Nanomicelles d'acide stéarique-g-chitosan oligosaccharide chargées d'émodine : conception, caractérisation et activité antitumorale

Résumé

Le but de cette étude était de préparer et caractériser l'émodine-chargée acide stéarique-g-chitosan oligosaccharide (CSO-SA/EMO) et d'évaluer son activité antitumorale in vitro. Dans cette étude, l'acide stéarique-g-chitosan oligosaccharide a été utilisé comme vecteur et ses propriétés physico-chimiques ont été déterminées par différentes méthodes. Le comportement d'absorption cellulaire a été examiné en utilisant l'acide stéarique-g-chitosan oligosaccharide marqué FITC. CSO-SA/EMO a été préparé par ultrasons et dialyse. La taille de particule, le potentiel de surface, l'efficacité d'encapsulation et le comportement de libération du médicament ont été étudiés in vitro. Les effets de CSO-SA/EMO sur les cellules de cancer gastrique ont été investigués en utilisant l'essai MTT et la cytométrie de flux. Les résultats ont montré que la taille de particule de CSO-SA/EMO était plus grande et le potentiel plus petit que celui de l'acide stéarique-g-chitosan oligosaccharide. L'absorption micellaire de 12 h par les cellules MGC803 et BGC823 était suffisante, et les micelles étaient capables de s'accumuler abondamment aux sites lésionnels chez les souris, réalisant ainsi un bon ciblage passif EPR. Les essais MTT et d'arrêt du cycle cellulaire ont montré que CSO-SA/EMO améliorait significativement l'activité antitumorale vers les cellules MGC803 et BGC823 comparé à l'émodine libre. Le volume tumoral, la coloration hématoxyline-éosine et l'essai de marquage dUTP nick-end par transférase terminale désoxyribonucléotidique ont prouvé que CSO-SA/EMO avait un effet antitumoral significatif sur les tissus tumoraux in vivo. En conclusion, la méthode ultrasons-dialyse a fourni une méthode simple et efficace pour préparer CSO-SA/EMO. La délivrance d'émodine utilisant un système micellaire a amélioré efficacement ses effets antitumoraux.

Introduction

L'émodine (EMO) est un dérivé d'anthraquinone naturel extrait principalement d'herbes chinoises traditionnelles telles que le rhubarbe, le cuspidatum et le multiflorum. La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est largement utilisée dans la recherche clinique en raison de sa faible toxicité, ses rares effets secondaires et son faible coût [1].

Des études ont montré que l'EMO a une large activité pharmacologique, incluant immunosuppression, anti-coqueluche, anti-hypertenseur, anti-inflammatoire, antibactérien et activités anticancéreuses. L'EMO a été trouvé pour inhiber la croissance des cellules cancéreuses [2,3,4] et réguler les gènes liés pour contrôler l'apoptose des cellules tumorales, la tumorigénèse, la prolifération cellulaire, l'invasion et la métastase [5,6,7,8,9]. Des études ont montré que l'EMO peut inhiber diverses cellules cancéreuses, telles que les cellules d'adénocarcinome colorectal humain, les cellules d'hépatocarcinome, les cellules de leucémie lymphoïde [10], et le cancer de la langue humain SCC-4 [11]. L'EMO peut inhiber la prolifération des cellules tumorales dans les cancers gastrique, sein et prostate [7, 12]. Cependant, l'EMO n'exhibe pas d'effets cytotoxiques sur les cellules normales telles que les fibroblastes gingivaux humains normaux [13], les cellules épithéliales bronchiques humaines [14], et les cellules mammaires humaines [15]. Cela montre que l'EMO exhibe une cytotoxicité sélective vers les cellules tumorales comparé aux cellules normales.

Le chitosane, un polysaccharide naturel, est la forme déacétylée de la chitine. Ce polymère naturel a une excellente solubilité dans l'eau, bio-fonctionnalité, compatibilité sanguine et caractéristiques de dégradabilité microbienne, et est connu pour ses diverses applications biomédicales. Nous avons dégradé le chitosane à haut poids moléculaire (450 kDa) en utilisant la chitosanase sous conditions acides pour obtenir le chitosane oligosaccharide à bas poids moléculaire (CSO, 18 kDa). Le CSO peut fortement pénétrer les membranes cellulaires [16] et l'acide stéarique (SA) peut entrer dans le noyau par la voie des glycoprotéines. Le CSO a été modifié hydrophobiquement avec SA en utilisant le carbodiimide (EDC) comme réactif de couplage pour synthétiser l'acide stéarique-g-chitosan oligosaccharide amphipathique (CSO-SA).

