliqués pendant 24 h. Par la suite, les cellules ont été centrifugées et collectées à partir de la plaque à six puits. Après double coloration à l'iodure de propidium et à l'Annexine-V (Kit Annexin V‐FITC ; Beckman Coulter, Marseille, France), la cytométrie en flux a été utilisée pour détecter.

Dosage de détermination in vitro des espèces réactives de l'oxygène (ROS)

La teneur en ROS dans les cellules a été réalisée à l'aide d'une sonde de fluorescence ROS (dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Les cellules MDA-MB-231 ont été cultivées dans des plaques à six puits (2.5 × 10 ⁵ cellules par puits) et incubées dans 5% de CO₂ à 37 °C pendant 24 h. Le fluide des puits a été jeté et les cellules ont été traitées comme suit :groupe témoin blanc (milieu sans sérum), groupe témoin positif et groupe expérimental (différentes concentrations de nanoparticules). Après incubation pendant 8 h à 37 °C, 0,1 % de DCFH-DA a été ajouté à chaque puits et les cellules ont été incubées pendant 30 min. Les cellules ne répondant pas au DCFH-DA ont été retirées avec du PBS et observées au microscope inversé à fluorescence (Olympus, Tokyo, Japon).

Détermination de la teneur en malondialdéhyde (MDA) et en GSH

Le kit de dosage MDA (méthode TBA; Jiancheng Bioengineering, Nanjing, Chine) et le kit de dosage GSH (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine) ont été utilisés pour mesurer les niveaux intracellulaires de MDA et de GSH. Après traitement avec PBS, ART, TA-Fe/ZIF et TA-Fe/ART@ZIF, les cellules MDA-MB-231 ont été collectées et comptées. Le contenu intracellulaire de MDA et de GSH a été déterminé selon les instructions fournies dans les kits.

Analyse Western Blot

Les cellules MDA-MB-231, qui ont été traitées avec différentes nanoparticules, ont été lysées avec du tampon de lyse RIPA. Une fois la concentration en protéines déterminée, les protéines des différents échantillons ont été séparées en utilisant un gel SDS-PAGE à 10 % et transférées sur une membrane de nitrocellulose. La membrane de nitrocellulose chargée des échantillons de protéines a été bloquée par une solution de protéine BSA à 0,5 % pendant 1 h, et la membrane de nitrocellulose et les anticorps primaires ont été incubés pendant 24 h à 4 °C. Nous avons rincé les anticorps primaires de la membrane de nitrocellulose avec du TBST et continué à la placer avec les anticorps secondaires correspondants à température ordinaire pendant 2 h. Après avoir lavé les anticorps secondaires sur la membrane en cellulose, la membrane de nitrocellulose a été utilisée avec une solution chimiluminescente et observée sous le système d'imagerie sur gel.

Expérience antitumorale in Vivo

Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité d'éthique de l'université médicale de Weifang. Des souris nude femelles en bonne santé (âge :4 semaines ; poids :13-17 g ; Vital River, Pékin, Chine) ont été administrées avec 5 × 10 ⁶ Cellules MDA-MB-231 dans 150 µl de solution saline tamponnée au phosphate. Lorsque le volume de la tumeur a augmenté jusqu'à 70-120 mm ³ , les souris ont été réparties au hasard en quatre groupes. Chaque groupe de souris a été traité séparément avec du PBS, de l'ART (20 mg/kg), du TA-Fe/ZIF (80 mg/kg) et du TA-Fe/ART@ZIF (100 mg/kg). Chaque souris a été traitée par injection intrapéritonéale tous les trois jours. Après 14 jours, toutes les souris ont été tuées. Les tissus tumoraux et les organes importants ont été collectés pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine.

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été répétées au moins trois fois. Toutes les données ont été analysées statistiquement à l'aide du logiciel SPSS version 22.0 (IBM Corp., Armonk, USA). Les résultats ont été exprimés sous forme de moyenne  ±  écart type. P valeurs < 0,05 dénotaient une signification statistique.

