Préparation et étude pharmacocinétique des liposomes à longue circulation de Daidzein

Contexte

La daidzéine est un composé naturel que l'on trouve exclusivement dans le soja et d'autres légumineuses et appartient structurellement à une classe de composés appelés isoflavones. L'activité pharmacologique de la daidzéine a été rapportée dans la prévention et le traitement des maladies cardiovasculaires [1], le soulagement de la ménopause [2], l'ostéoporose [3], la réduction du risque de certains cancers hormonaux [4] et un effet anti-inflammatoire [ 5]. En raison de sa structure chimique, la daidzéine a une très faible solubilité dans l'eau et dans les lipides et a été principalement absorbée dans le tractus intestinal après administration orale et facile à métaboliser en formant un conjugué d'acide glucuronique ou un conjugué d'acide sulfurique [6,7,8,9,10]. Afin d'améliorer sa faible biodisponibilité, des études récentes se sont concentrées sur son nouveau système d'administration de médicaments, tels que le complexe de phospholipides de daidzéine [11], la micelle auto-assemblée de daidzéine [12] et la nanoparticule d'acide polylactique [13].

Le liposome est un système de support de médicament efficace, qui peut encapsuler des médicaments hydrophobes, des médicaments hydrophiles et des médicaments qui interagissent avec les phospholipides [14, 15]. En raison de leur très bonne biocompatibilité, les liposomes peuvent augmenter la perméabilité intestinale, réduire la dégradation chimique et biologique et réduire les effets secondaires non spécifiques des médicaments [16]. Cependant, l'utilisation de liposomes conventionnels ne peut pas totalement surmonter leur liaison avec les composants sériques et leur absorption par le système des phagocytes mononucléaires (MPS) [17]. Pour surmonter de tels problèmes, des liposomes à longue circulation, modifiés avec un hydrophile ou un glycolipide tel que le (polyéthylène glycol) (PEG) ou le mono-sialoganglioside (GM1), ont été développés au cours des dernières années. Il a été démontré que la présence de PEG à la surface du support liposomal à longue circulation forme une couche de film protecteur hydrophile, qui peut empêcher le liposome d'interagir avec une variété de composants du sérum et d'être consommé par la reconnaissance des phagocytes [18]. Par conséquent, les liposomes à longue circulation peuvent prolonger le temps de circulation sanguine en réduisant l'absorption de MPS et ainsi améliorer la biodisponibilité des médicaments [19, 20]. Dans cet article, la méthode de préparation du liposome à longue circulation de daidzéine (DLCL), ainsi que sa libération in vitro et ses caractéristiques pharmacocinétiques chez le rat, ont été étudiées. Les résultats fournissent une base expérimentale pour l'application clinique du DLCL.

Méthodes

Matériaux

La phosphatidylcholine de soja (SPC) a été achetée auprès de Lipoid GmbH (Allemagne). Le cholestérol et le DSPE-mPEG2000 ont été achetés chez AVT Pharmaceutical Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Le méthanol et l'acétonitrile de qualité HPLC ont été achetés auprès de TEDIA Company (USA). Le chloroforme et le méthanol (qualité analytique) ont été obtenus auprès de Sinopharm Chemistry Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Chine). L'eau a été purifiée par le système de purification d'eau Milli-Q® ((Millipore, USA). Daidzein (≥  98 % de pureté) a été acheté auprès de Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Apigenin (standard interne, IS, 98 % de pureté) a été acheté auprès de Delge Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Nanjing, Chine). L'hydrate d'acide phosphotungstique (qualité analytique) a été acheté auprès de Macklin Co., Ltd. (Shanghai, Chine). l'acétate a été obtenu auprès de Sigma (Missouri, États-Unis). L'acide formique (qualité MS) a été acheté auprès de Fischer (États-Unis).

Animaux

Dix rats mâles Sprague-Dawley (200-210 g) ont été achetés au centre de prévention et de contrôle des maladies de la province du Hubei avec le numéro de licence SCXK (E) 2017-0012. L'expérimentation animale a été approuvée par le comité d'éthique de l'Université du Hubei et était conforme au guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Préparation de Daidzein Long-Circulating Nanoliposome (DLCL)

En prenant la taille des particules et l'efficacité d'encapsulation (EE) comme indices d'évaluation, la conception orthogonale de quatre facteurs et trois niveaux (tableau 3) a été réalisée pour optimiser la meilleure correspondance du rapport molaire du SPC au cholestérol (A), le rapport de masse du médicament (daidzein) au lipide total (SPC et cholestérol) (w/w) (B), température d'hydratation (C) et temps ultrasonique (D) à la condition de 5% de teneur en DSPE-mPEG2000 [21, 22] .

