Nanoparticules Gd₂O₃ fonctionnalisées par acide hyaluronique : amélioration de l'IRM-guided radiothérapie des tumeurs

Résumé

La localisation imprécise et la radiorésistance intrinsèque des tumeurs solides entravent sérieusement la mise en œuvre clinique de la radiothérapie. Dans cette étude, nous avons fabriqué des nanoparticules d'oxyde de gadolinium fonctionnalisées par l'acide hyaluronique (HA-Gd₂O₃ NPs) via un processus hydrothermal one-pot pour une imagerie par résonance magnétique (IRM) efficace et une radiosensibilisation des tumeurs. Grâce à la fonctionnalisation HA, les NPs HA-Gd₂O₃ préparées, d'un diamètre de 105 nm, ont montré une dispersibilité favorable dans l'eau, une faible cytotoxicité, une excellente biocompatibilité et sont entrées facilement dans le cytoplasme des cellules cancéreuses par endocytose médiée par récepteur HA. Important, les NPs HA-Gd₂O₃ ont exhibé une relaxivité longitudinale (r₁) élevée de 6,0 mM⁻¹S⁻¹ comme agents de contraste IRM et une amélioration de radiosensibilisation de manière dose-dépendante. Ces résultats démontrent que les NPs HA-Gd₂O₃ synthétisées comme agents théranostiques bifonctionnels ont un grand potentiel dans le diagnostic et la radiothérapie des tumeurs.

Introduction

La radiothérapie a été largement appliquée dans le cancer, impliquant des rayons X à haute énergie et le dépôt de doses d'irradiation aux sites tumoraux en causant des dommages par radicaux libres ou dommages à l'ADN [1,2,3,4]. Cependant, la faible radiosensibilité, l'imprécision de la localisation tumorale et la mauvaise discrimination entre lésions et tissus normaux causant des effets secondaires d'irradiation limitent la mise en œuvre clinique de la radiothérapie [5]. Par conséquent, il est important de développer des méthodes pour améliorer la radiosensibilité tumorale tout en minimisant les effets secondaires systémiques. Une combinaison de nanotechnologie et radiothérapie est une priorité bien établie pour la radiosensibilisation.

Ces dernières années, la nanotechnologie a été considérée comme une stratégie attrayante pour le diagnostic et la thérapie du cancer [6,7,8,9,10,11]. L'une des fonctions principales des nanoparticules (NPs) est un ciblage tumoral précis basé sur l'accumulation sélective des NPs dans les tissus tumoraux via ciblage passif, l'effet de perméabilité et rétention accrue (EPR), ciblage actif et temps de circulation prolongé [12,13,14]. Notre travail précédent a démontré que le dopage de NPs de carbone avec des hétéroatomes module efficacement leurs propriétés intrinsèques et introduit des caractéristiques bénéfiques [15,16,17]. Intéressant, les NPs peuvent être utilisées comme radiosensibilisateurs [18]. Les NPs de métaux lourds (avec éléments à haut Z) (ex., Au, Bi, Gd) comme radiosensibilisateurs prometteurs peuvent être utilisés en thérapie radiosensibilisante en raison de leur section efficace de capture de photons X élevée et de l'effet de diffusion Compton [19]. Lorsque les rayons X interagissent avec des nanoparticules à haut Z, les électrons Auger et photoélectrons, la libération d'électrons secondaires blessent les cellules cancéreuses, fournissant une augmentation de dose pendant la radiothérapie [20]. À ce jour, les NPs à base de gadolinium (GdNPs) sont montrées comme agents de contraste (AC) IRM efficaces [21, 22] et différentient le tissu normal du tissu malade et des lésions de manière non invasive et en temps réel. Ces agents raccourcissent le temps de relaxation longitudinale pour affecter la relaxivité longitudinale r₁ [23], et leur ciblage imprécis résulte fréquemment en effets secondaires. Il est bien connu que l'acide hyaluronique (HA) est un ligand majeur et un vecteur de délivrance de médicaments vers des sites avec récepteurs HA tels que le déterminant de cluster 44 (CD44) [24,25,26].

