Co-administration ciblée de 5-fluorouracile et LY294002 via nanoparticules lipidiques PEGylées améliore l'efficacité antitumorale dans le carcinome épidermoïde de l'œsophage

Résumé

Nous avons conçu une nanoliposome PEGylée co-encapsulant l'agent chimiothérapeutique 5-fluorouracile (5-FU) et l'inhibiteur d'autophagie LY294002 (LY) pour traiter le carcinome épidermoïde de l'œsophage (CEO). Des caractérisations physicochimiques et biologiques complètes ont démontré un double chargement de médicament réussi et un profil de libération contrôlé, avec une libération de LY légèrement plus rapide que celle du 5-FU. Les liposomes ont présenté une absorption médiée par récepteurs, confirmée par microscopie confocale et cytométrie de flux, et ont délivré des concentrations intracellulaires plus élevées des deux agents. In vitro, la nanoliposome (FLNP) a induit une cytotoxicité et une apoptose plus grandes (~48 %) que chaque médicament seul ou leur combinaison libre, comme en témoignent les tests MTT, annexine V/PI et coloration de Hoechst. Le Western blot a révélé une régulation positive de la caspase-3 et de la PARP et une régulation négative de Bcl-2, confirmant l'induction de l'apoptose. Dans un modèle xénogreffe, le FLNP a atteint une inhibition supérieure de la croissance tumorale, réduisant le volume tumoral à ~500 mm³ versus ~1 400 mm³ dans les témoins (p < 0,0001). Ces résultats soutiennent la promesse d'une co-administration programmée d'inhibition de l'autophagie et de chimiothérapie via un seul nanovecteur pour surmonter la multirésistance aux médicaments dans le CEO.

Contexte

Le carcinome épidermoïde de l'œsophage (CEO) reste un fardeau sanitaire majeur en Asie de l'Est, avec un taux de survie à 5 ans d'environ 25 % (1,2). Bien que la chirurgie soit la pierre angulaire du traitement, la chimiothérapie adjuvante peut améliorer significativement les résultats (3,4). Cependant, la monothérapie échoue souvent en raison de l'hétérogénéité tumorale et de la résistance intrinsèque (5). Les schémas de combinaison ciblant des voies cellulaires distinctes sont donc essentiels pour une efficacité synergique (6,7).

L'autophagie, un processus de dégradation lysosomale, est fréquemment surexprimée dans les cellules cancéreuses sous stress et peut les protéger des agents chimiothérapeutiques (8). L'inhibition de l'autophagie a été montrée pour sensibiliser les cellules tumorales aux médicaments cytotoxiques, surmontant ainsi la multirésistance aux médicaments (MRM) (9). Le LY294002 (LY) est un inhibiteur bien étudié de la PI3K qui bloque efficacement l'autophagie (9). Le 5-fluorouracile (5-FU), un analogue de pyrimidine fluoré, est largement utilisé dans les cancers épidermoïdes ; sa cytotoxicité découle de son incorporation dans l'ARN et de l'inhibition de la thymidylate synthase (10-12). Le 5-FU et le LY souffrent tous deux d'une faible solubilité aqueuse et d'une clairance systémique rapide, limitant leur fenêtre thérapeutique (6,7).

Les nanovecteurs, en particulier les liposomes PEGylés, ont émergé comme des véhicules cliniquement validés pour l'administration de médicaments, offrant une solubilité améliorée, une circulation prolongée et une accumulation tumorale passive via l'effet de perméabilité et de rétention accrue (EPR) (13-18). En encapsulant à la fois le 5-FU et le LY dans un seul liposome PEGylé, nous supposons que la libération précoce du LY perturbera les voies de survie autophagiques, rendant les cellules tumorales plus sensibles au 5-FU et produisant une réponse antitumorale synergique.

Méthodes

Matériaux

Le 5-FU (Sigma-Aldrich, Chine) et le LY294002 (Beijing Huafeng United Technology Corporation, Chine) ont été utilisés tels que reçus. Les lipides — phosphatidylcholine d'œuf (EPC), DSPE-PEG2000 et cholestérol — provenaient d'Avanti Polar Lipids, Chine.