Bien que l'EMO ait une activité biologique extensive, sa structure d'anthraquinone est peu soluble dans l'eau. Comme les médicaments thérapeutiques sont transportés à travers la circulation sanguine, leur solubilité affecte directement leur absorption et distribution. Les greffes CSO-SA peuvent s'auto-assembler en solution aqueuse pour former des nanomicelles qui sont hydrophobes à l'intérieur et hydrophiles à l'extérieur. Nous avons dispersé les nanomicelles de l'état rassemblé en utilisant une sonde à ultrasons. Comme l'EMO et le CSO étaient tous deux hydrophobes, l'EMO a été encapsulé au centre des micelles.

Plusieurs médicaments modèles sont appliqués au CSO-SA, ce qui nécessite le poids moléculaire, la structure et l'hydrophobicité des médicaments modèles. Les études existantes incluent la curcumine [17], la doxorubicine [18], le stéarate de lamivudine [19], et l'oxaliplatine [20] qui peuvent améliorer les effets antitumoraux significativement. Nous avons exploré les conditions optimales de chargement de CSO-SA/EMO. CSO-SA/EMO crée de nouvelles formes posologiques avec une solubilité et une efficacité d'utilisation plus élevées. CSO-SA/EMO peut fournir des idées pour la sélection de médicaments modèles ou vecteurs, et l'application clinique des micelles.

Matériels et méthodes expérimentaux

Matériaux expérimentaux

Des souris mâles nu BALB/C+ ont été obtenues du Centre d'Animaux Expérimentaux de l'Université de Zhejiang. Les lignées de cellules de cancer gastrique à faible différenciation MGC803 et BGC823 ont été achetées auprès de la banque de cellules ATCC. Le milieu de culture RPMI-1640 et FBS ont été obtenus auprès de la société Hangzhou Holly Leaf Biotechnology. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, acide trinitrobenzène sulfonique, et pyrène ont été fournis par Sigma Aldrich. L'Université de Zhejiang a fourni CSO-SA. Les autres réactifs achetés étaient de grade AR.

Détermination de la CMC et spectres ¹H RMN de CSO-SA

Dans ce rapport, la concentration micellaire critique (CMC) de CSO-SA a été déterminée par spectrophotométrie de fluorescence en utilisant le pyrène comme sonde fluorescente. Diverses concentrations de solution CSO-SA ont été ajoutées à une solution de pyrène dans l'acétone après quoi l'acétone a été évaporée pendant la nuit. Les spectres d'émission et valeurs de pic du pyrène dans les solutions CSO-SA de différentes concentrations ont été analysés par spectrophotométrie de fluorescence. Le premier pic (I₁ = 374 nm) et le troisième pic (I₃ = 385 nm) du spectre ont été enregistrés. Nous avons tracé la concentration logarithmique (Log C) en abscisse et I₁/I₃ en ordonnée et calculé la CMC pour les micelles polymères.

CSO et CSO-SA ont été dissous dans D₂O à une concentration de 10 mg/ml. Les spectres ¹H RMN ont été enregistrés, comparés et analysés pour les pics caractéristiques de CSO et CSO-SA.

Degré de substitution des amines détecté

Le degré de substitution des amines (SD%) a été détecté en utilisant la méthode de l'acide trinitrobenzène sulfurique (TNBS).

Différentes concentrations de solutions CSO et CSO-SA ont été préparées après quoi 4 % NaHCO₃ et 0,1 % TNBS ont été ajoutés successivement. Après incubation à 37 °C pendant 2 h dans un bain-marie, 2 mol/L d'acide chlorhydrique a été ajouté. L'absorbance a été mesurée à 344 nm par spectrophotométrie ultraviolet-visible après 30 min d'ultrasonication. Une courbe standard a été tracée et le SD% de l'échantillon CSO-SA a été calculé.