Résultats et discussion

Caractérisations des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF

Premièrement, les nanoparticules ART@ZIF ont été synthétisées à température ambiante à partir de méthanol, d'acétate de zinc, de 2-méthylimidazole et d'ART selon les procédures de la littérature [30]. Des films supramoléculaires stables de métal-polyphénol ont ensuite été rapidement formés autour des modèles ART@ZIF par vortex de TA et d'ions ferreux. Par rapport aux nanoparticules magnétiques rapportées [31,32,33], le TA-Fe/ART@ZIF a été préparé via la méthode d'auto-assemblage formatant la membrane TA-Fe à la surface du MOF sans impliquer de réaction chimique ou hydrothermale sévère. Plus important encore, le nano-support TA-Fe/ART@ZIF peut être déclenché par un pH bas, pour libérer de l'ART et du Fe(II), qui est en outre catalysé par l'endoperoxyde de l'ART pour générer des radicaux libres centrés sur le C, une ferroptose nettement améliorée . L'efficacité d'encapsulation, qui a été mesurée par HPLC à partir du surnageant de la première centrifugation, était de 66,7 %. Le surnageant a été obtenu par les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF, et la charge médicamenteuse calculée de l'ART était de 11,4 %. D'après la spectroscopie FTIR (Fig. 2a), pics d'absorption caractéristiques de l'ART, à savoir la liaison carbonyle à 1 738 cm ⁻¹ et le pont peroxy à 724 cm ⁻¹ [34], ont été observés dans les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF, indiquant que l'ART a été encapsulé avec succès dans les nanoparticules. Ensuite, les résultats de l'analyse thermogravimétrique ont révélé que l'ART s'abolissait complètement lorsque la température était augmentée à environ 400 °C (Fig. 2b). Par rapport aux nanoparticules TA-Fe/ZIF, il a été constaté que l'ART représente 7,1 % du poids total des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF, ce qui est fondamentalement cohérent avec les résultats de l'analyse HPLC.

un FTIR de ART, ZIF-8 et TA-Fe/ART@ZIF ; b Analyse thermogravimétrique (TGA) de ART, TA-Fe/ZIF et TA-Fe/ART@ZIF

Les résultats de la MET ont montré que ZIF-8 et ART@ZIF présentaient une configuration hexagonale uniforme similaire, et la distribution de la taille des particules a été déterminée à environ 100 nm (Fig. 3a, b). Les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF présentaient une configuration sphérique et la distribution de la taille des particules était de 150 nm. Par rapport à l'ART@ZIF complet, TA-Fe/ART@ZIF recouvert de Fe(II) et de TA a démontré une structure noyau-enveloppe conventionnelle évidente, et la taille de la membrane TA-Fe était d'environ 30 nm (Fig. 3a). De plus, nous avons effectué une analyse de cartographie aire-élémentaire des nanoparticules formées. La cartographie aire-élémentaire a confirmé que la périphérie des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF était encerclée par l'élément Fe, indiquant que Fe(II) et TA ont été masqués avec succès (Fig. 3b). Des mesures XPS ont été prises pour étudier la composition élémentaire de la surface et l'interaction dans le composite TA-Fe/ART@ZIF. Le spectre XPS à balayage large de TA-Fe/ART@ZIF est décrit dans le fichier supplémentaire 1 : Fig. 1s. Les principaux pics apparaissant à environ 285, 408, 531, 737 et 1036 eV étaient liés respectivement à C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p et Zn 2p, démontrant la formation de nanocomposite TA-Fe/ART@ZIF . De plus, les images de cartographie EDS du TA-Fe/ART@ZIF sont présentées dans le fichier supplémentaire 1 : Fig. 2s. On constate clairement que les pics correspondant à des éléments tels que le carbone (C), l'azote (N), l'oxygène (O), le fer (Fe) et le zinc (Zn), sont en bon accord avec le spectre XPS. En augmentant la quantité de Fe(II), nous avons constaté que le diamètre hydrodynamique des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF était augmenté (Fichier supplémentaire 1 : Fig. 3s). Pour confirmer davantage le revêtement, nous avons mesuré le potentiel zêta de diverses nanoparticules. La couche de formation TA–Fe(II) sur les particules ART@ZIF a déplacé le potentiel zêta de surface de  + 21 mV à − 19,5 mV en raison de la nature acide de TA (Fichier supplémentaire 1 : Fig. 4s). Comme la littérature précédente l'a rapporté [30], les groupes polyphénols abondants dans la structure TA confèrent non seulement la capacité de revêtement du substrat, mais sont également capables de se coordonner avec les ions de métaux de transition (Fe, Zn) pour former un complexe métal-phénolique. Lorsque Zn ²⁺ et Hmim sont mélangés pour former une solution, une masse de Zn ²⁺ les ions se coordonneraient à la surface des particules ART@ZIF ; ainsi, le potentiel zêta de ART@ZIF est  + 21 mV. Les groupements phénoliques de TA (pKa 8,5) étaient déprotonés négativement et pouvaient donc interagir avec le Zn ²⁺ chargé positivement , favorisant la croissance du film TA-Fe sur la surface ART@ZIF. Comme l'administration de médicaments favorise les porteurs, la stabilité est un facteur important pour leur application médicinale. La stabilité des nanoparticules a été démontrée par dispersion dans du PBS pendant une semaine. Comme indiqué dans Fichier supplémentaire 1 : Fig. 5s, la taille des particules présentait la taille et la stabilité souhaitables au cours du temps d'étude.