Préparation des nanoliposomes à double chargement

Les phospholipides et le cholestérol ont été dissous dans un mélange méthanol-chloroforme (rapport molaire 10:4:1, 10 mg total). Le 5-FU et le LY (1,5 mg chacun) ont été ajoutés, et le solvant a été évaporé à 60 °C sous pression réduite pour former un film mince. L'hydratation avec du tampon phosphate salin (PBS) pendant 1 h suivie d'une extrusion à travers une membrane de polycarbonate de 200 nm a produit le FLNP. Le médicament non encapsulé a été quantifié par HPLC. Le chargement en médicament (DL) et l'efficacité d'encapsulation (EE) ont été calculés comme suit : DL (%) = (Poids du médicament encapsulé / Poids du liposome) × 100 ; EE (%) = (Poids du médicament encapsulé / Poids initial du médicament) × 100.

Analyse de la taille des particules

La diffusion dynamique de la lumière (DDL) utilisant un Malvern Zetasizer Nano ZS a mesuré la taille des particules et l'indice de polydispersité (PDI) à 25 °C.

Analyse de morphologie

La microscopie électronique à transmission (MET, Hitachi H-7600) et la microscopie à force atomique (AFM) ont caractérisé la morphologie.

Étude de libération in vitro

La libération de médicament du FLNP a été évaluée dans du PBS (pH 7,4) à 37 °C en utilisant une membrane de dialyse (PM ≈ 3 500). Des échantillons ont été prélevés à intervalles prédéterminés et analysés par HPLC (autosampler Hitachi L-2200, détecteur UV-Vis L-2420 ; colonne Inertsil C18, 150 × 4,6 mm, 5 µm). L'étalonnage linéaire variait de 0,025 à 2 µg/mL (r² ≈ 0,9995).

Culture cellulaire

La lignée cellulaire humaine de CEO EC 9706 a été maintenue en RPMI 1640 supplémenté avec 10 % FBS, 100 U/mL pénicilline et 100 µg/mL streptomycine dans un incubateur humidifié à 5 % CO₂.

Analyse de l'absorption cellulaire

Des FLNP chargés en rhodamine B fluorescent ont été incubés avec des cellules EC 9706 (10 µg/mL) pendant 2 h. La microscopie confocale à balayage laser (CLSM, Nikon TE2000-E) a visualisé la distribution intracellulaire. La cytométrie de flux (BD FACSCalibur) a quantifié l'absorption aux points temporels de 1 h et 2 h.

Essai de cytotoxicité

Des tests de viabilité MTT ont été réalisés sur 1 × 10⁴ cellules/puits (plaques à 96 puits). Les cellules ont été traitées avec du 5-FU libre, du LY, du 5-FU + LY, ou du FLNP pendant 24 h. L'absorbance à 570 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur Synergy HTX.

Essai d'apoptose

La coloration Annexine-V/PI (BD Biosciences) suivie de cytométrie de flux a quantifié l'apoptose précoce et tardive après 24 h de traitement (1 µg équivalent médicament).

Essai Hoechst 33342

La coloration Hoechst 33342 (1 µg/mL) de cellules fixées a visualisé la condensation nucléaire sous un microscope à fluorescence.

Western blot

Les extraits protéiques ont été séparés par SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF. Les blots ont été sondés pour la caspase-3 clivée, la PARP, le Bcl-2 et le p53 (AbClon). La détection a utilisé l'ECL et le traitement Kodak M35-A.

Inhibition de la croissance tumorale in vivo

Des souris athymiques femelles (6 semaines) ont reçu des injections sous-cutanées de 1 × 10⁶ cellules OE-19 (100 µL). Lorsque les tumeurs ont atteint ~80 mm³ (jour 10), les souris (n = 6 par groupe) ont reçu 5 mg/kg de FLNP, des combinaisons de médicaments libres ou des témoins par injection intrapéritonéale trois fois sur 10 jours. Le volume tumoral (V = ½ × longueur × largeur²) a été mesuré au pied à coulisse pendant 20 jours.