Basés sur les résultats d'études précédentes, nous avons utilisé HA comme ligand de ciblage pour fonctionnaliser les NPs Gd₂O₃ avec des fonctions doubles : AC IRM de ciblage tumoral efficace et radiosensibilisateurs pour surmonter la radiorésistance inhérente et l'imprécision de la localisation tumorale. En outre, les NPs HA-Gd₂O₃ affichent une relaxivité longitudinale (r₁) élevée comme agents d'imagerie IRM prometteurs avec une meilleure qualité d'imagerie IRM. Comparés aux AC actuellement disponibles [27, 28], les NPs HA-Gd₂O₃ résultantes montrent trois avantages significatifs : premièrement, les NPs HA-Gd₂O₃ exhibent une biocompatibilité favorable due à l'utilisation de la matrice extracellulaire naturelle comme précurseurs. Deuxièmement, la fonctionnalisation HA améliore significativement le ciblage tumoral et réduit les effets secondaires. Finalement, les NPs HA-Gd₂O₃ possèdent une capacité bifonctionnelle en diagnostic et thérapie. Afin de vérifier l'efficacité et d'explorer le mécanisme d'amélioration de la radiosensibilisation, nous avons évalué l'effet radiosensibilisant des NPs HA-Gd₂O₃ sur la viabilité des cellules tumorales, le cycle cellulaire et l'apoptose.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation des NPs HA-Gd₂O₃

Dans cette étude, les NPs HA-Gd₂O₃ ont été préparées avec succès en utilisant un processus hydrothermal simple comme montré dans le Schéma 1. Les tailles de particules ont été analysées par diffusion dynamique de lumière, tandis que l'examen morphologique a été conduit par microscopie électronique à transmission. Comme montré dans la Fig. 1a, les NPs HA-Gd₂O₃ exhibent une dispersion uniforme et des formes quasi-sphériques discrètes sans agrégation apparente. Les diamètres moyens des NPs HA-Gd₂O₃ étaient de 105 nm. Comparé aux tissus normaux, la perméabilité endothéliale capillaire des tissus tumoraux était augmentée et l'espace endothélial était de 100–600 nm [29]. Par conséquent, les NPs de tailles désirables étaient facilement immergées dans les tissus tumoraux, et elles peuvent dramatiquement augmenter l'efficacité de la délivrance passive de médicaments.

La structure de phase des NPs HA-Gd₂O₃ a été investiguée par DRX en utilisant la poudre d'oxyde de graphène (GO) comme témoin. Comme montré dans la Fig. 1d, un pic de diffraction principal (2θ = 12,04°) et deux pics mineurs (2θ = 29,6°, 42,1°) ont été observés dans le motif de diffraction des NPs HA-Gd₂O₃, qui correspondaient aux pics caractéristiques du GO (plan 100) et du graphite (plan 002), respectivement. L'espacement de réseau principal des NPs HA-Gd₂O₃ montrait un espacement plus petit (0,73 nm calculé par la formule de Bragg) que l'espacement GO de d₀₀₁ = 0,85 nm, où le décalage vers le haut de la position du pic peut être attribué à la diminution de l'espacement entre les couches sp³. Tous les pics de diffraction larges démontrèrent que les NPs HA-Gd₂O₃ avaient une structure amorphe, ce qui peut être attribué au carbone hautement désordonné et à la diminution de l'espacement de couches sp² (C–C) pendant le processus de carbonisation. Le résultat indiqua davantage que les NPs HA-Gd₂O₃ avec une nature cristalline pauvre possédaient une structure multi-couches hétérogène, ce qui était cohérent avec nos rapports précédents concernant les points de carbone [30, 31].

Structure chimique et composition de surface des NPs HA-Gd₂O₃

Les groupes fonctionnels de surface et la composition des NPs HA-Gd₂O₃ ont été investigués en utilisant la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier et la spectroscopie photoélectronique aux rayons X. Comme montré dans la Fig. 2a, le spectre XPS montrait quatre pics typiques à 284,0, 400,0, 530,6 et 1188,5 eV, indiquant que les NPs HA-Gd₂O₃ étaient principalement composées de gadolinium, carbone, oxygène et hydrogène. Le spectre haute résolution de Gd_3d (Fig. 2b) révélait la présence de deux pics forts à 1187,5 eV et 1221 eV, correspondant à un dédoublement spin-orbite de 32 eV, correspondant respectivement aux niveaux d'énergie 3d_5/2 et 3d_3/2 du Gd. Ces observations étaient en bon accord avec les rapports précédents des NPs HA-Gd₂O₃. Le spectre O (1s) montré dans la Fig. 2c était dominé par un pic majeur positionné à 531,4 eV, qui correspondait à la liaison entre O²⁻ et Gd³⁺. La spectroscopie FTIR a été conduite pour les échantillons nus et NPs HA-Gd₂O₃ (Fig. 2d). Pour les échantillons nus, comme montré dans la Fig. 2a, les bandes d'absorption caractéristiques de v_as O–C–O à 1580 et 1380 cm⁻¹ révélaient la présence d'un groupe carbonate. Les pics larges à 3340 et 2900 cm⁻¹ étaient attribués aux vibrations d'étirement O–H et C–H, respectivement, qui correspondaient à l'eau adsorbée en surface. Pour les NPs HA-Gd₂O₃, les vibrations d'étirement de COO⁻ à 1580 et 1380 cm⁻¹ étaient renforcées, indiquant l'introduction du groupe carboxylique de l'acide hyaluronique. Ces résultats révélèrent que les groupes fonctionnels des NPs HA-Gd₂O₃ contenaient principalement de nombreux groupes carbonyl, carboxylate et hydroxyle. La présence de ces groupes fonctionnels localisés sur la surface dota les NPs HA-Gd₂O₃ d'une excellente dispersibilité dans l'eau. Important, l'ion Gd incorporé dans la surface des NPs peut être utile pour l'imagerie IRM et la radiosensibilisation, ce qui empêcha dramatiquement l'ion Gd de fuir dans les environnements environnants.