un Images MET et distribution de taille des nanoparticules ZIF-8, ART@ZIF et TA-Fe/ART@ZIF. Barre d'échelle :100 nm ; b distribution de l'élément carbone et fer dans les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF. Barre d'échelle :100 nm

un Libération in vitro d'ART à partir de nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF à pH 7,4 et 5,0. b La cytotoxicité des nanoparticules ART, TA-Fe/ZIF et TA-Fe/ART@ZIF dans les cellules MDA-MB-231 à 0, 12,5, 25, 50 et 100 μg/mL. c Viabilité des cellules L929 traitées avec TA-Fe/ART@ZIF à différentes concentrations. d Coloration à la calcéine-AM de cellules MDA-MB-231 traitées avec des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF à des concentrations de 0, 25, 50 et 100 μg/mL

Production de ROS détectée par fluorescence de DCFH-DA dans des cellules MDA-MB-231 traitées avec des nanoparticules ART, TA-Fe/ZIF et TA-Fe/ART@ZIF

Libération et cytotoxicité de TA-Fe/ART@ZIF in vitro

Ensuite, afin d'étudier si TA-Fe/ART@ZIF avait un comportement de décomposition sensible au pH, nous avons examiné la libération d'ART à partir de nanoparticules dans des conditions neutres et acides. Comme le montre la figure 4a, dans des conditions acides, les nanoparticules peuvent libérer rapidement environ 58 % de l'ART en 1 h. Cependant, dans des conditions neutres, les nanoparticules ne peuvent libérer que lentement une infime quantité d'ART. De plus, pendant le traitement de la solution externe de la membrane de dialyse avec de l'hydroxyde de sodium, la solution du groupe pH =5,0 a été mise à réagir avec de l'hydroxyde de sodium pour produire un précipité blanc considérable. Cependant, ce phénomène n'a pas été observé dans le groupe pH = 7,4.

Selon notre hypothèse, le précipité blanc est un précipité d'hydroxyde de zinc formé par la dissociation des ions zinc et alcali des nanoparticules dans des conditions acides. Collectivement, ces preuves montrent avec succès que nos nanoparticules ont la capacité de se dissocier dans des conditions acides.

Dans la conception du nano-système TA-Fe/ART@ZIF, les structures TA-Fe(II) et ZIF sont enlevées pour libérer l'ART et le Fe(II) enrobés dans les conditions acides du microenvironnement tumoral. La régulation à la hausse des niveaux de Fe(II) dans les cellules décomposerait l'ART en radicaux par clivage du pont endoperoxyde médié par le fer, renforçant ainsi de manière marquée les effets de la ferroptose. En conséquence, des tests MTT ont été menés pour étudier la cytotoxicité du nano-système vis-à-vis des cellules MDA-MB-231 et des cellules L929. Par rapport à l'ART, les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF ont montré une plus grande cytotoxicité pour les cellules MDA-MB-231 (Fig. 4b) et une faible cytotoxicité pour les cellules normales (Fig. 4c). Les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF ont inhibé l'activité des cellules MDA-MB-231 de 53,9%, tandis que l'ART à la même concentration n'a inhibé que 24,1% des cellules entières. Les résultats expérimentaux de la coloration calcéine-AM ont confirmé que la quantité de cellules MDA-MB-231 viables diminuait progressivement avec l'augmentation de la concentration de nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF (Fig. 4d).

