Inhibiteur de l'autophagie (LY294002) et nanoliposome à base de 5-fluorouracile (5-FU) pour une efficacité accrue contre le carcinome épidermoïde de l'œsophage

Contexte

Le carcinome épidermoïde de l'œsophage (ESCC) est l'un des types courants de cancer de l'œsophage qui est le plus répandu en Asie de l'Est comme la Chine [1, 2]. Le taux de survie à 5 ans de l'ESCC est d'environ 25 %. La chirurgie est la principale option de traitement pour le traitement ESCC ; cependant, on pense que la chimiothérapie adjuvante aura un grand impact sur le traitement ESCC [3, 4]. Il a été rapporté qu'un traitement chimiothérapeutique basé sur un régime médicamenteux unique entraînait une efficacité thérapeutique médiocre en raison de l'hétérogénéité des cellules cancéreuses [5]. Les cellules cancéreuses sont souvent résistantes à des médicaments anticancéreux uniques et ne seront pas efficaces dans la nature. À cet égard, une combinaison de deux ou plusieurs médicaments agira de manière synergique en ciblant différentes cibles cellulaires [6, 7]. Il a été rapporté que les inhibiteurs de l'autophagie surmontent la multirésistance aux médicaments (MDR) des cellules cancéreuses. Lorsque les cellules ont une nutrition et un facteur de croissance limités, l'autophagie fournit l'homéostasie indispensable à l'environnement du cancer et contribue à sa survie [8]. L'autophagie sert également à protéger les cellules cancéreuses des agents chimiothérapeutiques. Dans cette étude, nous avons sélectionné le LY294002 (LY) comme inhibiteur de l'autophagie [9].

Plusieurs études ont rapporté que les inhibiteurs de l'autophagie fonctionnent mieux lorsqu'ils sont combinés avec un médicament anticancéreux. Dans cette étude, nous avons sélectionné le 5-fluorouracile (5-FU) comme agent chimiothérapeutique. Le 5-FU a été principalement indiqué dans le traitement des cancers épidermoïdes et utilisé chez les patients atteints de cancer du sein et d'autres cancers [10]. Le 5-FU a un atome de fluor en position C-5 de l'uracile à la place de l'hydrogène. L'effet anticancéreux du 5-FU résulte de la régulation de diverses molécules telles que Bax et Bcl-2 et induit l'apoptose des cellules cancéreuses [11, 12]. Malgré l'effet cytotoxique potentiel du 5-FU et du LY, les deux agents souffrent de problèmes de solubilité dans l'eau et de stabilité, ce qui entraîne une courte demi-vie plasmatique et des effets toxiques indésirables pour les cellules normales [6]. De plus, un simple mélange de cocktails des deux agents anticancéreux n'induit pas d'effet synergique en raison de la libération aléatoire de médicaments et de la distribution incontrôlée des médicaments dans divers tissus [7]. Par conséquent, il est de la plus haute importance d'administrer à la fois les médicaments anticancéreux d'une manière programmée et bien contrôlée, ce qui augmentera son efficacité thérapeutique.

Les nanoparticules ont été largement étudiées en tant que vecteurs d'administration de médicaments pour des applications de ciblage du cancer [13]. Le médicament peu soluble pourrait être incorporé de manière stable dans les nanoparticules et ainsi sa solubilité et sa biodisponibilité pourraient être améliorées. Parmi tous les supports, le liposome a été largement étudié pour son aptitude à des applications systémiques [14, 15]. Des études antérieures ont démontré que de nombreuses formulations liposomales commerciales sont disponibles, notamment Doxil, Myocet, LipoPlatin, etc. La circulation systémique des liposomes pourrait être améliorée par la conjugaison en surface du polyéthylène (glycol) (PEG) en tant qu'enveloppe hydrophile [16]. La couche nanométrique et hydrophile de PEG conférerait une circulation sanguine prolongée et réduirait les clairances plasmatiques réticulo-endothéliales (RES). En outre, la NP pourrait s'accumuler passivement dans les tissus tumoraux via un effet de perméation et de rétention améliorés (EPR) [17, 18]. Par conséquent, on peut s'attendre à ce que si le médicament chimiothérapeutique et l'inhibiteur de l'autophagie pouvaient être incorporés dans le support unique, il aurait un effet anticancéreux synergique dans l'ESCC.