Biocompatibilité des NPs HA-Gd₂O₃

La biocompatibilité des NPs HA-Gd₂O₃, en tant qu'agents biomédicaux potentiels, est critique pour leur application biomédicale. Premièrement, la cytotoxicité inhérente des NPs HA-Gd₂O₃ a été évaluée dans les cellules HepG2 et VSMC en utilisant l'essai CCK-8. Comme montré dans la Fig. 3a et Fig. S1, les NPs HA-Gd₂O₃ n'exhibaient pas de cytotoxicité évidente jusqu'à 3 jours. Même à une concentration de 200 μg/mL après un temps d'exposition de 24 h, la viabilité cellulaire était d'environ 90 %. Deuxièmement, l'hémocompatibilité des NPs HA-Gd₂O₃ in vivo a été estimée en utilisant un essai d'hémolyse. Comme montré dans la Fig. 3b, nous avons observé l'hémolyse des globules rouges dans l'eau (contrôle positif). En contraste, aucune hémolyse évidente n'a été observée après incubation des NPs HA-Gd₂O₃ à différentes concentrations de 0 à 200 μg/mL pendant 2 h, ce qui était similaire aux résultats pour la solution PBS (contrôle négatif). Comparé au contrôle négatif, le pourcentage d'hémolyse à différentes concentrations de NPs HA-Gd₂O₃ a été légèrement évalué basé sur l'absorbance du surnageant à 541 nm. Les résultats montrèrent que les pourcentages d'hémolyse des NPs HA-Gd₂O₃ étaient tous inférieurs à 3 % dans la concentration étudiée, vérifiant leur hémocompatibilité favorable. Afin d'examiner la toxicité potentielle, les NPs HA-Gd₂O₃ ont été injectées par voie intraveineuse dans des souris Balb/c (comme vu dans Fig. S2). Après 1 semaine, ces souris ont été euthanasiées, et la vessie, le rein et la rate ont été prélevés pour analyse de section pathologique. Comme montré dans Fig. S2, le résultat des sections pathologiques montra qu'il n'y avait pas de lésion ou réponse inflammatoire observable dans les organes des souris traitées aux NPs HA-Gd₂O₃. Ces résultats indiquèrent clairement que les NPs HA-Gd₂O₃ synthétisées avaient une cytocompatibilité favorable et une bonne hémocompatibilité.

Étude fantôme IRM

Les temps de relaxation longitudinale (T₁) des NPs HA-Gd₂O₃ ont été investigués in vitro avec le produit de contraste commercial Magnevist (Gd-DTPA) comme contrôle en utilisant un tampon phosphate salin (pH = 7,4, 0,2 M). Avec l'augmentation des concentrations de Gd, l'intensité de signal des images fantôme T₁-pondérées augmentait clairement, indiquant que tous les échantillons pouvaient générer une amélioration de contraste IRM sur les séquences T₁-pondérées (Fig. 4a). De plus, les graphiques de l'intensité de signal versus temps d'inversion donnaient les temps de relaxation T₁ de chaque agent de contraste à des concentrations spécifiques. Comme montré dans la Fig. 4b, la valeur r₁ des NPs HA-Gd₂O₃ a été mesurée à 6,0 mM⁻¹S⁻¹, ce qui était significativement plus élevé que celui de Magnevist (3,86 mM⁻¹S⁻¹) sous les mêmes conditions. L'r₁ amélioré peut être attribué au rayon hydrodynamique et à la surface beaucoup plus élevés des NPs HA-Gd₂O₃ ; par conséquent, plus d'atomes de Gd dopés dans le réseau des NPs devenaient accessibles aux molécules d'eau, raccourcissant la relaxation longitudinale et améliorant la valeur r₁.