Taille de particule et potentiel CSO-SA

Une solution CSO-SA à 1,0 mg/ml a été préparée et les micelles ont été dispersées complètement avec une sonde de disrupteur cellulaire ultrasonique. La taille de particule et le potentiel de CSO-SA ont été déterminés avec un analyseur de taille de particule et potentiel de surface.

Absorption cellulaire de CSO-SA

Les solutions FITC et CSO-SA ont été mélangées, agitées pendant la nuit, et transférées dans un sac de dialyse. Le FITC non réagi et l'éthanol absolu ont été éliminés par dialyse avec de l'eau déionisée pendant 24 h. Finalement, une solution CSO-SA marquée FITC (FITC-CSO-SA) avec une concentration de 1,0 mg/mL a été obtenue.

Les cellules MGC803 et BGC823 ont été utilisées comme cellules cibles pour examiner l'absorption cellulaire de CSO-SA. Basé sur le taux de prolifération cellulaire, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et cultivées pendant la nuit jusqu'à ce qu'elles deviennent complètement adhérentes. 80 μL de solution FITC-CSO-SA ont alors été ajoutés à un point de temps défini. Les cellules ont été incubées avec 10 μL de Hoechst 33342 (1 mg/mL) pendant 15 min pour colorer le noyau cellulaire. L'absorption de CSO-SA par FITC-CSO-SA a été détectée par microscopie confocale à balayage laser.

Distribution in vivo de CSO-SA

La distribution de CSO-SA in vivo a été déterminée par coloration au colorant fluorescent DiR. La solution CSO-SA/DiR a été préparée par dialyse.

Des souris mâles nu de six semaines ont été utilisées comme modèle expérimental. Les souris nu ont été inoculées sous-cutanément avec 1 × 10⁸/mL cellules MGC803. CSO-SA/DiR a été administré via la veine caudale à un volume de cellules tumorales d'environ 200 mm³. Les souris ont ensuite été anesthésiées à des points de temps définis. La distribution temporelle de CSO-SA/DiR in vivo a été enregistrée en utilisant un imageur de petit animal vivant (gamme de longueur d'onde, 580-700 nm, temps d'exposition 1000 ms).

Détection de la concentration d'EMO par HPLC

La concentration d'EMO a été déterminée par HPLC. L'EMO a été appliqué sur une colonne Eclipse XDB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) avec une colonne de protection (4,6 × 10 mm, 5 μm). La température de la colonne était réglée à 30 °C, le débit à 1,0 mL/min, la longueur d'onde de détection à 254 nm, et le volume d'injection à 20 μL. La phase mobile était méthanol/0,1 % acide phosphorique (85:15, v/v). La concentration d'EMO a été tracée en abscisse et la surface de pic en ordonnée. Les courbes standard d'EMO ont été tracées pour déterminer la gamme linéaire optimale. Tous les échantillons injectés HPLC ont été filtrés à travers un filtre organique de 0,45 μm pour protéger la colonne.

Préparation de CSO-SA/EMO

Dans cette étude, l'EMO a été encapsulé avec une sonde ultrasonique. Un ratio de formulation initial de 10 % (EMO: CSO-SA, p/p) a été utilisé comme point de départ. La solution d'EMO a été lentement ajoutée de manière goutte-à-goutte à la solution micellaire dans un bain de glace. La sonde ultrasonique a alors été appliquée pendant 20 cycles (400 W, travail 2 s, arrêt 3 s).

Les micelles chargées en médicament ont été transférées dans un sac de dialyse (MWCO, 3,5 kDa) et dialysées contre de l'eau déionisée pendant 24 h pour éliminer l'éthanol du solvant. Le CSO-SA/EMO pur a été obtenu par centrifugation du dialysat pour éliminer l'EMO libre.

Propriétés de CSO-SA/EMO (Diamètre particule, potentiel, MET, EE%)

La taille de particule et le potentiel de surface de CSO-SA/EMO ont été mesurés avec un analyseur de taille de particule et potentiel de surface.