Jusqu'à présent, l'objectif principal de la présente étude était d'administrer une combinaison de 5-FU et de LY pour traiter l'ESCC. À cette fin, le 5-FU et le LY ont été incorporés de manière stable dans le nanoliposome PEGylé. On s'est attendu à ce que la libération précoce de l'inhibiteur de l'autophagie (LY) perturbe le mécanisme de protection des cellules cancéreuses et par la suite que le 5-FU agisse de manière plus forte dans les cellules cancéreuses. Le liposome chargé de médicament a été caractérisé en termes de taille de particule, de forme et de schéma de libération. L'absorption cellulaire et le test de viabilité cellulaire ont été effectués dans des cellules cancéreuses ESCC. De plus, le dosage de l'apoptose a été réalisé au moyen d'une coloration à l'annexine V/PI et d'une coloration Hoechst 33382. Enfin, une étude d'efficacité antitumorale a été réalisée dans un modèle animal de xénogreffe portant des cellules ESCC.

Méthodes

Matériaux

Le 5-fluorouracile a été acheté auprès de Sigma-Aldrich, Chine. La 2-(4-morpholinyl)-8-phényl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002, LY) a été achetée auprès de Beijing Huafeng United Technology Corporation, Chine. La L-a-phosphatidylcholine (œuf/poulet) (EPC), le distéroylphosphatidyléthanolamine-polyéthylène glycol (2000) (DSPE-PEG) et le cholestérol ont été achetés auprès d'Avanti Polar Lipids, Chine. Tous les autres produits chimiques étaient de qualité réactif et utilisés pour d'autres purifications.

Préparation de nanoliposomes à double dose de médicament

EPC, DSPE-PEG et cholestérol ont été mélangés dans un mélange méthanol-chloroforme (rapport 10:4:1 M (total 10 mg)), et à ce mélange organique, 5-FU (1,5 mg) et LY (1,5 mg) ont été ajoutée. Les solvants organiques ont été évaporés à l'aide d'un évaporateur rotatif (Buchi, USA) à 60 °C pendant 1 h. Le film lipidique mince a été hydraté avec le tampon PBS pendant 1 h puis extrudé à travers une mini-extrudeuse via une membrane en polycarbonate (200 nm). Le nanoliposome chargé de médicament a été filtré à travers un tube Millipore avec un PM de 3500. Le liposome chargé de médicament a été collecté dans la chambre supérieure et le médicament non piégé a été déterminé par la méthode HPLC. La charge et l'encapsulation du médicament ont été calculées à l'aide des équations suivantes :

Analyse de la taille des particules

La taille des particules et la distribution de la taille des nanoparticules ont été déterminées par la technique de diffusion dynamique de la lumière (DLS) à l'aide de Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments, Royaume-Uni). La taille des particules a été mesurée à 25°C après dilution appropriée avec de l'eau distillée. Toutes les mesures ont été effectuées en triple.

Analyse de la morphologie

La morphologie des NP a d'abord été étudiée par microscopie électronique à transmission (MET ; H-7600, Hitachi, Tokyo, Japon) à une tension d'accélération de 100 kV. Les échantillons ont été chargés dans une grille de cuivre recouverte de carbone et séchés. La morphologie NP a été en outre observée en microscopie à force atomique (AFM). Les échantillons ont été placés sur une surface en mica.

Étude de libération in vitro

La libération in vitro de 5-FU et de LY à partir de nanoliposomes PEGylés (FLNP) chargés de 5-FU et de LY a été étudiée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) à 37 °C. La dispersion de NP (1 ml contenant 1 mg de chaque médicament dans un support) a été placée dans une membrane de dialyse (PM ~   3500) et les deux extrémités ont été scellées. La membrane de dialyse a été placée dans un tube avec 30 ml de milieu de libération. Le tube contenant la membrane de dialyse a été placé dans un bain agité et laissé à incuber pendant le temps requis. À des moments précis, 100 μl de l'échantillon ont été prélevés et remplacés par une quantité égale de tampon frais. La quantité de médicament libérée dans le tampon a été étudiée au moyen de la méthode HPLC. Un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (Hitachi, Tokyo, Japon) composé d'un échantillonneur automatique L-2200 et d'un détecteur UV-Vis L-2420 a été utilisé. Une colonne Inertsil C18 (150 mm × 4,6 mm, granulométrie 5 μm ; Cosmosil, Nacalai Tesque Inc., USA) a été utilisée sous élution isocratique de la phase mobile à un débit de 1,0 mL/min et une température de colonne de 25 ° C. Une bonne linéarité a été observée entre 0,025 et 2 μg/ml pour les deux médicaments avec un coefficient de corrélation (r ² ) autour de 0.9995. Les LOD (μg/ml) pour le 5-FU et le LY étaient respectivement de 0,020 et 0,050. La LOQ (μg/ml) pour le 5-FU et le LY étaient respectivement de 0,070 et 0,150.