Imagerie IRM In Vivo

Afin de déterminer les applications potentielles in vivo, la performance d'imagerie IRM et le destin de circulation des NPs HA-Gd₂O₃ (10 mg/kg) ont été investigués en utilisant un scanner IRM avec des souris BALB/c normales comme modèle. Comparé aux images pré-injection (Fig. 4c), les régions plus brillantes du rein et de la vessie indiquées par les cercles pointillés étaient clairement observées à 10 min post-injection, démontrant que les NPs HA-Gd₂O₃ pouvaient être utilisées comme AC améliorant la relaxation T₁ dans ces organes majeurs in vivo. Important, l'amélioration de contraste des NPs HA-Gd₂O₃ a été maintenue jusqu'à 60 min post-injection, ce qui était beaucoup plus long que celui des petites molécules de complexe Gd (demi-vie d'environ plusieurs minutes chez les petits animaux) [27], indiquant que les NPs HA-Gd₂O₃ possédaient des temps de rétention in vivo plus longs que le contraste commercial. Pour analyser l'effet de contraste IRM quantitativement, nous avons calculé le rapport signal-bruit (SNR) en analysant finement les régions d'intérêt des images IRM et calculé les valeurs de SNR_post/SNR_pre pour représenter l'amélioration de signal relative (ASR) (Fig. 4d). Les valeurs ASR des NPs HA-Gd₂O₃ dans le rein étaient 1,35, 1,99 et 1,86. Similairement, les valeurs ASR des NPs HA-Gd₂O₃ dans la vessie étaient plus élevées que celles dans le rein (1,29, 3,59 et 2,26). Les NPs HA-Gd₂O₃ avec grande taille (plus de 100 nm) affichèrent de longs temps de circulation, puis peuvent être éliminées par la voie biliaire-intestinale selon les résultats précédents [32]. De plus, le temps de circulation prolongé in vivo peut avoir augmenté le ciblage passif dans les tumeurs en améliorant l'effet EPR.

Imagerie tumorale

Les NPs HA-Gd₂O₃ avec une excellente performance d'imagerie IRM et un long temps de circulation fournissent une grande opportunité pour l'imagerie des tumeurs via un effet EPR. Nous avons ainsi établi des modèles de tumeurs hépatiques sous-cutanées pour investiguer si les carcinomes hépatocellulaires (CHC) peuvent être détectés par IRM améliorée par NPs HA-Gd₂O₃. Après injection intraveineuse des NPs HA-Gd₂O₃, nous avons observé que la région tumorale sous-cutanée devient plus brillante que le tissu environnant comme vu par les balayages coronal et transverse (Fig. 5a). L'ASR de la tumeur sous-cutanée a dramatiquement atteint 1,54 et 1,83 avec balayage transverse et coronal, respectivement, indiquant l'accumulation efficace des NPs HA-Gd₂O₃ dans la région tumorale par l'effet EPR. Ces résultats démontrent que les NPs HA-Gd₂O₃ sont hautement sensibles pour la visualisation IRM des tumeurs. De nombreuses études ont montré que le long temps de circulation pouvait promouvoir l'efficacité du ciblage passif à travers la vasculaire perméable des tumeurs solides [33].

Amélioration de la radiosensibilisation par les NPs HA-Gd₂O₃

L'excellente performance des NPs HA-Gd₂O₃ comme agent de contraste T₁ nous a incités à déterminer son emplacement dans la radiosensibilisation des tumeurs avec précision. Premièrement, si l'augmentation de dose se produisait avec ce traitement combiné a été explorée en utilisant un essai CCK-8. Comme représenté dans la Fig. 6a, les NPs HA-Gd₂O₃ seules (concentration 0–200 μg/mL) n'influençaient pas significativement la viabilité des HepG-2, mais l'irradiation X (gamme 0–9 Gy) diminuait la viabilité des cellules HepG-2 à moins de 70 % à 9 Gy. Important, une combinaison d'irradiation X avec NPs HA-Gd₂O₃ diminuait dramatiquement la viabilité des cellules HepG-2 à moins de 50 %, particulièrement à une concentration de 200 μg/mL à 9 Gy. Ensuite, un essai clonogénique a été conduit pour évaluer la viabilité cellulaire dans les cellules HepG-2 suivant une combinaison d'irradiation X et NPs HA-Gd₂O₃. Comme montré dans la Fig. 6b, les NPs HA-Gd₂O₃ seules n'avaient pas d'influence dramatique sur la formation de colonies de cellules HepG-2, mais l'irradiation X diminuait la formation de colonies de cellules HepG-2 à 46,7 %. Cependant, le traitement avec irradiation X et NPs HA-Gd₂O₃ inhibait notablement la viabilité de formation de colonies à 29,8 %. Les images correspondantes vérifièrent davantage la radiosensibilisation des NPs HA-Gd₂O₃ contre les cellules HepG-2.