Une solution CSO-SA/EMO à 0,1 mg/ml a été ajoutée goutte à goutte sur un film de carbone recouvrant un fil de cuivre, colorée avec 2 % d'acide phosphotungstique et séchée. La morphologie et la taille de particule de CSO-SA/EMO ont été observées par microscopie électronique à transmission.

L'efficacité d'encapsulation (EE%) et le chargement de médicament (DL%) de CSO-SA/EMO ont été détectés par extraction au solvant organique et HPLC. À un échantillon de 200 μL de solution micellaire CSO-SA/EMO, 1,8 mL de méthanol a été ajouté pour disperser les micelles et extraire le médicament. La concentration d'EMO a été mesurée comme C_EMO. Un autre 400 μL de solution micellaire CSO-SA/EMO a été placé dans un tube de centrifugeuse d'ultrafiltration et centrifugé (12 000 tr/min, 5 min) pour obtenir le surnageant. Le EE% et DL% ont été calculés selon les formules suivantes :

$$ \mathrm{EE}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V/{M}_{\mathrm{EMO}}\times 100\% $$ $$ \mathrm{DL}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times \mathrm{V}/\left[\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times V+{M}_{\mathrm{CSO}-\mathrm{SA}}\right]\times 100\% $$

où C_EMO est la concentration d'EMO dans les micelles, C est la concentration d'EMO des micelles chargées en médicament après centrifugation d'ultrafiltration, V est le volume de micelle chargée en médicament soumis à la dialyse, M_EMO est la quantité d'EMO administrée pendant le chargement du médicament, M_CSO-SA est la masse de CSO-SA.

Évaluation de la libération du médicament In Vitro

La libération du médicament à partir de CSO-SA/EMO a été investiguée en utilisant PBS (pH 7,2) comme milieu de libération. Un millilitre de solution micellaire chargée en médicament a été placé dans un sac de dialyse de 3,5 kDa scellé aux deux extrémités puis placé dans un tube contenant le milieu de libération approprié. Le sac de dialyse a été placé dans un agitateurs thermostaté horizontal à 37 °C. Des échantillons ont été prélevés à des points de temps définis et remplacés par le même volume de milieu de libération frais. Le contenu d'EMO dans les échantillons a été déterminé par HPLC et la quantité cumulative d'EMO libérée a été calculée.

Cytotoxicité de CSO-SA/EMO

Les taux de survie des cellules de cancer gastrique traitées avec CSO-SA/EMO, CSO-SA et EMO ont été détectés par essai MTT. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une concentration d'environ 10⁵/ml. CSO-SA/EMO, CSO-SA et EMO ont été ajoutés à différentes concentrations. Après incubation pendant différentes périodes de temps, 20 μL de solution de travail MTT a été ajouté. Après 4 h d'incubation, 200 μL de DMSO a été ajouté et la densité optique (DO) de la solution à 570 nm a été mesurée par lecteur de microplaques.

Effet de CSO-SA/EMO sur le cycle cellulaire

Les cellules des deux lignées cellulaires ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits à une densité de 10⁵/mL. Après 12 h de culture, CSO-SA, CSO-SA/EMO et EMO ont été ajoutés et incubés pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été digérées, collectées et lavées. 500 μL de solution de coloration PI a alors été ajouté à chaque échantillon cellulaire, le culot cellulaire a été lentement resuspendu, et les cellules ont été incubées dans l'obscurité à 37 °C pendant 30 min. La fluorescence rouge a été détectée par cytomètre de flux à une longueur d'onde d'excitation de 488 nm. Le contenu d'ADN a été analysé par le logiciel FlowJo.