Le DLCL a été préparé par une méthode d'évaporation-sonication en film mince décrite brièvement comme suit [21] :la phosphatidylcholine de soja, le cholestérol, le DSPE-mPEG2000 et la daidzéine ont été dissous dans un ballon à fond rond avec 10 mL de chloroforme-méthanol (1 : 4, v/ v) mélange. Dans des conditions de vide et de 40°C (bain-marie), le mélange a été séché pour former un film mince dans l'appareil d'évaporation rotatif (RE-2000A, Shanghai Yi-Rong Biochemical Instrument Factory, Chine), puis hydraté avec 20 mL eau ultra pure par sonication (80 w) pendant 24 min dans un bain de glace. La suspension liposomale a été extrudée trois fois en filtrant tour à tour sur membrane microporeuse de 0,45 µm et 0,22 µm. La solution de DLCL préparée a été conservée à 4°C. La conservation à long terme nécessite l'ajout de 3% de saccharose (utilisé comme lyoprotecteur) à la suspension DLCL et la conservation par lyophilisation à − 20 °C.

Détermination de Daidzein en DLCL par HPLC

La colonne était une colonne analytique Phenomenex ODS (150 mm x 4,6 mm, 5 μm) connectée à une colonne de garde (30 mm x 10 mm, 3 μm) avec une température de colonne de 40 °C. La phase mobile consistait en une solution aqueuse d'acétate d'ammonium 10 mM (A) et du méthanol (B) avec le gradient d'élution comme suit :0 à 3,0 min, 45 % de B à 80 % de B ; 3,0 à 4,0 min, 80 % de B ; 4,0 à 6,0 min, 80 % de B à 45 % de B. Le débit était de 1 mL/min. La longueur d'onde de détection était de 240  nm. Le volume d'injection était de 10 μL. La plage linéaire de la daiazéine était de 0,313 à 50  μg/mL et l'équation de régression était y = 35 461x + 1802,4, R ² = 0.9999. Le temps de rétention de la daidzéine est de 4,30 min, et aucune interférence de la formulation DLCL n'a été trouvée sur la détermination de la daidzéine (Fig. 1). La précision, la reproductibilité, la stabilité et la récupération des échantillons de la méthode d'analyse ont été strictement étudiées et ont répondu aux exigences de l'analyse quantitative (tableau 1).

Chromatogrammes typiques de liposomes vierges (a ), substance de référence daidzein (b ) et l'exemple DLCL (c )

Dépistage des prescriptions par test orthogonal

En prenant la taille des particules et l'efficacité d'encapsulation (EE) comme indices d'évaluation, la conception orthogonale de quatre facteurs et trois niveaux a été réalisée pour optimiser la meilleure correspondance entre le rapport molaire du SPC au cholestérol (A), le rapport de masse du médicament (daidzein) aux lipides totaux (SPC et cholestérol) (w/w) (B), à la température d'hydratation (C) et au temps ultrasonore (D) à la condition de 5% de teneur en DSPE-mPEG2000 [21, 22].

Diamètre et morphologie du DLCL

La taille des particules et le potentiel zêta de la solution de DLCL préparée ont été mesurés par un granulomètre laser (Zetasizer Nano90, Malven Instruments Limited, Worcestershire, Royaume-Uni) à température ambiante, 230 V et 50 HZ. La solution de DLCL préparée a été diluée 10 fois avec de l'eau pure puis reprise du bord de la maille de cuivre avec une pince à épiler. Après séchage à température ambiante et contre-coloration par une solution aqueuse d'acide phosphotungstique (2%, w/v), la morphologie du DLCL complètement séché a été observée à l'aide d'un microscope électronique à transmission à émission de champ (JEM-2100 (HR), JEOL Ltd. , Tokyo, Japon) à l'accélération 200 kV et émetteur LaB6.