Génération ROS améliorée TA-Fe/ART@ZIF dans les cellules MDA-MB-231

L'ART est connu pour exercer son activité anticancéreuse via la génération de ROS produites par le clivage médié par le fer du pont endoperoxyde [35, 36]. Par conséquent, nous avons examiné l'efficacité de TA-Fe/ART@ZIF pour induire la génération de ROS par la sonde 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine diacétate (DCHF-DA) [37]. Comme le montre la figure 5, le signal de fluorescence légèrement plus fort a été observé dans les cellules traitées avec ART et TA-Fe/ZIF par rapport aux groupes non traités, indiquant que les ions ART et Fe(II) pourraient induire la génération de ROS. En revanche, une forte exposition à un signal de fluorescence au nano-médicament TA-Fe/ART@ZIF se trouve dans les cellules comme preuve du rendement souhaité en ROS, qui est généré par le clivage de l'endoperoxyde médié par Fe(II) de l'ART. Le nano-système tel que préparé dans les cellules serait dégradé et entraînerait une accumulation de Fe (II), une génération de ROS remarquablement améliorée. L'effet anticancéreux de l'ART et de ses dérivés a été attribué à leur capacité à induire l'apoptose par divers processus cellulaires, allant de la réponse aux dommages à l'ADN, le processus catabolique médié par les lysosomes, la macroautophagie et le stress oxydatif [13, 35, 38]. Et il a également été rapporté que le clivage médié par le fer du pont endoperoxyde dans l'ART pourrait affecter l'équilibre oxydatif intracellulaire de la ferroptose dans de nombreux types de cellules cancéreuses [11]. Cette induction de ferroptose basée sur un déséquilibre oxydatif peut être encore amplifiée par l'ajout de Fe(II). Alors que Fe(II) active l'ART, il peut également réagir avec le peroxyde d'hydrogène intracellulaire pour générer des radicaux libres hydroxyles via la réaction de Fenton, ce qui renforce l'effet inducteur d'apoptose de l'ART dans les cellules tumorales.

TA-Fe/ART@ZIF apoptose et ferroptose induites dans les cellules MDA-MB-231

Pendant ce temps, pour étudier la mort cellulaire et le rôle de Fe(II), nous avons utilisé un chélateur de fer déféroxamine, un inhibiteur de l'apoptose Z-VAD-FMK et un inhibiteur de ferroptose ferrostatine-1 pour sauver ces cellules. Comme prévu, la déféroxamine, un piégeur de Fe(II), pourrait évidemment bloquer la mort cellulaire, suggérant le rôle important de Fe(II). De plus, le taux de survie des cellules MDA-MB-231 a été significativement amélioré par l'apoptose et l'inhibiteur de ferroptose de 31,4% à 56,3% et 76,0%, respectivement (Fig. 6a), soulignant l'importance de l'apoptose et de la ferroptose dans TA-Fe/ART Les nanoparticules @ZIF ont médié la mort cellulaire. En outre, nous avons utilisé un test basé sur l'Annexine V-FITC par cytométrie en flux, pour déterminer quantitativement le degré d'apoptose. Les résultats indiquent que les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF peuvent induire l'apoptose dans 21,8 % des cellules MDA-MB-231 (Fichier supplémentaire 1 : Fig. 6s). Ce pourcentage était supérieur à celui enregistré pour l'ART, ce qui implique que l'apoptose est impliquée dans les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF à médiation, mais ce n'est pas la cause principale.

un Les inhibiteurs DFO (déféroxamine), Fer-1 (Ferrostatine-1) et Z-VAD-FMK ont sauvé la viabilité des cellules MDA-MB-231 sous traitement avec 100 μg/mL de nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF, respectivement. b Les nanoparticules ART, TA-Fe/ZIF et TA-Fe/ART@ZIF ont contribué à un excès de MDA dans les cellules MDA-MB-231. c Les nanoparticules ART, TA-Fe/ZIF et TA-Fe/ART@ZIF ont consommé du GSH intracellulaire. d Les niveaux d'expression des protéines GPX4 dans les cellules MDA-MB-231 traitées avec des nanoparticules ART, TA-Fe/ZIF et TA-Fe/ART@ZIF

