Optimisation de liposomes d'acide glycyrrhétinique par lyophilisation solution monophase : préformulation, conception et évaluation in vitro

Résumé

Dans cette étude, des liposomes d'acide glycyrrhétinique (AG) ont été formulés avec succès en utilisant la méthode de lyophilisation solution monophase. Le travail de préformulation a examiné la solubilité de la phosphatidylcholine de soja (PCS), du cholestérol et de l'AG dans des co-solvants alcool tert-butylique/eau (TBA/eau). Nous avons étudié comment le pourcentage en volume de TBA influence le taux de sublimation, et caractérisé l'AG lyophilisé par DSC, DRX et FTIR. La DRX indiquait un état amorphe pour l'AG, tandis que le FTIR confirmait qu'aucun changement chimique n'avait eu lieu. Les tests de solubilité ont révélé une augmentation marquée de la solubilité aqueuse de l'AG. En utilisant un plan de Box-Behnken et une sélection de lyoprotecteur, nous avons identifié la formulation optimale — 508 mg PCS, 151 mg cholestérol, 55 % TBA, et un rapport poids tréhalose/PCS de 4:1. Sous ces conditions, les liposomes reconstitués présentaient une efficacité d'encapsulation de 74,87 % et un diamètre moyen de 191 nm. Les études de libération in vitro ont montré une libération soutenue dans deux milieux, et les essais d'absorption cellulaire ont démontré une absorption temps-dépendante par les cellules Hep G2.

Contexte

L'acide glycyrrhétinique (AG), un saponine triterpène extrait des racines de Glycyrrhiza, présente une activité antimicrobienne, antivirale et anticancéreuse et est cliniquement utilisé pour l'hépatite chronique et le cancer du foie. Selon le Système de Classification Biopharmaceutique, l'AG est un médicament de classe II ; sa faible polarité, son hydrophobicité élevée et sa faible solubilité limitent la biodisponibilité orale et peuvent causer une rétention sodium-dépendante et une perte de potassium, conduisant à l'hypertension. Améliorer l'absorption et maintenir des concentrations thérapeutiques par une formulation ciblée est donc essentiel.

Les liposomes sont largement reconnus pour leur biocompatibilité, leur capacité à cibler les ganglions lymphatiques et les sites tumoraux via l'effet de perméabilité et de rétention accrue, et leur polyvalence pour transporter à la fois des médicaments hydrophobes et hydrophiles. Cependant, les suspensions de liposomes aqueuses conventionnelles sont instables, sujettes aux fuites, à la fusion et à l'hydrolyse des phospholipides, ce qui entrave le stockage à long terme. Les proliposomes — poudres fluides sèches qui se reforment en liposomes lors de l'hydratation — offrent une solution. La production traditionnelle de proliposomes par séchage par pulvérisation ou lyophilisation a des inconvénients : le séchage par pulvérisation peut endommager les médicaments thermosensibles, et la lyophilisation est chronophage et coûteuse en raison de l'élimination prolongée de l'eau.

Une innovation récente, la méthode de lyophilisation solution monophase, dissout les lipides, le médicament et un lyoprotecteur hydrosoluble dans un co-solvant alcool tert-butylique/eau, puis la lyophilisation produit une poudre sèche qui forme spontanément des liposomes lors de l'ajout d'eau. Les avantages incluent une sublimation rapide, un traitement en une étape adapté à la production à grande échelle, un faible risque de solvant résiduel (le TBA est de classe 3), une sortie de poudre stérile et une compatibilité avec des médicaments peu solubles dans l'eau ou instables.

Malgré ces avantages, des lacunes de connaissances persistent : l'impact de la concentration TBA/eau sur le taux de sublimation, les changements d'état solide du médicament après lyophilisation et le processus d'assemblage par hydratation de la poudre. Cette étude utilise l'AG comme modèle pour répondre à ces questions, optimisant les variables de formulation et de processus via un plan de Box-Behnken, évaluant les effets du lyoprotecteur et évaluant la libération in vitro et l'absorption cellulaire.