EE et chargement de drogue de DLCL

L'EE et la charge médicamenteuse du DLCL préparé ont été analysés par la méthode de dialyse indiquée comme suit :(1) 500  μL de la solution de DLCL préparée ont été ajoutés dans un sac de dialyse avec un seuil de poids moléculaire de 8 000 à 14 000 (BioSharp Sai-Guo Biotechnology Co., LTD), puis attachez fermement les deux extrémités du sac de dialyse et placez le sac de dialyse dans 20  mL d'eau (milieu de dialyse). Après avoir vibré avec un agitateur pendant 12 h, 1 mL du milieu de dialyse a été prélevé et centrifugé à 12000 rpm pendant 10 min pour déterminer la concentration de médicament libre (C ₁ ) dans le surnageant. (2) Cinq cents microlitres de la solution DLCL préparée et 2000 μL de méthanol ont été mélangés par vortex pendant 15 min pour détruire les liposomes, puis centrifugés à 12000 rpm pendant 10 min pour déterminer la concentration totale du médicament (C ₀ ) dans le surnageant. (3) Dix millilitres de la solution DLCL préparée (V ₀ ) a été lyophilisée pour peser la masse de poudre solide (W ₀ ). (4) L'EE et la charge médicamenteuse ont été calculées selon la formule indiquée comme suit :

Libération de médicament in vitro

La libération in vitro de DLCL et de daidzéine libre a été déterminée par la méthode de dialyse. Le liquide gastrique simulé était 0,1 µmol/L de HCl (pH 1,2) contenant 0,5 % de Tween-80, et le liquide intestinal simulé était du tampon PBS 25 µM (pH 6,9) contenant 0,5 % de Tween-80. 0,5  mL de la solution de DLCL préparée a été ajouté dans un sac de dialyse avec une interception de poids moléculaire de 8000 à 14 000 et placé dans 20  mL des deux milieux de libération, respectivement. Les milieux de test de libération ont été agités (100 tr/min) en continu à 37 °C. Aux moments indiqués (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120 et 144 h), des aliquotes de l'échantillon (1 mL ) ont été prélevés du dialysat puis complétés par la même quantité de milieu de libération frais. Un milligramme par millilitre de daidzéine (dissoute dans du DMSO) a été utilisé comme témoin et placé respectivement dans les deux milieux de libération ci-dessus pour le même traitement. Daidzein a été mesuré à chaque point dans le temps, et le taux de libération cumulé a été calculé selon la formule :

Dans la formule, V ₁ était la quantité d'échantillonnage à chaque instant, V ₂ était le volume du milieu de dialyse, C ₁ ~C _i était la concentration de daidzéine mesurée à chaque instant, et V ₀ et C ₀ étaient le volume et la concentration de DLCL ajoutés à la poche de dialyse.

Pharmacocinétique du DLCL chez le rat

Dix rats mâles Sprague-Dawley ont été répartis au hasard en deux groupes (n = 5). Un groupe était le groupe daidzéine (suspendu dans 0,5% de carboxyméthylcellulose sodique) et un autre groupe était le groupe DLCL (dissous dans l'eau). Les doses de daidzéine dans les deux groupes étaient de 30 mg/kg. Avant l'administration orale, les rats ont été à jeun pendant 12 h et libres de boire de l'eau. Après que les rats aient été administrés par voie intragastrique, le groupe daidzéine a reçu 0,5 mL de sang du plexus veineux du fond de chaque rat à 3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 1,5 h, 2 h , 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h et 36 h, respectivement. Pendant ce temps, le groupe DLCL a été prélevé 0,5 mL de sang de chaque rat de la même manière à 1 min, 3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 1,5 h, 2 h, 3 h , 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h et 36 h, respectivement. L'échantillon de sang a été placé dans un tube à centrifuger hépariné et centrifugé à 4000 rpm pendant 10 min, et le plasma a été conservé à - 80 °C. La teneur en daidzéine dans l'échantillon de plasma a été déterminée par la méthode établie LC-MS/MS pour obtenir sa courbe médicament-temps chez les rats testés. Les paramètres pharmacocinétiques ont été calculés avec un modèle sans compartiment en utilisant le logiciel DAS3.0 (Membre professionnel de la Chinese Pharmacology Society, Shanghai, Chine).