Effets antitumoraux de CSO-SA/EMO évalués par analyses in vivo et histologiques

Les expériences animales ont été effectuées selon les directives du Comité de Soins et d'Utilisation des Animaux, Université de Zhejiang. Les cellules MGC803 (1 × 10⁶) ont été injectées sous-cutanément dans le flanc antérieur droit de souris mâles nu âgées de 5 à 6 semaines. Les tumeurs ont été laissées croître jusqu'à un diamètre d'environ 5 mm. À ce moment, les souris ont été aléatoirement divisées en un groupe contrôle, un groupe injection EMO et un groupe injection CSO-SA/EMO, avec 3 animaux dans chaque groupe. Toutes les souris ont été injectées par voie intraveineuse avec les réactifs pertinents via la veine caudale une fois par jour pendant 2 semaines. Un pied à coulisse électronique Vernier a été utilisé pour mesurer les diamètres long (a) et court (b) de la tumeur (b). Le volume tumoral a été calculé selon la formule V = a × b²/2. Le poids corporel de chaque souris a été enregistré après quoi les tumeurs ont été collectées pour analyse histologique. Le taux d'inhibition tumoral a été déterminé dans les tissus tumoraux suivant la coloration hématoxyline-éosine (HE). Le marquage dUTP nick-end par transférase terminale désoxyribonucléotidique (TUNEL) a été effectué pour détecter l'apoptose cellulaire dans le tissu iléal terminal en utilisant un kit de détection de mort cellulaire in situ selon les instructions du fabricant.

Résultats et discussion

CMC et spectres ¹H RMN de CSO-SA

Les polymères amphiphiles s'auto-assemblaient en micelles dans un milieu hydrophile. Une CMC plus faible résultait en une plus grande formation de micelles. Cela était bénéfique pour le maintien de la structure des micelles après administration intraveineuse. Lorsque CSO-SA formait des micelles, la sonde fluorescente pyrène pouvait facilement entrer dans le noyau hydrophobe des micelles augmentant l'intensité de fluorescence du pyrène chargé ce qui augmentait l'intensité du spectre d'émission. À ce point, I₃ augmentait significativement plus vite que I₁, ainsi, le rapport d'intensité de fluorescence I₁/I₃ diminuait abruptement. Un point de rupture significatif pouvait être observé dans le graphique I₁/I₃ et valeurs Log C (Fig. 1). Les calculs de point d'inflexion montraient que la CMC était de 179,02 μg/mL. Plus la CMC est petite, plus la capacité à former des micelles est forte et plus la résistance à la dilution est forte ce qui améliore la protection de la structure micellaire suivant l'administration intraveineuse.

Nanomicelles d acide stéarique-g-chitosan oligosaccharide chargées d émodine : conception, caractérisation et activité antitumorale

L'EDC a été utilisé comme agent de couplage croisé pour réagir avec le groupe carboxyle de SA et former le dérivé intermédiaire actif -OO-acyl isourée. Ceci peut réagir avec le groupe amine primaire de CSO pour former une liaison amide. La structure de CSO-SA a été déterminée et confirmée basée sur le spectre de résonance magnétique nucléaire protonique. ¹H RMN (400 MHz, D₂O) δ 1,06 (m, CH2), 1,02 (m, CH3) correspondent au proton méthylène et proton méthyle de SA respectivement.

Degrés de substitution du groupe amino

Le SD% de CSO-SA est le pourcentage de groupes amino substitués par l'acide stéarique sur le chitosane. TNBS a réagi avec les groupes amino libres sur le chitosane et a formé des dérivés trinitrobenzène avec une absorption UV à 344 nm. La courbe standard du dérivé trinitrobenzène du chitosane a été déterminée par absorption UV à 344 nm. Le SD% de CSO-SA a été calculé à 9,3 ± 8 %. Cela a confirmé que CSO et SA avaient été liés avec succès basé sur leur ratio de greffe.

Taille de particule et potentiel CSO-SA, CSO-SA/EMO

Le Tableau 1 montre que la moyenne Z de CSO-SA était de 139,3 ± 2,2 nm. PDI était de 0,179 ± 0,03 indiquant une dispersion relativement uniforme. Comparé à CSO-SA, la moyenne Z et PDI de CSO-SA/EMO ont augmenté. Après chargement d'EMO, la charge positive de surface de CSO-SA/EMO était plus élevée que celle de CSO-SA.

Absorption cellulaire

Le FITC n'affectait pas les propriétés physico-chimiques de CSO-SA. Nous avons obtenu FITC-CSO-SA en greffant la fluorescéine FITC dans CSO-SA. Après que les cellules ont été colorées avec Hoechst 33342, l'absorption des cellules FITC-CSO-SA a été observée en utilisant la microscopie confocale à balayage laser. Nous avons trouvé que l'absorption de MGC803 augmentait graduellement avec l'augmentation du temps et la fluorescence FITC augmentait graduellement. L'absorption micellaire de BGC823 était similaire à MGC803 de manière temps-dépendante. FITC-CSO-SA avait une bonne capacité de pénétration cellulaire et était distribuée uniformément dans le cytoplasme des cellules de cancer gastrique (Fig. 2).