L'efficacité de la radiothérapie in vitro nous a encouragés à appliquer les NPs HA-Gd₂O₃ combinées avec l'irradiation pour contrôler la croissance tumorale chez des souris porteuses de tumeurs. Les volumes des tumeurs dans les groupes contrôle et traitement unique NPs HA-Gd₂O₃ ont grandi rapidement et ont tous deux augmenté de 180 %. Comparé aux traitements d'irradiation unique 58 %, les NPs HA-Gd₂O₃ combinées avec la radiothérapie ont montré une inhibition tumorale efficace de 38 % après 10 jours d'irradiation (Fig. 6d). La tumeur a été photographiée, et les volumes tumoraux moyens dans chaque groupe montrèrent que le volume tumoral moyen dans le groupe (a) était le plus élevé tandis que celui dans le groupe (d) était le plus bas parmi tous les groupes (Fig. 6e). Ces résultats révèlent que les NPs HA-Gd₂O₃ préparées sont prometteuses pour l'inhibition de la croissance tumorale sous irradiation X.

Des essais de cytométrie de flux et de coloration vivant/mort ont été conduits pour mieux comprendre le mécanisme de radiosensibilisation dans le traitement combiné des NPs HA-Gd₂O₃ et irradiation X. Comme montré dans la Fig. 7a, une fluorescence verte intense sans rouge a été observée dans les cellules HepG-2 traitées avec NPs HA-Gd₂O₃ seules, ce qui vérifiait une haute viabilité cellulaire. Une petite quantité de fluorescence rouge a été observée après traitements d'irradiation X, indiquant un faible niveau d'apoptose cellulaire. Cependant, une forte fluorescence rouge a été observée suivant le traitement combiné de NPs HA-Gd₂O₃ (200 μg/mL) et radiothérapie, démontrant que les NPs HA-Gd₂O₃ pouvaient dramatiquement améliorer l'apoptose cellulaire induite par irradiation X. Le mécanisme de radiosensibilisation des NPs HA-Gd₂O₃ a été davantage investigué en utilisant la cytométrie de flux. Comme représenté dans la Fig. 7b, l'irradiation unique et les NPs HA-Gd₂O₃ induisaient 27,55 % et 19,12 % d'arrêt en phase G2/M, respectivement. Cependant, le traitement combiné des NPs HA-Gd₂O₃ et radiothérapie augmentait notablement l'arrêt en phase G2/M, variant de 30,89 à 33,27 % de manière dose-dépendante. Simultanément, le traitement combiné induisait la mort cellulaire apoptotique de 10,63 à 22,67 %, comme reflété par les proportions sub-G1 lorsque les NPs HA-Gd₂O₃ uniques et radiothérapie induisaient 3,02 % et 13,87 %. Pour investiguer davantage le mécanisme possible de mort cellulaire, une méthode Annexin V-EGFP/PI a été conduite par cytométrie de flux. Le signal d'émission Annexin V-EGFP était tracé sur l'axe x, tandis que le signal d'émission PI était tracé sur l'axe y (Fig. 8). Les quantités de cellules nécrotiques, apoptose précoce, apoptose tardive et cellules vivantes étaient déterminées par le pourcentage de Annexin V⁻/PI⁺(Q3), Annexin V⁺/PI⁺ (Q2), et Annexin V⁻/PI⁻ (Q4), respectivement. Le pourcentage apoptotique des cellules dans le groupe contrôle et groupe NPs HA-Gd₂O₃ unique (100 μg/mL) étaient inférieurs à 5 %, résultant en une influence subtile. Comparé aux groupes de traitement radiothérapie unique (8,8 %), le taux d'apoptose de la combinaison NPs HA-Gd₂O₃ et radiothérapie augmentait avec la concentration augmentée variant de 50 à 200 μg/mL. Particulièrement, le taux d'apoptose précoce des cellules augmentait évidemment à 33,2 %, et l'apoptose précoce et tardive atteignait 44,3 % lorsque la concentration est 200 μg/mL. Généralement, la combinaison des NPs HA-Gd₂O₃ et irradiation X avait un effet synergique sur la formation de colonies cellulaires, la viabilité cellulaire de manière dose-dépendante, et effet d'amélioration de radiosensibilisation. Basés sur ces résultats, les NPs HA-Gd₂O₃ peuvent être une alternative efficace pour améliorer la radiosensibilisation pour la radiothérapie.