Culture cellulaire

La lignée cellulaire du cancer de l'œsophage, EC 9706, a été cultivée dans un milieu RPMI normal avec 10 % de FBS et 100 unités/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine dans 5 % de CO₂ et 95% d'humidité d'atmosphère dans l'humidificateur.

Analyse de l'absorption cellulaire

L'absorption cellulaire de NP a été observée au microscope confocal à balayage laser (CLSM). À cette fin, la NP chargée de rhodamine B a été préparée et purifiée par filtration sur gel en utilisant une colonne Sephadex G-50 avec du tampon HEPES. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits et incubées pendant une nuit. Les cellules ont ensuite été exposées avec de la NP chargée en rhodamine B (10 μg/ml) et incubées pendant 2 h. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde (PFA) à 2 % et lavées à nouveau avec du PBS. Les cellules ont ensuite été colorées avec du DAPI comme agent de coloration nucléaire. Les cellules ont été lavées et observées au microscope à fluorescence (microscope Nikon TE2000-E).

L'absorption cellulaire a été en outre observée à l'aide d'un cytomètre en flux. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits et incubées pendant une nuit. Les cellules ont ensuite été exposées avec de la NP chargée de rhodamine B et incubées pendant 1 h et 2 h, respectivement. Les cellules ont ensuite été extraites et lavées deux fois avec du PBS. Les cellules ont été remises en suspension dans du tampon PBS et analysées à l'aide d'un trieur de cellules activé par fluorescence Calibur équipé du logiciel CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA).

Test de cytotoxicité

Le potentiel cytotoxique des formulations individuelles a été évalué par dosage du bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazoyl)-2,5-diphényl tétrazolium (MTT). En bref, 1 × 10 ⁴ les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits et incubées pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été exposées à différentes concentrations de 5-FU libre, LY, 5-FU + LY et FLNP, respectivement, puis incubées pendant 24 h. Des solutions de MTT ont été préparées (5 mg/ml) et 10 μl de solution de MTT ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 4 h. Le cristal de formazan a été extrait en ajoutant du DMSO et l'absorbance a été étudiée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Synergy™ HTX Multi-Mode Microplate Reader) (à 570 nm).

Test d'apoptose

L'apoptose de la cellule cancéreuse a été déterminée par le protocole de coloration à l'Annexine-V/PI (BD Biosciences, USA). Brièvement, EC 9706 a été ensemencé dans une plaque à 12 puits et incubé pendant 24 h. Les cellules ont été incubées avec du 5-FU libre, du LY, du 5-FU + LY et du FLNP, respectivement, puis incubées pendant 24 h (1 μg de concentration équivalente de médicament). Les cellules ont été extraites et colorées avec de l'annexine V-FITC et PI pendant 15 min à température ambiante, puis dénombrées par analyse par cytométrie en flux à l'aide d'un logiciel FACS CELLQuest (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA).

Dosage Hoechst 33342

L'apoptose de la cellule cancéreuse a été en outre déterminée par le protocole de coloration Hoechst 33342. Brièvement, EC 9706 a été ensemencé dans une plaque à 12 puits et incubé pendant 24 h. Les cellules ont été incubées avec du 5-FU libre, du LY, du 5-FU + LY et du FLNP, respectivement, puis incubées pendant 24 h (1 μg de concentration équivalente de médicament). Les cellules ont été fixées avec 2% de PFA et incubées avec Hoechst 33342 (1 μg/ml) pendant 15 min. L'apoptose cellulaire a ensuite été observée au microscope à fluorescence.