Détermination de la Daidazein dans le plasma de rat par LC-MS/MS

Les échantillons de plasma de rat ont été prétraités comme suit :plasma de rat (50 μL), méthanol (10 μL), étalon interne (IS) apigénine dissous dans du méthanol (10 μL, 500 ng/mL) et solution aqueuse d'acide formique à 5 % (100 μL ) ont été mélangés dans un tube à essai propre de 1,5 ml. Après brièvement le mélange au vortex, 1,2 mL d'acétate d'éthyle a été ajouté au mélange. Après agitation à température ambiante pendant 5 min, le mélange a été centrifugé à 12 000 rpm pendant 10 min. La phase organique supérieure résultante (1 µmL) a été transférée dans un autre tube à essai propre de 1,5 mL, évaporée et redissoute dans la phase mobile (100 µL). Le surnageant obtenu par centrifugation à 12 000 rpm pendant 10 min a été collecté pour une analyse LC-MS/MS. Les conditions quantitatives des échantillons de plasma de rat sont décrites ci-dessous :GL Inertsustain C18 (100 mm × 2,1 mm, 3 μm) a été connecté à une colonne de garde Shim-pack Column Holder (5,0 mm × 2,0 mm, 1,6 μm) à une température de colonne de 40 °C ; l'élution en gradient avec le débit de 0,2 mL/min a été réalisée en utilisant la phase mobile constituée d'eau (A)-méthanol (B) dans les conditions de 50% B à 80% B (0-2,00 min), 80% B (2,00-4,00 min), 80 % B à 50 % B (4,00-6,00 min) et 50 % B (6,10-8,00 min). Le volume d'injection était de 10 μL. Le mode de surveillance multi-réaction des ions négatifs (MRM) a été utilisé pour détecter les paires d'ions de daidzein (m /z 253.0 → 224.15) et IS (m /z 269.00 → 117.05). Les autres conditions étaient énoncées comme suit :source d'ions ESI, température du bloc chauffant 400 °C, température de chauffage du tube DL 250 °C, gaz d'atomisation (N ₂ ) débit volumique 3.0 L/min, gaz de séchage (N ₂ ) débit volumique de 15,0  L/min et tension de pulvérisation ionique de − 4,5 V. Les temps de rétention de la daidzéine et de l'étalon interne (apigénine) étaient respectivement de 4,5 min et 5,4  min, et les substances endogènes dans le plasma n'ont pas interféré avec la détermination de la daidzéine et étalon interne (Fig. 2). La méthodologie quantitative a été strictement étudiée et a répondu aux exigences de l'analyse quantitative des échantillons biologiques (tableau 2).

HPLC de plasma blanc (a ), daidzéine + apigénine (étalons internes) + plasma blanc (b ) et échantillon de plasma (c ). 1, daidzéine; 2, apigénine (IS)

Analyse statistique

Les données sont présentées sous forme de moyenne  ± écart type (SD). Des comparaisons statistiques ont été faites à l'aide d'une analyse de variance à un facteur (ANOVA), suivie du test de Tukey. Les valeurs ont été considérées comme statistiquement significatives à p <  0,05.

Résultats et discussion

Effet des processus de préparation sur les caractéristiques des nanoliposomes

La conception du test orthogonal et les résultats du test sont présentés dans le tableau 3, et les résultats de l'analyse de la variance sont présentés dans le tableau 4. L'analyse intuitive (tableau 3) a montré que l'ordre d'influence de quatre facteurs sur la taille des particules était le rapport médicament-lipide > SPC- taux de cholestérol > température d'hydratation > temps des ultrasons, qui a eu peu d'effet sur l'efficacité d'encapsulation. L'analyse de la variance (tableau 4) a montré le rapport médicament-lipide ; Le rapport SPC-cholestérol a un effet significatif sur la taille des particules. Les conditions optimales de préparation pour le DLCL étaient A₁ B₁ C₂ D₁ , le rapport SPC/cholestérol était de 55:40, le rapport médicament/lipide était de 1:10, la température d'hydratation était de 50 °C et la durée des ultrasons était de 24 min.

Trois lots de DLCL ont été préparés en parallèle selon le procédé optimisé ci-dessus. L'EE était de 85,3 ± 3,6 % et la charge médicamenteuse était de 8,2 ± 1,4 %. La taille moyenne des particules était de 156,1 ± 3,0 nm avec le PDI de 0,294 ± 0,012 et le potentiel zêta de - 49 ± 0,6 mV. La distribution granulométrique du DLCL a été montrée sur la figure 3, qui indiquait que dans les conditions optimisées du processus de préparation, le DLCL préparé avait une distribution granulométrique étroite et uniforme. La forme et la structure des particules DLCL observées par MET étaient rondes ou elliptiques, et la taille était fondamentalement uniforme (Fig. 4).