Conclusions

En conclusion, nous avons développé des NPs HA-Gd₂O₃ bifonctionnelles pour une imagerie IRM efficace et une radiosensibilisation des tumeurs dans un processus hydrothermal one-pot. Après revêtement avec HA, les NPs HA-Gd₂O₃ synthétisées exhibèrent une dispersibilité favorable dans l'eau, une excellente biocompatibilité. Les NPs HA-Gd₂O₃ résultantes encapsulant les atomes de Gd non seulement exhibèrent efficacement une relaxivité longitudinale (r₁) élevée pour l'IRM comme agent de contraste T₁, mais améliorèrent aussi la radiosensibilité des tumeurs en induisant l'apoptose cellulaire et bloquant le cycle cellulaire comme radiosensibilisateur. Ainsi, les nouvelles NPs HA-Gd₂O₃ montrent un potentiel prometteur pour le diagnostic et la radiothérapie des tumeurs.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Fluorescéine diacétate (FDA) et iodure de propidium (PI) ont été acquis auprès de Sigma (New York, NY, USA). GdCl₃·6H₂O, glycol éthylène (99 %) ont été achetés auprès de Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, République Populaire de Chine). Le kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) a été acheté auprès de Dojindo (Kumamoto, Japon). NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, et H₂SO₄ ont été obtenus auprès de l'Institut de Recherche Chimique Fine Guangfu (Nankai, Tianjin, République Populaire de Chine). Sérum bovin fœtal et milieu essentiel minimum de Dulbecco (DMEM) ont été achetés auprès de Invitrogen China Limited (Shanghai, République Populaire de Chine). Tous les produits chimiques étaient de grade analytique et ont été utilisés sans purification supplémentaire.

Synthèse des NPs HA-Gd₂O₃

Les NPs HA-Gd₂O₃ ont été préparées en utilisant l'approche hydrothermal one-pot comme suit : D'abord, 0,1 g de HA a été dissous dans 20 mL d'eau sous agitation vigoureuse à température ambiante pendant la nuit. Ensuite, 0,1 g de GdCl₃·6H₂O et 0,5 mL de NaOH (1 M) ont été ajoutés, respectivement. Ensuite, le mélange a été agité pendant 5 min supplémentaires pour former une solution claire homogène et transféré dans un autoclave de 50 mL, scellé, et traité hydrothermalement à 120 °C pendant 6 h. Après refroidissement naturel à température ambiante, la suspension transparente a été filtrée avec une membrane de 0,22 μm pour éliminer toute agglomération de grande taille. La solution préparée a ensuite été dialysée contre l'eau pendant 3 jours dans un sac de dialyse avec coupure de poids moléculaire 14 kDa. La solution de dialyse a été collectée et lyophilisée en utilisant un lyophilisateur sous vide. Les poudres de NPs HA-Gd₂O₃ ainsi obtenues ont été conservées pour caractérisation ultérieure.

Instrumentation et caractérisations

Les morphologies des NPs HA-Gd₂O₃ ont été examinées par microscopie électronique à transmission à haute résolution sur un microscope JEM-2100 (JEOL, Tokyo, Japon) sous une tension d'accélération de 200 kV. La composition élémentaire des NPs HA-Gd₂O₃ a été déterminée par mesures XPS dans un spectromètre photoélectronique MK II, utilisant Al-Kα (1486,6 eV) comme source de rayons X et spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, USA). La structure cristalline des NPs HA-Gd₂O₃ a été caractérisée via les motifs de diffraction des rayons X (DRX) sur un diffractomètre Rigaku-D/MAX2500 (Rigaku, Japon) équipé d'un rayonnement Cu Kα (λ = 0,15405 nm) à une vitesse de balayage de 4°/min dans la gamme de 5 à 80°.

Essai de viabilité cellulaire

L'influence des NPs HA-Gd₂O₃ sur la viabilité cellulaire a été étudiée via l'essai Cell Counting Kit CCK-8 (essai CCK-8). Les cellules HepG2 (carcinome hépatocellulaire humain, Numéro ATCC : HB-8065) et VSMCs (cellules musculaires lisses vasculaires) ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 3 × 10³ cellules/puits et cultivées à 37 °C dans un incubateur 5 % CO₂ pendant 24 h, puis en utilisant DMEM contenant différentes concentrations de NPs HA-Gd₂O₃ (0 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL et 200 μg/mL) remplaçant le milieu de croissance. Après incubation pendant 4 h supplémentaires, ajout de 10 μL de solution CCK-8 à chaque puits, les cellules ont été incubées pendant 4 h dans un endroit sombre. L'absorbance a été mesurée à 490 nm en utilisant un lecteur de plaques multi-mode Synergy HT (Bio Tek, Winooski, VT, USA). Les cellules non traitées (dans DMEM) ont été utilisées comme contrôle, et la viabilité cellulaire relative (moyenne SD, n = 5) a été exprimée comme Abssample/Abscontrol × 100 %.