Analyse statistique

Les données étaient exprimées comme moyenne ± écart-type. La significativité a été évaluée par test t ou ANOVA (p < 0,05).

Résultats et discussion

La co-administration de 5-FU et LY dans des liposomes PEGylés a atteint un effet antitumorale synergique surpassant l'efficacité de chaque agent seul ou de leur combinaison libre. Cette synergie est attribuée à la libération séquentielle du LY, qui altère l'autophagie et sensibilise les cellules aux dommages à l'ADN induits par le 5-FU.

Préparation et caractérisation des nanoliposomes chargés en 5-FU et LY

Les liposomes vides présentaient un diamètre moyen d'environ 110 nm (PDI ≈ 0,15). Le double chargement de médicament a augmenté la taille à environ 150 nm (PDI ≈ 0,18), une dimension favorisant l'accumulation tumorale médiée par EPR (17,18). La charge de surface était de +25 mV, conférant une stabilité colloïdale et minimisant l'adsorption non spécifique de protéines.

Chargement de médicament et libération in vitro

Les efficacités d'encapsulation étaient de 92,5 % pour le 5-FU et 86 % pour le LY, avec une capacité de chargement d'environ 16 % p/p. Les profils de libération dans le PBS (pH 7,4) ont révélé un motif biphasique : ~30 % de 5-FU et ~40 % de LY libérés en 24 h, suivis d'une libération progressive à ~60 % de 5-FU et ~75 % de LY à 90 h (Fig. 3). La libération plus rapide du LY favorise une inhibition précoce de l'autophagie, préparant les cellules à la cytotoxicité subséquente du 5-FU.

Étude d'internalisation cellulaire

La CLSM a révélé une fluorescence rouge intense dans le cytoplasme périnucléaire après 2 h, indiquant une endocytose médiée par récepteurs. La cytométrie de flux a confirmé une absorption temps-dépendante, avec une augmentation marquée entre 1 h et 2 h (Fig. 4).

Effet anticancéreux in vitro

Les tests MTT ont démontré une cytotoxicité dose-dépendante pour toutes les formulations. Le FLNP a atteint une CI₅₀ de 0,58 µg/mL, nettement inférieure au 5-FU libre (2,68 µg/mL), au LY (5,98 µg/mL) et à la combinaison libre (1,54 µg/mL). L'efficacité améliorée est attribuée à une meilleure administration du médicament et à une libération séquentielle (Fig. 5).

Évaluation de l'apoptose

La coloration Annexine-V/PI a révélé 48 % d'apoptose dans les cellules traitées par FLNP, comparé à 20 % pour le 5-FU seul et 30 % pour la combinaison libre (Fig. 6). La coloration de Hoechst a corroboré la condensation nucléaire dans les cellules traitées par FLNP.

Analyse Western blot

Le FLNP a nettement augmenté la caspase-3 clivée et la PARP tout en réduisant l'expression de Bcl-2 et p53, confirmant l'activation de la voie apoptotique intrinsèque (Fig. 7).

Analyse de l'inhibition de la croissance tumorale in vivo

Le FLNP a constamment supprimé la progression tumorale sur 20 jours, atteignant une réduction de >60 % du volume tumoral final par rapport aux groupes de médicaments libres. Le résultat thérapeutique amélioré est attribué à l'accumulation tumorale sélective (EPR) et à la libération soutenue du médicament.

Conclusions

Notre plateforme liposomale PEGylée co-administre avec succès le 5-FU et le LY, atteignant une libération contrôlée et séquentielle qui amplifie la cytotoxicité et l'apoptose dans le CEO. Le FLNP a surpassé les combinaisons de médicaments libres in vitro et in vivo, soulignant le potentiel de l'inhibition de l'autophagie pour surmonter la chimiorésistance. De futures études étendront cette stratégie à d'autres malignancies épidermoïdes et évalueront des modèles xénogreffes orthotopiques et dérivés de patients.

Abréviations

5-FU :

5-Fluorouracile

EPR :

Effet de perméabilité et de rétention accrue

CEO :

Carcinome épidermoïde de l'œsophage

FLNP :

Nanoparticules lipidiques chargées en 5-FU et LY