Distribution de CSO-SA In Vivo

La technologie d'imagerie proche infrarouge (NIR) est avantageuse pour pénétrer les biomatériaux et tissus. Après injection de CSO-SA/DiR dans la veine caudale de souris nu, la distribution de CSO-SA/DiR a été observée et enregistrée à différents moments en utilisant un imageur de corps vivant de petit animal. Comme montré dans la Fig. 3, la distribution de CSO-SA/DiR était similaire aux autres micelles à 4 h suivant l'injection veineuse caudale et était principalement distribuée dans le foie, la rate et les tissus tumoraux. La distribution des nanomicelles dans la tumeur augmentait graduellement en intensité avec l'augmentation du temps. Cela indiquait que le greffon CSO-SA avait une bonne capacité de ciblage passif principalement due à l'effet EPR des nanomicelles (Fig. 3).

Préparation de CSO-SA/EMO

Influence de différents environnements pH sur le chargement du médicament

Nous avons préparé une solution CSO-SA et ajusté le pH de CSO-SA pour investiguer l'effet du pH sur le chargement du médicament. Comme montré dans la Fig. 4, CSO-SA avait une bonne capacité de chargement de médicament et exhibait une tendance parabolique dans la gamme pH 6,4-6,8. Le niveau le plus élevé de chargement de médicament a été vu à pH 6,6 faisant de cette valeur le pH optimal pour le chargement du médicament (Fig. 4).

Efficacité d'encapsulation, MET et chargement de médicament

CSO-SA s'auto-assemble en nanocomposites micelles coquille-noyau. Les moieties hydrophobes forment spontanément des structures de noyau hydrophobe pour repousser les milieux hydrophiles. Cette structure fournit un véhicule clé pour le chargement de médicament car l'EMO peut facilement être encapsulé dans le noyau hydrophobe en raison de sa structure hydrophobe. Nous avons investigué l'effet de CSO-SA sur la capacité de chargement de l'EMO en variant le dosage d'EMO. Comme montré dans la Fig. 5, avec l'augmentation du dosage d'EMO, la quantité de chargement de médicament augmente. Le taux de chargement de CSO-SA a atteint jusqu'à 21,16 % lorsque le ratio était de 30 % (Fig. 5).

CSO-SA/EMO a été grossi 30 000 fois avec un microscope électronique à transmission. La forme et la taille des nanomicelles ont été observées et enregistrées.

Libération d'EMO depuis CSO-SA/EMO

La solution micellaire chargée en médicament a été ajoutée à un sac de dialyse de 3,5 kDa avec PBS (pH 7,2) étant utilisé comme milieu de libération. Chaque fois qu'un échantillon était retiré, il était remplacé par le même volume de milieu de libération frais.

La concentration d'EMO à différents points de temps a été déterminée par HPLC, après quoi le pourcentage de libération cumulative a été calculé. Comme montré dans la Fig. 6, CSO-SA/EMO exhibait un effet de libération soutenue significatif comparé à l'EMO libre. Ces résultats montrent que le pourcentage de libération de l'EMO libre était de 38,4 % à 0,5 h tandis que le pourcentage de libération de l'EMO depuis CSO-SA/EMO était d'environ 6,6 %. À 4 h, le pourcentage de libération de l'EMO libre était de 83,7 % et le pourcentage de libération de CSO-SA/EMO était d'environ 32,5 %. Dans les 72 h, la libération de l'EMO libre atteignait 97,2 % tandis que la libération de l'EMO depuis CSO-SA/EMO était de 78,4 %. L'EMO a été libérée des micelles chargées en médicament CSO-SA/EMO de deux manières principales : par dissociation de l'EMO du noyau micellaire et par pénétration du noyau de la micelle dans le milieu de libération.