Méthodes / Expérimental

Matériaux

L'acide glycyrrhétinique (≥ 98 % pureté) provenait de Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. La phosphatidylcholine de soja (Lipoid S100) et le cholestérol étaient obtenus de Lipoid GmbH et J&K Scientific Ltd., respectivement. Le FITC-PEG-DSPE (PM 2000) provenait de Shanghai Ponsure Biotech, Inc. L'alcool tert-butylique (≥ 98 %) et tous les autres réactifs étaient achetés chez Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. L'eau déionisée était produite par un système Milli-Q.

Études de solubilité

Des solutions saturées d'AG, PCS et cholestérol ont été préparées dans des mélanges TBA/eau à des températures allant de 25 °C à 45 °C. La solubilité de l'AG a été quantifiée par HPLC utilisant une colonne C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm) et une phase mobile méthanol/eau (90:10 v/v) à 1,0 ml min⁻¹, détectant à 250 nm. La solubilité du PCS et du cholestérol a été estimée via une méthode turbidimétrique, surveillant l'absorbance à 655 nm.

Préparation de la solution monophase lyophilisée

L'AG, le PCS et le cholestérol ont été dissous dans le TBA à 45 °C ; un lyoprotecteur sélectionné (mannitol, lactose, saccharose ou tréhalose) a été dissous dans l'eau à 45 °C. Les deux solutions ont été mélangées pour obtenir une solution monophase isotrope (60 ml). Après filtration (0,22 µm), des aliquotes de 2,0 ml ont été placées dans des flacons de lyophilisation de 10 ml, pré-congelées à -40 °C pendant 12 h, et lyophilisées à -50 °C pendant 24 h (pression de chambre 1-20 Pa).

Taille des particules et efficacité d'encapsulation

Les liposomes reconstitués ont été préparés en dispersant 5 mg de poudre de proliposome dans 5 ml d'eau purifiée, vortexant pendant 1 min, répétant après 15 min. La taille a été mesurée par diffusion dynamique de la lumière (Nano ZS90, Malvern). L'efficacité d'encapsulation (EE) a été déterminée par ultrafiltration-centrifugation : 1 ml de dispersion a été filtré à travers un filtre de 50 kDa PMCO, le filtrat quantifié par HPLC, et EE calculé via EE = (1 - W_libre/W_total) × 100 %.

Taux de sublimation et pression de vapeur

Des mélanges TBA/eau de pourcentages en volume de TBA variables (10-90 %) ont été pré-congelés et lyophilisées ; le temps jusqu'à sublimation complète a été enregistré pour calculer le taux (µl min⁻¹). La pression de vapeur a été mesurée à l'aide d'un ébulliomètre statique et de l'équation d'Antoine.

Caractérisation physicochimique

Le DSC (HSC-1, 25-350 °C, 10 °C min⁻¹, atmosphère N₂) a évalué les transitions thermiques. La DRX (D8 Focus, Cu-Kα, 5°-60°, 5° min⁻¹) a évalué la cristallinité. Le FTIR (Nicolet 6700, 4000-400 cm⁻¹, résolution 4 cm⁻¹) a vérifié l'intégrité chimique.

Stabilité

Les poudres de proliposomes ont été stockées à 25 °C, sous azote, dans l'obscurité. Après 6 mois, l'EE et la taille des particules des liposomes reconstitués ont été réévaluées.

Libération in vitro

La libération a été étudiée par dialyse (PMCO 8000-14000 Da) dans du PBS (pH 7,4) ou du salin à 0,1 % Tween 80 à 37 °C, sous agitation à 300 tr/min. Des échantillons ont été prélevés jusqu'à 12 h, remplacés par du milieu frais, et l'AG quantifié par HPLC.

Absorption cellulaire

Des liposomes d'AG marqués FITC ont été incubés avec des cellules HepG2 (1 × 10⁴ cellules mL⁻¹) pendant 0,5, 1, 2 et 4 h. Après lavage et quenching au bleu de trypan, les cellules ont été lysées avec du Triton X-100. La fluorescence (excitation 495 nm, émission 520 nm) a été mesurée et normalisée au contenu protéique (dosage BCA).