Western Blot

Les cellules EC 9706 ont été ensemencées et traitées avec du 5-FU libre, du LY, du 5-FU + LY et du FLNP, respectivement, puis incubées pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été lysées et le surnageant a été soumis à une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) et transféré sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (Millipore). Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % puis incubées avec les anticorps primaires spécifiques pendant une nuit à 4 °C. Après incubation avec le conjugué d'anticorps secondaire peroxydase de raifort, des transferts ont été révélés en utilisant le système ECL (AbClon) pour la détection du signal. Les films ont été développés à l'aide d'un processeur Kodak M35-A X-OMAT.

Inhibition de la croissance tumorale in vivo

Les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives du comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'hôpital populaire de Subei de la province du Jiangsu, en Chine. Une souris nude femelle de 6 semaines a été inoculée avec 1 × 10 ⁶ Cellules OE-19 sur le flanc droit des souris dans 100 μl de milieu. Les tumeurs ont pu croître jusqu'à 80 mm ³ (jour 10). L'animal a été divisé en cinq groupes avec six souris dans chaque groupe. Les souris ont reçu des injections de formulations respectives à une dose fixe de 5 mg/kg et administrées trois fois au cours des 10 premiers jours de l'expérience. La taille de la tumeur a été mesurée en termes de volume tumoral à l'aide d'un pied à coulisse et la taille estimée à l'aide de la formule ; Volume = (largeur ² × longueur)/2.

Analyse statistique

Les données ont été exprimées sous forme d'écarts-types moyens  ± . La signification statistique a été déterminée en utilisant t test et analyse de variance (ANOVA). P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats et discussion

Les cellules cancéreuses sont souvent résistantes à des médicaments anticancéreux uniques et ne seront pas efficaces dans la nature. À cet égard, une combinaison de deux médicaments ou plus agira de manière synergique en ciblant différentes cibles cellulaires. Il a été rapporté que les inhibiteurs de l'autophagie surmontent la multirésistance aux médicaments (MDR) des cellules cancéreuses. Plusieurs études ont rapporté que les inhibiteurs de l'autophagie fonctionnent mieux lorsqu'ils sont combinés avec un médicament anticancéreux. Dans cette étude, nous avons sélectionné le 5-fluorouracile (5-FU) comme agent chimiothérapeutique et le LY294002 (LY) comme inhibiteur de l'autophagie. Afin de répondre aux problèmes de solubilité et de stabilité des médicaments libres qui à leur tour entraînent une courte demi-vie plasmatique et un effet toxique indésirable, nous avons incorporé de manière stable le 5-FU et le LY dans le nanoliposome pégylé (Fig. 1).

Illustration schématique de la préparation de 5-fluorouracile et de nanoliposomes PEGylés chargés en LY

Préparation et caractérisation de nanoliposomes chargés de 5-FU et de LY

Le liposome chargé en double médicament a été préparé par une méthode d'hydratation en couche mince. La taille moyenne des particules du liposome vierge s'est avérée être d'environ 110 nm avec un excellent indice de dispersité. La taille des particules du liposome chargé en double médicament (FLNP) a augmenté jusqu'à ~ 150 nm avec un bon indice de polydispersité (PDI ~ 150) (Fig. 2a). L'augmentation de la taille des particules a été principalement attribuée à l'incorporation de médicaments hydrophobes dans le liposome. Il a été rapporté que la taille des particules d'environ 200 nm augmenterait l'accumulation de médicament dans les tissus tumoraux en raison de l'effet de perméation et de rétention amélioré (EPR). Le liposome chargé de médicament a présenté une capacité de stockage à long terme attribuée à la présence de PEG à sa surface qui a contribué à l'effet anti-encrassement. De plus, le FLNP présentait une charge de surface moyenne d'environ 25 mV indiquant sa stabilité colloïdale. La charge surfacique négative évitera toute interaction dans les circulations systémiques.

