Vecteurs d'alginate nano par synthèse en micelles inverses : encapsulation de la doxorubicine et cytotoxicité sur cellules de cancer du sein murin

Résumé

Les nanoparticules d'alginate réticulées constituent une plateforme attrayante pour l'encapsulation et la libération de médicaments. Nous rapportons ici un protocole simple par micelles inverses qui charge la doxorubicine (DOX), hydrosoluble, dans une matrice d'alginate réticulée au calcium, produisant des particules NALG-DOX d'un diamètre hydrodynamique d'environ 83 nm et d'un potentiel zêta de +7,2 mV. Les nanoalgines (NALG) obtenues sont sphériques et monodisperses, comme le confirme la microscopie électronique à transmission (MET). La libération de DOX est contrôlée : ~70 % retenue après 4 h et ~90 % libérée à 24 h au pH physiologique. L'imagerie par fluorescence confirme l'internalisation cellulaire de la DOX issue de NALG-DOX dans les cellules 4T1 de cancer du sein murin. Les essais de cytotoxicité (LIVE/DEAD et Alamar Blue) révèlent une IC₅₀ de 0,45 µg/mL pour NALG-DOX contre 0,093 µg/mL pour la DOX libre, tandis que le vecteur NALG vide ne présente aucune toxicité. Ces résultats démontrent le potentiel de la méthode par micelles inverses pour produire des nanoparticules d'alginate biocompatibles chargées en médicament.

Contexte

L'encapsulation de chimiothérapeutiques offre des avantages par rapport à l'administration systémique de médicament libre, notamment une circulation prolongée, une protection contre les protéines plasmatiques et une toxicité systémique réduite. Les nanovecteurs peuvent exploiter l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR) des tumeurs solides, permettant un ciblage passif lorsqu'ils sont de taille appropriée. Si les liposomes, particules polymères et nanoparticules lipidiques ont atteint la pratique clinique, de nombreuses formulations nouvelles se heurtent à des défis de préparation évolutive et de reproductibilité. L'alginate, polysaccharide naturel biodégradable et non immunogène, peut être réticulé par des cations divalents (typiquement Ca²⁺) pour former des nanoparticules d'hydrogel. Cette étude présente une synthèse rapide par micelles inverses à température ambiante, produisant des nanoparticules d'alginate uniformes capables d'encapsuler des médicaments hydrophiles comme la DOX.

Méthodes

Matériaux

Alginate de sodium, chlorure de calcium dihydraté, cyclohexane, dodécylamine et chlorhydrate de DOX proviennent de Sigma-Aldrich et MedChem Express. Toutes les solutions sont préparées dans de l'eau 18 MΩ.

Préparation des nanoalgines (NALG)

L'alginate (15 mg/mL) est agité 30 min pour assurer sa dissolution complète. Pour le chargement en DOX, le médicament est dissous dans la même phase aqueuse. Huit millilitres de cyclohexane sont placés dans un flacon, et 80 µL de dodécylamine (solubilisée dans de l'eau chaude) sont ajoutés pour générer la phase huileuse. La solution aqueuse d'alginate/DOX (20 µL) est ensuite introduite sous agitation vigoureuse (1 200 tr/min) pendant 20 min, suivie de l'ajout de 30 µL de CaCl₂ 50 mM pour réticuler l'alginate à l'intérieur des micelles inverses. Après 25 min, 2 mL d'eau sont ajoutés pour séparer la phase aqueuse, d'où les nanoparticules sont récupérées par pipetage.

Purification

L'extrait aqueux est filtré séquentiellement sur unités centrifuges 100 kDa et 10 kDa (Pall, Millipore) pour éliminer agrégats et médicament libre, donnant un volume final de 1 mL de NALG ou NALG-DOX purifiés.

Caractérisation

La diffusion dynamique de la lumière (Malvern Zetasizer) mesure la taille (laser 633 nm, 25 °C, diffusion arrière 173°). Le potentiel zêta est enregistré immédiatement après. La microscopie électronique à transmission (MET) sur Tecnai F-20 (4 kV) confirme la morphologie. La teneur en DOX est quantifiée par sa fluorescence intrinsèque (excitation 470 nm, émission 550 nm) et comparée à une courbe étalon.

Étude de libération

La dialyse (Slide-A-Lyzer MINI, COPM 2 kDa) dans du PBS (pH 7,4) et du tampon citrate (pH 5,5) évalue la libération de DOX à 1, 2, 4, 24, 48 et 72 h. Les lectures de fluorescence permettent de calculer la concentration de DOX libérée.