Une caractéristique commune de la ferroptose est la peroxydation lipidique endogène [39]. Le MDA, un produit de la peroxydation lipidique [40], a été étudié pour évaluer le degré de ferroptose. Les résultats ont montré que les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF avaient des niveaux de MDA environ 2,5 fois plus élevés que le groupe témoin (Fig. 6b). Cela a été présumé en raison de la présence de Fe(II) enrichi en nanotransporteurs et de l'élévation correspondante des niveaux de radicaux lipidiques. En tant que l'un des principaux composants antioxydants des cellules, le GSH intracellulaire est diminué accompagné d'une ferroptose [41]. Compte tenu du rôle important du GSH dans la ferroptose, nous avons évalué le niveau de GSH intracellulaire après traitement avec des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF. Le GSH a diminué de manière significative par rapport aux cellules traitées avec le véhicule (Fig. 6c). Cela a fourni des preuves solides de l'épuisement du GSH et du déséquilibre d'oxydation, qui était centré sur l'activation médiée par Fe(II) de l'ART par les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF. Ensuite, un western blot a été réalisé pour comprendre l'impact des nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF sur l'activité GPX4 [42]. Nous avons observé que les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF provoquaient une inhibition plus significative de l'activité GPX4 que l'ART (Fig. 6d). Ces données concordent également bien avec le degré le plus élevé d'épuisement du GSH.

Expérience antitumorale in Vivo

Nous avons évalué l'efficacité antitumorale de nos nanoparticules sur les cellules MDA-MB-231 in vivo par l'inhibition de tumeurs xénogreffes sous-cutanées chez des souris nudes porteuses de tumeurs. Au cours du traitement de 14 jours, par rapport à d'autres groupes, les nanoparticules TA-Fe/ART@ZIF peuvent inhiber de manière significative la croissance des tumeurs de xénogreffe MDA-MB-231 en raison de la génération abondante de ROS par réaction Fe(II)-ART (Fig. . 7a). De plus, il n'y avait pas de diversité significative de poids corporel dans tous les groupes expérimentaux (Fig. 7b), ce qui montre que le TA-Fe/ART@ZIF avait des effets secondaires négligeables. Pour approfondir l'étude de l'effet thérapeutique, la tumeur et d'autres tissus normaux ont été examinés par coloration H&E après avoir été traités pendant 14 jours. Comme le montre la figure 8, TA-Fe/ART@ZIF a causé la plus grande région de mort cellulaire dans le tissu tumoral, alors qu'il n'y avait pas de dommages évidents ni d'apoptose dans les tissus normaux. Overall, these results demonstrated that the TA-Fe/ART@ZIF-mediated therapy not only led to anticancer efficacy, but also have a low level of acute systematic toxicity in the SFT-MB-mediated therapy.

un Relative tumor volume after treated with treated with PBS, ART, TA-Fe/ZIF, and TA-Fe/ART@ZIF nanoparticles. b Relative mice body weight of various groups

H&E stains of organs and tumors from various mice groups. Scale bar:50 μm

Conclusion

In summary, ferroptosis provides a potential remedy for TNBC treatments, since it has exclusive advantages to overcome inevitable barriers of the currently prevalent therapy. Here, we designed a ferrous-supply nanocarrier for ART based on TA–Fe(II) coated on the ZIF nanoparticles with ART encapsulated via coordination-driven self-assembly for enhanced ferroptosis. The nano-carrier could be dissolved in the weak acidic microenvironment to release ART and Fe(II), which is further caused a high level of intracellular ROS and MDA, accompanied with decreasing of GSH and GPX4, leading to potent tumor growth inhibition and anticancer efficacy in vitro and in vivo. This work provides a novel approach to enhance the potency of ferroptotic nano-medicine and new directions for TBNC therapy. Biocompatibility and comprehensive mechanisms of TA-Fe/ART@ZIF-induced ferroptosis should be ensured for further investigation.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données sont entièrement disponibles sans restriction.

Abréviations

MOF:

Metal–organic frameworks

TNBC:

Triple-negative breast cancer

ART:

Artemisinin

TA:

Tannic acid

ZIF:

Zeolitic imidazolate framework-8

TA-Fe/ART@ZIF:

Tannic acid and ferrous ion coated on the zeolitic imidazolate framework-8 with artemisinin encapsulated

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

LPO:

Lipid hydroperoxides

GSH :

Glutathion

TEM :

Microscopie électronique à transmission

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

HPLC :

Chromatographie liquide haute performance

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

MTT :

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

DFO:

Deferoxamine

Fer-1:

Ferrostatin-1

Z-VAD-FMK:

N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluoromethyl ketone

Calcein-AM:

Calcein-acetoxymethyl

DCFH-DA:

Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate

MDA:

Malondialdehyde

BSA :

Sérum albumine bovine

TBST:

Tris-buffered saline Tween

SDS-PAGE:

Polyacrylamide gel electrophoresis

GPX4:

Glutathione peroxidase 4