Résultats et discussion

Solubilité et sublimation

La solubilité de l'AG dans le TBA/eau augmentait progressivement avec le pourcentage en volume de TBA et la température ; la solubilité dépassait 0,5 mg mL⁻¹ lorsque TBA > 40 %. Le PCS et le cholestérol nécessitaient des volumes de TBA décroissants à mesure que la température augmentait au-dessus de 35 °C, confirmant l'effet de dissolution favorable du TBA.

Le taux de sublimation augmentait de 4 µl min⁻¹ à 10 % TBA à plus de 10 µl min⁻¹ au-dessus de 60 % TBA, attribué à une pression de vapeur saturée plus élevée et à des cristaux de glace en forme d'aiguille plus fins observés en microscopie optique.

Changements physicochimiques post-lyophilisation

Le DSC a montré un décalage du pic de fusion de l'AG vers des températures plus basses à mesure que la teneur en TBA diminuait, tandis que la DRX a confirmé la perte complète des pics cristallins, indiquant un état amorphe. Les spectres FTIR sont restés inchangés, prouvant la stabilité chimique. L'amorphisation a amélioré la solubilité aqueuse de 6,36 µg mL⁻¹ (brut) à 19-64 µg mL⁻¹ selon le rapport TBA.

Criblage à facteur unique

Les PCS (480 mg), cholestérol (120 mg) et TBA (50 %) optimaux ont été identifiés sur la base du score combiné le plus élevé d'EE et de diamètre moyen.

Optimisation par Box-Behnken

En utilisant le PCS, le cholestérol et le TBA comme variables indépendantes, le modèle a prédit des conditions optimales : 508 mg PCS, 151 mg cholestérol, 55 % TBA, donnant EE = 68,55 % et diamètre moyen = 220 nm. Les graphiques d'interaction ont confirmé des effets synergiques.

Sélection du lyoprotecteur

La tréhalose a surpassé le lactose, le saccharose et le mannitol. Un rapport tréhalose/PCS de 4:1 a maximisé l'EE (74,87 %) et minimisé la taille des particules (191 nm), avec une protection supérieure pendant les cycles gel-dégel.

Microscopie électronique à transmission

Les images ont montré une hydratation initiale avec des fragments d'AG et de lipides dispersés, évoluant en liposomes sphériques uniformes de ~200 nm avec une enveloppe bicouche et du médicament piégé.

Stabilité

Après 6 mois à 25 °C, l'EE restait à 72,82 % et le diamètre à 198 nm, indiquant une stabilité physique robuste.

Libération in vitro

Les deux milieux PBS et salin ont exhibé une libération soutenue : 65,25 % et 69,46 % d'AG libérés en 12 h, avec une phase initiale rapide suivie d'un plateau, confirmant le comportement de libération soutenue.

Absorption cellulaire

L'absorption par HepG2 a augmenté de 1 480 ng mL⁻¹ protéine à 30 min à 2 030 ng mL⁻¹ à 240 min, la microscopie à fluorescence corroborant l'internalisation temps-dépendante.

Conclusions

Ce travail démontre que la méthode de lyophilisation solution monophase, couplée à un plan de Box-Behnken et au lyoprotecteur tréhalose, produit des liposomes chargés en AG avec une haute efficacité d'encapsulation (74,87 %), une petite taille de particule (191 nm) et une libération soutenue sur 12 h. La méthode donne une poudre sèche stable adaptée à la production à grande échelle et offre une plateforme prometteuse pour l'administration de thérapeutiques hydrophobes.

Abréviations

BBD

Plan de Box-Behnken

DSC

Calorimétrie différentielle à balayage

EE

Efficacité d'encapsulation

FTIR

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

AG

Acide glycyrrhétinique

DM

Diamètre moyen

PCS

Phosphatidylcholine de soja

TBA

Alcool tert-butylique

MET

Microscopie électronique à transmission

DRX

Diffraction des rayons X