Culture cellulaire et traitement

Les cellules 4T1-luc2-GFP de cancer du sein murin (PerkinElmer) sont cultivées en RPMI 1640 + 10 % FBS + 1 % pénicilline/streptomycine. Les cellules sont ensemencées à 4 000 cellules/puits (plaques 96 puits) et traitées après 24 h avec NALG, DOX libre ou NALG-DOX à concentrations variables.

Imagerie par fluorescence

Après 48 h, les cellules sont fixées au formol, colorées au NucBlue, et imageées sur EVOS FL Auto (ThermoFisher) aux canaux DAPI, GFP et DOX. Les images sont traitées avec ImageJ.

Test LIVE/DEAD

À 72 h, les cellules sont incubées avec les réactifs NucBlue Live et NucGreen Dead (ThermoFisher), fixées, et imageées comme ci-dessus. La fluorescence verte indique les cellules mortes.

Test de viabilité Alamar Blue

Alamar Blue (10 µL par puits dans 100 µL de milieu) est ajouté à 72 h, incubé 1 h à 37 °C, et lu sur Tecan Infinite M200 Pro (560/590 nm). La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage relatif aux témoins non traités.

Résultats et discussion

Synthèse par micelles inverses

L'approche par micelles inverses produit des colloïdes aqueux transparents de NALG et NALG-DOX. Le cyclohexane sert de phase huileuse, tandis que la dodécylamine fonctionne comme surfactant pour stabiliser les chaînes d'alginate dans les micelles. Le chlorure de calcium réticule le réseau d'hydrogel, et l'extraction aqueuse subséquente donne des particules monodisperses.

Caractérisation des particules

Les données DLS montrent NALG à 92,2 ± 4,2 nm (IP 0,320 ± 0,063, ζ -15,0 ± 0,8 mV) et NALG-DOX à 82,8 ± 3,6 nm (IP 0,204 ± 0,044, ζ +7,2 ± 4,6 mV). Les images MET confirment une morphologie sphérique avec des diamètres correspondant aux mesures DLS. Le chargement en DOX est d'environ 7 % (≈4 µg/mL), indiquant une efficacité d'encapsulation modérée typique des vecteurs polymères.

Cinétique de libération

Dans le PBS (pH 7,4), ~70 % de DOX restent après 4 h, avec ~90 % libérés à 24 h. Au pH 5,5, la libération s'accélère, reflétant le microenvironnement tumoral acide et les compartiments intracellulaires, et permettant un profil de libération sensible au pH.

Internalisation cellulaire

La microscopie de fluorescence après 48 h révèle une localisation de la DOX près du noyau pour les traitements DOX libre et NALG-DOX. La DOX encapsulée présente une distribution péricaryon distincte, cohérente avec une internalisation par endocytose et libération subséquente dans l'endosome acide.

Cytotoxicité

L'imagerie LIVE/DEAD montre une mort cellulaire minime avec NALG seul, alors que DOX et NALG-DOX induisent une cytotoxicité dose-dépendante. L'analyse Alamar Blue donne des IC₅₀ de 0,093 µg/mL pour la DOX libre et 0,45 µg/mL pour NALG-DOX. L'IC₅₀ plus élevée de NALG-DOX reflète la libération contrôlée et la disponibilité immédiate réduite du médicament, pourtant le médicament encapsulé reste efficace.

Conclusions

Nous avons établi une méthode rapide et évolutive par micelles inverses pour générer des nanoparticules d'alginate de ~90 nm encapsulant efficacement la DOX. Le NALG-DOX résultant montre une libération contrôlée, une toxicité systémique réduite et une activité antitumorale comparable à la DOX libre in vitro. Les travaux futurs porteront sur l'optimisation de l'efficacité d'encapsulation et la performance in vivo.

Abréviations

4T1-luc2-GFP

4T1 luciférase/protéine fluorescente verte

CaCl₂

Chlorure de calcium

DAPI

4',6-Diamidino-2-phénylindole

DLS

Diffusion dynamique de la lumière

DMSO

Diméthylsulfoxyde

DOX

Doxorubicine

NALG

Nanoparticules d'alginate

NALG-DOX

Nanoparticules d'alginate chargées en doxorubicine

PBS

Tampon phosphate salin

PDI

Indice de polydispersité

TEM

Microscopie électronique à transmission