Toxicité de CSO-SA/EMO sur les cellules de cancer gastrique

L'essai MTT est une méthode standard pour détecter la viabilité cellulaire. La cytotoxicité de l'EMO libre, CSO-SA et CSO-SA/EMO sur les cellules de cancer gastrique MGC803 et BGC823 a été mesurée en utilisant l'essai MTT. Il a montré que l'EMO et CSO-SA/EMO pouvaient inhiber les cellules MGC803 et BGC823 de manière dose- et temps-dépendante. Cependant, à la même concentration, CSO-SA/EMO avait un effet inhibiteur plus élevé sur les cellules MGC803 et BGC823 comparé à la solution d'EMO libre. Les valeurs IC₅₀ (Tableau 2) de l'EMO et CSO-SA/EMO pour les cellules de cancer gastrique ont été calculées. L'IC₅₀ de CSO-SA/EMO était significativement plus bas que celui de l'EMO à chaque point de temps (24 h, 48 h, 72 h). Les valeurs IC₅₀ de CSO-SA montraient que CSO-SA était un vecteur biologique sûr avec peu de toxicité biologique ce qui confirmait que la cytotoxicité de CSO-SA/EMO était causée par l'EMO (Fig. 7).

Le Tableau 2 et la Fig. 7 montraient que la cytotoxicité du système de délivrance de médicament CSO-SA/EMO était significativement plus élevée que celle de l'EMO libre. Cependant, lorsque la libération de CSO-SA/EMO et de l'EMO libre dans un environnement in vivo était simulée, la libération de l'EMO libre atteignait 38,4 % à 0,5 h tandis que la libération de CSO-SA/EMO n'était que de 6,6 %. Globalement, la concentration de l'EMO libre était plus élevée que celle de CSO-SA/EMO à chaque point de temps.

Ce phénomène s'explique facilement. Bien que CSO-SA/EMO libère l'EMO relativement lentement, l'effet antitumoral de CSO-SA/EMO ne ralentit ni ne décline. De nombreuses études ont montré que les systèmes de délivrance de nanodrogues peuvent améliorer l'activité antitumorale des médicaments de chimiothérapie [21].

Premièrement, bien que l'EMO libre exhibe une rafale initiale d'activité, l'EMO ne peut pas être efficacement absorbé par les cellules alors que CSO-SA accélère grandement l'absorption cellulaire par endocytose ou phagocytose.

Deuxièmement, lorsque CSO-SA/EMO se rapproche des membranes cellulaires, l'interaction entre nanoparticules et membranes cellulaires peut affecter la structure et les propriétés des nanomicelles ainsi que la fonction de macromolécules biologiques telles que les canaux ioniques. Par conséquent, l'attachement de CSO-SA/EMO aux membranes cellulaires ne résulte pas en une simple adsorption physique mais peut changer l'équilibre dynamique de la cellule et favoriser davantage la cytotoxicité de CSO-SA/EMO.

Finalement, l'EMO libre a une structure d'anthraquinone hydrophobe résultant en une distribution pauvre dans le sang. Le système de délivrance de médicament CSO-SA/EMO augmente la solubilité de l'EMO et améliore la dissolution menant à une concentration moléculaire plus élevée dans les cellules environnantes.

Détection de l'arrêt du cycle cellulaire par FCM

L'analyse du cycle cellulaire est un aspect important du traitement clinique des tumeurs malignes. L'application de médicaments spécifiques au cycle aux cellules tumorales pendant les périodes sensibles aux médicaments a montré une grande efficacité. Bien que les analogues du bromure d'éthidium ne puissent pas pénétrer les cellules normales, ils peuvent colorer les noyaux cellulaires en pénétrant les membranes cellulaires endommagées. L'ADN double brin embarqué PI produit une fluorescence rouge et l'intensité de fluorescence est proportionnelle au niveau d'ADN double brin. Le contenu d'ADN a été déterminé par cytométrie de flux (FCM) après coloration de l'ADN avec PI. La distribution du cycle cellulaire et l'apoptose ont été analysées basées sur la distribution du contenu d'ADN.

Des études ont montré que l'EMO affecte la distribution du cycle cellulaire [11, 22]. L'analyse FCM a montré que CSO-SA/EMO et l'EMO pouvaient bloquer les cellules MGC803 et BGC823 en phase G2/M du cycle cellulaire.