Distribution granulométrique du DLCL

Photographie TEM de DLCL

La daidzéine est un médicament typique aux propriétés hydrophiles et lipophiles médiocres. La combinaison directionnelle du médicament à l'extrémité polaire du phospholipide peut les rendre tous les deux dans un état hautement dispersé. Les caractéristiques cristallines du médicament sont inhibées et la solubilité des lipides a été augmentée [11]. Il a été rapporté que dans l'interaction entre la daidzéine et la bicouche lipidique, environ 15 % de la daidzéine est localisée dans la région hydrophile de la membrane des liposomes [23, 24] et le reste est distribué à l'interface eau/membrane [25]. D'après les résultats du MET, la double structure du DLCL était évidente et l'insertion de daidzéine n'affectait pas la double structure des lipides.

Effet des processus de préparation sur la libération in vitro du médicament

Les résultats des expériences de libération in vitro ont été présentés sur la figure 5. Dans le milieu de libération du liquide gastrique simulé (0,1 mol/L HCL contenant 0,5 % de Tween-80), le taux de libération cumulé de daidzéine était d'environ 85 % à 1 h. et libération complète à 12 h; DLCL a libéré 18% à 1 h, 60% à 12 h et 100% à 48 h. Dans le milieu de libération de liquide intestinal simulé (tampon PBS 25  mM contenant 0,5 % de Tween-80, pH 6,9), le taux de libération cumulé de la daidzéine était d'environ 73 % à 1 h, 84 % à 12  h et libération complète à 24  h; DLCL a libéré 3% à 1 h, 59% à 12 h et 100% à 48 h.

Libération in vitro de DLCL et de daidzéine libre dans une solution de chlorhydrate (pH 1,2) contenant 0,5 % de Tween 80 (a ) et du tampon phosphate (pH 6,9) contenant 0,5% de Tween 80 (b ) (moyenne ± SD, n = 3)

Les résultats de l'expérience de libération in vitro ont montré que le DLCL était significativement à libération lente dans les milieux de dialyse avec un pH 1,2 et pH 6,9, et le taux de libération dans les milieux de dialyse avec un pH   1,2 était plus rapide que celui des milieux de dialyse avec un pH   6,9. Cela peut être dû au fait que les structures bicouches lipidiques sont vulnérables dans des conditions acides et ont une faible stabilité.

Effet des procédés de préparation sur la pharmacocinétique in vivo

Les courbes de concentration plasmatique moyenne en fonction du temps de la daidzéine après administration orale d'une dose unique de daidzéine et de DLCL ont été présentées dans la figure 6, et les principaux paramètres pharmacocinétiques non compartimentaux de la daidzéine dans les deux groupes ont été présentés dans le tableau 5. Les résultats ont montré que sous l'iso-dose de daidazéine (30 mg/kg) dans les deux groupes, la concentration plasmatique de daidzéine dans le groupe DLCL était toujours plus élevée que celle dans le groupe daidzéine. L'AUC_0−t (l'aire sous la courbe de concentration plasmatique du médicament en fonction du temps, qui représente l'absorption totale après une dose unique et reflète le degré d'absorption du médicament) de la daidzéine dans le groupe DLCL était de 1515,52 ± 532,40 μg/L*h, soit 2,5 fois celle de le groupe daidzein (p <  0,05). De plus, le MRT_0−t (temps de séjour moyen, qui est le temps nécessaire à l'élimination de 63,2 % du médicament dans l'organisme) et t _1/2 (la demi-vie d'élimination, qui est le temps nécessaire pour réduire de moitié la concentration plasmatique du médicament de la phase terminale) de la daidzéine dans le groupe DLCL ont été respectivement prolongées de 1,6 fois et 1,8 fois que celle du groupe daidzéine (p <  0,05). Les résultats pharmacocinétiques ont indiqué que le DLCL pouvait non seulement réduire l'effet de premier passage de la daidzéine pour favoriser son absorption orale, mais aussi prolonger son temps de résidence moyen pour obtenir l'effet de libération lente.

Courbes moyennes de concentration plasmatique-temps de DLCL et de daidzéine libre après administration orale d'une dose unique de daidzéine (30 mg/kg) (moyenne ± SD, n = 5)