Essai d'hémolyse

Brèvement, 19–21 g, âges de 6 semaines souris BALB/c femelles ont été préparées selon les Règles de Gestion Animale du Ministère de la Santé de la République Populaire de Chine. Trois millilitres de sang stabilisé avec héparine sodique ont été obtenus par énucléation. Ensuite, il a été centrifugé pour éliminer le surnageant à 1200 tr/min, 15 min selon la littérature. Après cela, lavage du culot avec PBS cinq fois pour obtenir les globules rouges de souris (GRBS), puis prélèvement d'environ 3 mL de sang par énucléation, stabilisé avec héparine sodique, centrifugé (1200 tr/min, 15 min) pour éliminer le surnageant selon la littérature [27], lavé avec PBS cinq fois pour obtenir les GRBS. Dilution dix fois avec PBS, 0,1 mL GRBS ont été transférés dans des tubes de 1,5 mL préremplis avec 0,9 mL PBS contenant différentes concentrations de particules (50–200 μg/mL) de NPs HA-Gd₂O₃, 0,9 mL eau (comme contrôle positif), et 0,9 mL PBS (comme contrôle négatif), respectivement. Le mélange a été incubé pendant 2 h à température ambiante après agitation douce, puis centrifugé à 12 000 tr/min pendant 1 min. Finalement, les photographies de tous les échantillons ont été prises et l'absorbance du surnageant (hémoglobine) a été mesurée par un spectrophotomètre UV-2450 UV–Vis. Les pourcentages d'hémolyse des différents échantillons ont été calculés en divisant la différence d'absorbance entre l'échantillon, le contrôle positif et négatif à 541 nm.

Étude fantôme IRM In Vitro et In Vivo

Les images IRM in vitro et in vivo ont été acquises sur un scanner IRM 3 Tesla (Magnetom Trio Tim, Siemens, Allemagne). Pour étudier les images fantôme T₁ in vitro, la solution de NPs HA-Gd₂O₃ avec différentes concentrations variant de 0 à 16 mM a été ajoutée à une plaque de culture à 96 puits, en utilisant le Magnevist (agent de contraste IRM commercial, Gd-DTPA) comme contrôle. Pour l'imagerie IRM in vivo, nous avons choisi les souris BALB/c normales comme modèle (n = 4). Les expériences animales étaient strictement conformes aux Règles de Gestion Animale du Ministère de la Santé de la République Populaire de Chine. Dix milligrammes par kilogramme de NPs HA-Gd₂O₃ filtrées à travers des filtres à membrane stérilisés (taille de pore 0,22 μm) ont été injectés par voie intraveineuse dans les animaux, puis immédiatement investigués avec un scanner IRM. Ces échantillons pour l'imagerie IRM in vitro et animaux in vivo ont été imager avec les paramètres suivants : TR/TE = 300/10 ms, matrices 256 × 256, tranches = 5, épaisseur = 2 mm, moyennes = 2, FOV = 80 × 80.

Effet de radiosensibilisation In Vitro

L'essai CCK-8 a été utilisé pour évaluer l'activité radiosensibilisante des NPs HA-Gd₂O₃ in vitro. Les cellules ont été ensemencées dans cinq plaques à 96 puits à une densité de 3 × 10³ cellules/puits, et chaque plaque a été traitée dans les mêmes conditions : cultivée à 37 °C dans un incubateur 5 % CO₂ pendant 24 h, puis en utilisant DMEM contenant différentes concentrations de NPs HA-Gd₂O₃ (0 μg/mL, 12,5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL et 200 μg/mL) remplaçant le milieu de croissance. Après incubation pendant 4 h, cinq plaques ont été irradiées à différentes doses de rayons X (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy et 9 Gy), 300 cGy/min, respectivement. Après radiothérapie, toutes les plaques ont été incubées pendant 4 h, puis mesurant l'absorbance sous les mêmes paramètres.