Caractérisations physico-chimiques du FLNP. un Distribution granulométrique du FLNP par la méthode DLS. b Image MET du FLNP. c Image AFM du FLNP

La morphologie du FLNP a été observée pour la première fois en utilisant la MET (Fig. 2b). Comme on le voit, les particules étaient de forme sphérique typique et uniformément dispersées dans la grille de cuivre. Une légère coquille grisâtre sur la circonférence a été attribuée à la présence de PEG à sa surface. La taille des particules observée à partir de MET était légèrement plus petite que celle de DLS. La taille des particules de TEM était d'environ 130 nm par rapport à environ 150 nm de DLS. La différence de taille des particules de deux techniques pourrait être attribuée à l'état de la mesure. Le MET mesure la particule dans des conditions sèches tandis que le DLS mesure la particule dans des conditions hydratées et l'allongement de la chaîne PEG. La morphologie des particules a été confirmée par l'AFM (Fig. 2c). Les particules étaient circulaires et présentes sous la forme d'un objet aplati sur la surface du mica.

Chargement de médicaments et libération de médicaments in vitro

Le FLNP a montré une efficacité de piégeage élevée pour les deux médicaments (92,5% pour le 5-FU et 86% pour le LY) avec une charge active de médicament d'environ ~ 16% w /w . Le comportement de libération in vitro du 5-FU et du LY du FLNP a été observé dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4). Les deux composants du FLNP sont libérés de manière contrôlée dans des conditions de pH 7,4. Par exemple, environ 30 % de 5-FU et environ 40 % de LY sont libérés du liposome au bout de 24 h. La libération de médicaments s'est poursuivie jusqu'à 90 h avec ~ 60 % de 5-FU et ~ 75 % de LV libérés (Fig. 3). Il convient de noter que le taux de libération a diminué de manière significative après 24 h jusqu'à 90 h indiquant la lente diffusion des médicaments du système NP. Une telle libération contrôlée du médicament serait bénéfique pour les applications ciblant le cancer. De plus, une libération lente du médicament dans des conditions neutres indique des effets secondaires moindres sur les tissus normaux. Il convient de noter que le LY est relativement plus rapide que celui du 5-FU. Ce sera une situation bénéfique car le LY rendrait les cellules cancéreuses plus sensibles au 5-FU, ce qui augmenterait l'effet cytotoxique dans les tissus tumoraux.

Profils de libération du 5-FU et du LY du FLNP dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7.4). La quantité de médicament libérée a été quantifiée par analyse HPLC

Étude d'internalisation cellulaire

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) a été réalisée pour déterminer le modèle subcellulaire du FLNP. La rhodamine B a été utilisée comme sonde fluorescente pour suivre l'absorption intracellulaire des NP dans ESCC. Comme on le voit (Fig. 4), un fort signal de fluorescence rouge a été observé dans le cytoplasme cellulaire sur la circonférence du noyau indiquant l'absorption cellulaire typique médiée par l'endocytose. L'absorption cellulaire médiée par les récepteurs permettra la libération progressive du médicament dans l'environnement acide. La taille nanométrique des particules a permis l'internalisation facile du système NP. Les résultats ont clairement montré que le médicament pénétrait dans les cellules cancéreuses par une voie spécifique plutôt que par la simple diffusion. L'absorption cellulaire a été en outre surveillée par FACS. Comme on le voit, une absorption remarquable de NP a été observée après 1 h d'incubation et l'absorption cellulaire a augmenté avec l'augmentation du temps d'incubation (2 h). La plus grande absorption cellulaire de NP augmentera la concentration intracellulaire de médicaments anticancéreux encapsulés, ce qui augmentera encore l'efficacité thérapeutique dans l'ESCC.

un Image au microscope confocal à balayage laser (CLSM) de cellules cancéreuses HT-29 après incubation avec FLNP pendant 2 h. Le noyau a été coloré au DAPI et la Rhodamine B a été utilisée comme sonde fluorescente. b Analyse par cytomètre de flux du FLNP lors de l'incubation à différents moments