Les cellules MGC803 ont été exposées à la même concentration (20 μM) de CSO-SA, EMO libre et solution CSO-SA/EMO pendant 24 h. Le pourcentage de cellules MGC803 en phase G2/M a été trouvé à 8,95 %, 15,29 % et 23,12 % respectivement. Le pourcentage du groupe contrôle était de 6,47 %. Les pourcentages de cellules BGC823 en G2/M traitées avec 20 μM CSO-SA, EMO libre ou CSO-SA/EMO sous les mêmes conditions étaient de 14,25 %, 16,79 % et 35,71 % respectivement, valeurs plus élevées que dans le groupe contrôle (13,66 %). Ces données montraient que CSO-SA/EMO bloquait la phase G2/M des cellules MGC803 et BGC823 plus efficacement et significativement que l'EMO libre à la même concentration. Le CSO-SA ne montrait pas de différence par rapport aux contrôles (Fig. 8).

Effet antitumoral de CSO-SA/EMO In Vivo

Pour étudier davantage l'effet antitumoral de CSO-SA/EMO, le taux d'inhibition tumoral et les niveaux d'apoptose cellulaire ont été évalués in vivo. Les résultats ont montré que tanto CSO-SA/EMO que EMO avaient un effet inhibiteur notable sur la croissance tumorale (Fig. 9a). Le taux d'inhibition tumoral du groupe CSO-SA/EMO était trois fois celui du groupe EMO (Fig. 9d). Le poids des souris dans chaque groupe n'a pas changé significativement (Fig. 9b). Cela montrait que tanto CSO-SA/EMO que EMO étaient relativement sûrs. Les altérations morphologiques et l'apoptose dans les tissus tumoraux de chaque groupe montraient que CSO-SA/EMO avait des effets antitumoraux significatifs (Fig. 9e, f).

Conclusions

Dans cette étude, nous avons détecté la structure, CMC, SD%, taille de particule et potentiel de CSO-SA avec différentes méthodes. Les résultats prouvent que le CSO-SA amphiphile performe bien comme vecteur. L'intensité de fluorescence des cellules de cancer gastrique a montré que CSO-SA avait été absorbé rapidement dans les 12 h. Des souris nu ont été utilisées comme modèle pour étudier la distribution de CSO-SA dans les 72 h. Au fil du temps, la distribution de CSO-SA dans la lésion est devenue plus concentrée exhibant un bon effet de ciblage passif.

CSO-SA/EMO a été préparé avec la méthode ultrasons-dialyse. CSO-SA avait une forte capacité de chargement de médicament. Lorsque le pH de l'environnement était réglé à 6,6, le niveau de chargement de médicament atteignait 21,6 % à un ratio de formulation de 30 %. Comparé à CSO-SA, CSO-SA/EMO avait une taille de particule plus grande et un potentiel zêta. La forme de CSO-SA/EMO pouvait être enregistrée directement en utilisant MET. La libération de l'EMO depuis CSO-SA/EMO était de 78,4 % dans les 72 h, indiquant un processus lisse et continu dans le corps. En considérant l'effet antitumoral de CSO-SA/EMO comparé à l'EMO libre, nous l'avons confirmé avec diverses expériences.

La toxicité de CSO-SA sur les cellules de cancer gastrique a été détectée par essai MTT. Les résultats ont montré que CSO-SA était un vecteur biologique sûr. Comparé à l'EMO libre, CSO-SA/EMO a significativement amélioré l'activité antitumorale contre les cellules de cancer gastrique. Le cycle cellulaire de MGC803 et BGC823 pouvait être arrêté en phase G2/M plus efficacement par CSO-SA/EMO. Le volume tumoral, la coloration HE et l'essai TUNEL ont prouvé un effet antitumoral plus significatif de CSO-SA/EMO que l'EMO libre.

Basé sur les résultats ci-dessus, CSO-SA est à la fois un vecteur biocompatible et sûr. CSO-SA/EMO dans cette étude utilise une formulation posologique nouvelle et efficace pour le traitement du cancer et exhibe un bon effet de ciblage passif in vivo.