L'essai de survie clonogénique a également été conduit pour étudier l'effet de radiosensibilisation in vitro. Les cellules HepG2 ont été ensemencées dans des plaques à six puits à 4,0 × 10⁴ cellules/puits et laissées croître pendant 16 h. Les cellules ont été incubées avec NPs HA-Gd₂O₃ diluées dans le milieu de culture cellulaire pendant 6 h. Les cellules ont ensuite été irradiées à 6 Gy en utilisant un accélérateur linéaire clinique (Oncor, Siemens, Allemagne) avec irradiation 6 MeV utilisant un champ de radiation 10 cm × 10 cm à une distance source-peau (DSP) de 100 cm pour couvrir toutes les cellules. Ensuite, ces cellules irradiées ont été laissées croître pendant 14 jours, fixées avec 4 % paraformaldéhyde à température ambiante pendant 40 min, colorées avec 1 % violet de cristal après lavage des cellules.

Essai de coloration vivant-mort et cytométrie de flux

Pour étudier l'effet de radiosensibilisation des NPs HA-Gd₂O₃, les cellules HepG2 ont été ensemencées dans des plaques à six puits à une densité de 4,0 × 10⁴ cellules/puits et laissées croître pendant 12 h et six groupes définis (contrôle, NPs HA-Gd₂O₃, radiothérapie, radiothérapie + 50 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃, radiothérapie + 100 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃ et radiothérapie + 200 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃). Lorsque les cellules atteignaient 80 % dans les puits, le premier groupe n'avait pas de traitement, le deuxième groupe était incubé avec 100 μg/mL NPs HA-Gd₂O₃ pendant 24 h, le troisième groupe était juste irradié, et le quatrième au sixième groupe étaient irradiés et incubés avec différentes concentrations de NPs HA-Gd₂O₃ (50, 100 et 200 μg/mL) pendant 24 h, respectivement. Après cela, les tampons de travail FDA et PI ont été ajoutés pour la coloration cellulaire. La fluorescence des cellules colorées a été observée sous un microscope à fluorescence (×20), et les cellules vivantes montraient une couleur verte et les mortes une couleur rouge. De plus, les cellules par différents traitements ont été lavées trois fois avec PBS, digérées, collectées, et centrifugées à une vitesse de 2000 tr/min pendant 5 min, puis fixées avec 70 % éthanol à −20 °C pendant la nuit suivi par coloration PI. La fragmentation d'ADN a été quantifiée par l'intensité de fluorescence de PI sur un cytomètre de flux (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analysée par logiciel (FLOWJO 7.6.2) pour clarifier la distribution du cycle cellulaire.

Effet de radiosensibilisation In Vivo

Des souris BALB/c femelles avec poids corporels de 19–21 g et âges de 6 semaines ont été obtenues du Centre d'Animaux de Laboratoire de l'Université de Yangzhou sous conditions standard. Les expériences animales étaient conformes aux Règles de Gestion Animale du Ministère de la Santé de la République Populaire de Chine. Un modèle de tumeur sous-cutanée a été établi selon les procédures suivantes : D'abord, 1 × 10⁶ cellules HepS ont été inoculées dans les souris par voie intrapéritonéale, et l'ascite a été collectée après 5 jours. Ensuite, ces ascites ont été injectées par voie sous-cutanée. Lorsque les tailles de tumeurs atteignaient environ 100 mm³, les modèles de tumeurs sous-cutanées étaient établis et appliqués aux expériences suivantes.

Huit souris porteuses de tumeurs sous-cutanées par groupe ont été traitées avec radiothérapie à 3 Gy par fraction pour une dose totale de 9 Gy dans 7 jours. La radiothérapie a été conduite après 3 h d'injection intraveineuse de NPs HA-Gd₂O₃ (10 mg/Kg), sur un accélérateur linéaire clinique Siemens Primus (6 MeV) en utilisant un dispositif auto-fait pour couvrir toute la tumeur. Ces souris ont été anesthésiées par 1 % pentobarbital (50 mg/kg) pour assurer l'immobilité pendant l'irradiation. Le volume a été mesuré et enregistré chaque jour, déterminé par mesure au pied à coulisse, et calculé par la formule : V = 0,5 × a × b², où V (mm³) est le volume de la tumeur, et a (mm) et b (mm) sont la longueur et la largeur de la tumeur, respectivement. Les volumes tumoraux relatifs étaient normalisés à leurs tailles initiales. Chaque groupe a été conduit sur huit souris, où l'analyse statistique a été effectuée en utilisant le test t bilatéral de Student (*p < 0,05, **p < 0,001).

Disponibilité des données et matériaux

Les jeux de données soutenant les résultats de cet article sont inclus dans l'article.