Effet anticancéreux in vitro

L'effet cytotoxique des formulations individuelles a été étudié par dosage MTT (Fig. 5). Comme indiqué, les médicaments libres ainsi que les NP combinatoires ont présenté un effet cytotoxique dépendant de la concentration typique dans l'ESCC. Le 5-FU présentait un effet anticancéreux relativement plus élevé que celui du LY dans les cellules cancéreuses. La combinaison de 5-FU et de LY a entraîné un effet cytotoxique plus élevé que celui des médicaments individuels. Plus important encore, le FLNP a présenté un effet anticancéreux significativement plus élevé dans les cellules cancéreuses par rapport à celui des combinaisons de cocktails libres. Les valeurs IC50 de 5-FU, LY, 5-FU + LY et FLNP étaient respectivement de 2,68 μg/ml, 5,98 μg/ml, 1,54 μg/ml et 0,58 μg/ml. Cela pourrait être attribué au fait que la LY peut inhiber l'autophagie dans les cellules cancéreuses et la rendre plus réactive au 5-FU. Il convient de noter que le FLNP était plus efficace que les combinaisons de cocktails libres en raison d'une libération plus programmée des médicaments de manière contrôlée. La libération plus rapide de LY par le FLNP entraîne une inhibition de l'autophagie qui améliore la sensibilité des cellules cancéreuses au 5-FU, entraînant une plus grande mort cellulaire [19]. Il a été rapporté qu'après avoir pénétré dans les cellules cancéreuses, le 5-FU se transformait en fluorouridine triphosphate (FUTP) via le fluorouridine monophosphate (FUMP) ou était métabolisé en fluorodésoxyuridine triphosphate (FdUTP) via deux voies différentes. Le FdUTP agit comme un substrat de la thymidylate synthase (TS) et bloque la synthèse des nucléotides. Le métabolite 5-FU se lie au site de liaison des nucléotides de la TS et inhibe la synthèse des nucléotides. Ce cycle conduit à l'épuisement de la désoxythymidine triphosphate (dTTP) qui empêchera la synthèse de l'ADN et entraînera une mort accrue des cellules cancéreuses [20, 21].

Viabilité cellulaire des cellules cancéreuses HT-29 après incubation avec du 5-FU, du LY, du 5-FU + LY et du FLNP libres, respectivement. La viabilité cellulaire a été déterminée par le test MTT

Dissertation sur l'apoptose

L'effet d'apoptose de la formulation a été évalué par la méthode de coloration à l'Annexine-V/PI (Fig. 6a, b). Cela permettra de déterminer l'effet de l'apoptose de l'individu ainsi que le système de médicaments combinés. Conformément au test MTT, le 5-FU (~ 20%) a entraîné une plus grande apoptose des cellules cancéreuses par rapport à celle de LY (~ 12%), tandis que la combinaison 5-FU + LY a induit une plus grande mort cellulaire par apoptose (~ 30%). Par rapport à tout autre groupe, le FLNP a induit une plus grande apoptose (~ 48 %) des cellules cancéreuses, ce qui suggère que l'absorption cellulaire médiée par les récepteurs a considérablement augmenté la concentration intracellulaire de médicaments anticancéreux, ce qui a entraîné un effet thérapeutique plus élevé. Une raison importante de l'effet anticancéreux plus élevé du FLNP a été principalement attribuée à la libération séquentielle de médicaments encapsulés dans lesquels le LY sensibilisera les cellules tumorales et le 5-FU induira ses puissants effets cytotoxiques. Les thérapies anticancéreuses agissent en induisant l'apoptose dans les cellules cancéreuses sans endommager les cellules normales environnantes. L'activité apoptotique appréciable du FLNP a été principalement attribuée à l'accumulation plus élevée de nanoparticules dans les cellules via l'absorption d'endocytose et la libération séquentielle de médicaments dans l'environnement intracellulaire qui a entraîné un effet thérapeutique synergique. On s'attendait à ce qu'une libération précoce de l'inhibiteur de l'autophagie (LY) perturbe le mécanisme de protection des cellules cancéreuses et que le 5-FU agisse ensuite de manière plus forte dans les cellules cancéreuses.

Résultats représentatifs de l'analyse par cytométrie en flux de l'apoptose cellulaire des cellules cancéreuses HT-29 lors de l'incubation avec du 5-FU libre, du LY, du 5-FU + LY et du FLNP, respectivement. En bas à gauche, cellules vivantes; en bas à droite, cellules apoptotiques précoces; en haut à droite, cellules apoptotiques tardives; et en haut à gauche, cellules nécrotiques

Analyse Western Blot

Le mécanisme d'action des formulations est déterminé par analyse Western blot (Fig. 7). L'expression des niveaux de protéines pro-apoptotique et anti-apoptose lors de l'exposition aux formulations respectives est présentée sur la figure 8. p53 est l'un des régulateurs importants du cycle cellulaire, et sa régulation négative est associée à une survie accrue des cellules cancéreuses. On peut voir que les formulations ont considérablement diminué les niveaux d'expression de p53, indiquant l'effet remarquable sur les cellules ESCC. Il a été rapporté que les dommages à l'ADN entraînent l'activation de la cascade des caspases, ce qui entraîne le clivage de PARP-1, considéré comme une caractéristique de l'apoptose cellulaire [22, 23]. Nos résultats ont clairement montré que le 5-FU et le LY augmentaient individuellement l'expression de la caspase-3 et de PARP, tandis que comme prévu, le FLNP induisait une expression remarquable de ces marqueurs protéiques indiquant l'effet anticancéreux supérieur. De manière cohérente, le FLNP a considérablement diminué l'expression de la protéine anti-apoptotique (Bcl-2), indiquant son efficacité pour améliorer l'efficacité thérapeutique dans l'ESCC.

Analyse par transfert Western de cellules cancéreuses HT-29 lors d'une incubation avec du 5-FU, du LY, du 5-FU + LY et du FLNP libres, respectivement. L'analyse Western blot de la caspase-3 clivée, PARP, Bcl-2 et p53 a été déterminée

Etude d'efficacité antitumorale in vivo sur modèle animal. Les formulations sans 5-FU, LY, 5-FU + LY et FLNP, respectivement, ont été administrées à des souris tumorales, et l'efficacité a été étudiée pendant 20 jours

Analyse de l'inhibition de la croissance tumorale in vivo

Les souris ont reçu une injection de formulations respectives chez des souris, et le volume tumoral a été noté jusqu'à 20 jours. Comme on le voit (Fig. 8), le groupe témoin a montré une augmentation constante du volume tumoral à chaque instant jusqu'au jour 18. Par rapport au groupe témoin, les médicaments libres ont contrôlé la croissance de la tumeur ; cependant, ce n'était pas satisfaisant. Le mélange cocktail de deux médicaments était relativement plus efficace que les médicaments individuels pour contrôler le volume tumoral. Il est important de noter que le FLNP a montré de manière significative (p < 0,05 ; p <0,0001) une efficacité antitumorale supérieure à celle de tout autre groupe. Le volume tumoral final était d'environ   500 mm ³ par rapport à ~ 1400 mm ³ pour les souris non traitées. L'effet antitumoral significativement plus élevé dans le modèle tumoral a été attribué à la taille nanométrique des particules qui pourraient s'accumuler dans les tissus tumoraux en raison de l'effet de perméation et de rétention amélioré. La libération contrôlée de médicaments dans les tissus tumoraux a également contribué à sa plus grande efficacité [24].

Conclusions

En conclusion, le nanoliposome PEGylé chargé de 5-fluorouracile (5-FU) et de LY294002 (LY) a été préparé avec succès pour cibler le carcinome épidermoïde de l'œsophage (ESCC). Le FLNP a montré une absorption cellulaire médiée par les récepteurs qui permettra la libération progressive du médicament dans l'environnement acide. La combinaison de 5-FU et de LY a entraîné un effet cytotoxique plus élevé que celui des médicaments individuels. Plus important encore, le FLNP a présenté un effet anticancéreux significativement plus élevé dans les cellules cancéreuses par rapport à celui des combinaisons de cocktails libres. La libération plus rapide de LY du FLNP conduit à une inhibition de l'autophagie qui améliore la sensibilité des cellules cancéreuses au 5-FU, entraînant une plus grande mort cellulaire. De manière cohérente, le FLNP a induit une plus grande apoptose (~ 48 %) des cellules cancéreuses par rapport à celle de tout autre groupe. L'analyse par transfert Western a clairement montré que le 5-FU et le LY augmentaient individuellement l'expression de la caspase-3 et de PARP, tandis que, comme prévu, FLNP induisait une expression remarquable de ces marqueurs protéiques indiquant l'effet anticancéreux supérieur. Nous pensons que la libération programmée d'un inhibiteur de l'autophagie et d'un médicament chimiothérapeutique à partir d'un seul nanosupport augmentera les perspectives de thérapie anticancéreuse dans l'ESCC. A broader study on different squamous cell carcinoma and development of the orthotropic model and patient-derived xenograft (PDX) model will be the subject of future investigation.

Abréviations

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Enhanced permeation and retention effect

ESCC:

Esophageal squamous cell carcinoma

FLNP:

5-FU and LY-loaded lipid nanoparticles