Les voies d'apoptose déterminent la cytotoxicité des nanoparticules d'oxyde de zinc fraîches vs vieillies

Résumé

Les nanoparticules d'oxyde de zinc (ZnO NP) sont utilisées dans une large gamme d'applications incluant l'industrie, les produits commerciaux et le domaine médical. De nombreuses études mécanistiques pour la toxicité des ZnO NP ont été effectuées sur des NP purs (fraîches). Cependant, la cytotoxicité induite par les ZnO NP transformées (vieillies) et les mécanismes sous-jacents restent flous. Ici, nous avons observé la transformation physicochimique des ZnO NP au fil du temps, suivie de l'évaluation de la cytotoxicité des NP fraîches et vieillies. Nous avons trouvé que les ZnO NP fraîches induisaient un niveau d'apoptose plus élevé que leurs homologues vieillies. En conséquence, les données de séquençage d'ARN des cellules hybrides humain-hamster (A_L) traitées avec des ZnO NP vieillies montraient que les voies de signalisation p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutathion, ErbB, HIF-1, Ocytocine et Jak-STAT étaient enrichies mais pas la voie d'apoptose. Les résultats de PCR quantitative ont révélé un niveau d'ARNm significativement plus élevé de IL1B et CD69 dans les groupes traités avec des NP fraîches comparé à celui des groupes traités avec des ZnO NP vieillies et du chlorure de zinc. Les résultats ci-dessus indiquaient que la cytotoxicité plus faible des ZnO NP vieillies est partiellement attribuée à leur puissance réduite dans l'induction de l'apoptose. La régulation transcriptionnelle de multiples voies de signalisation activées par les NP vieillies peut aider à établir l'homéostasie cellulaire. Ensemble, nos résultats soulignent l'influence du processus de vieillissement (transformation environnementale) des ZnO NP sur leurs toxicités et conséquences biologiques.

Introduction

Avec le développement rapide de la nanotechnologie au cours des dernières décennies, les nanoparticules (NP) ont été appliquées dans divers domaines, incluant l'industrie, la vie quotidienne humaine et la nanomédecine [1, 2]. L'inventaire des produits de consommation en nanotechnologie (CPI) montre une augmentation de 30 fois entre 2005 et 2015 dans le nombre de produits nano, incluant 762 produits de santé (fitness), 72 aliments (boissons) et 23 produits pour bébés [2]. L'application croissante des NP dans les produits de consommation et divers domaines a augmenté la possibilité que les NP entrent dans l'environnement, ce qui soulève des préoccupations de sécurité quant à leurs impacts négatifs potentiels. Les nanoparticules d'oxyde de zinc (ZnO) sont parmi les NP les plus couramment utilisées, et sa production annuelle mondiale a atteint près de 3400 tonnes [3, 4]. Certaines substances qui étaient précédemment considérées comme biologiquement inertes pourraient devenir toxiques dans leur état nanoparticulaire. Un nombre croissant d'études ont élucidé que les ZnO NP peuvent présenter des risques significatifs pour les cellules mammaliennes et les animaux en induisant une toxicité significative [5-7].

Diverses stratégies incluant l'enrobage, la fonctionnalisation de surface et la modification de l'état d'oxydation ont été utilisées pour atténuer la toxicité potentielle des NP en modifiant leurs propriétés physiques et chimiques (telles que la dissolution, l'agglomération et la perturbation des membranes cellulaires) [8-11]. Bien que ces modifications des NP affaiblissent leurs effets toxiques à un certain degré, l'utilisation des NP n'est pas toujours sûre, surtout sous certaines conditions d'exposition et environnements [12-14]. En fait, de nombreux types de NP ne sont pas stables et enclins à subir un "vieillissement" ou une "transformation environnementale" après avoir été intentionnellement ou non libérés dans l'environnement naturel [14-17]. Ces dernières années, beaucoup de travaux ont été menés pour explorer le processus de transformation environnementale des NP ; cependant, la recherche sur les effets toxiques des NP "transformées (vieillies)" est encore très limitée, sans parler de leurs mécanismes toxiques.

En tant que représentant typique des NP non persistantes, les ZnO NP ont une réactivité très élevée, et sont sujettes à se transformer dans les propriétés physiques et chimiques et l'état d'occurrence après avoir été libérées dans l'environnement ou ingérées par les animaux, ce qui pourrait affecter significativement leurs effets toxicologiques [17, 18]. Par exemple, des études ont montré que le processus de sulfuration des ZnO NP changeait la charge, l'hydrophobicité et l'état d'agrégation, résultant dans l'adsorption de NP d'état sulfuré dans la salive humaine, la sueur et le liquide de lavage bronchoalvéolaire. De plus, la protéine adsorbée par les ZnO NP forme une couronne protéique spéciale qui affecte généralement son effet biologique [19]. Les phosphates dans les solutions physiologiques pourraient convertir les ZnO NP en ZnHPO₄ métastable et Zn₃(PO₄)₂ en environ 5-10 h [20]. Le processus de transformation complète des ZnO NP (≤ 3 μg/mL) dans le système d'exposition in vitro aux lymphocytes T humains (37 °C, milieu de culture cellulaire RPMI1640 contenant 10 % FBS pendant 24 h) a été étudié en utilisant la spectroscopie de structure d'absorption proche du bord par rayonnement synchrotron (XANES) [21]. Les études ci-dessus suggèrent la sous-estimation des risques environnementaux et sanitaires des ZnO NP en évaluant uniquement les effets biologiques des ZnO NP pures (fraîches). À la lumière de ce problème, il y a un besoin urgent de comprendre de manière complète les processus de vieillissement et de transformation environnementale des NP [22].

Notre étude précédente a révélé que les ZnO NP vieillies pendant 40-120 jours dans l'eau ultrapure subissent une transformation physicochimique et se transforment en Zn₅(CO₃)₂(OH)₆, Zn(OH)₂, et Zn²⁺ [23]. Intéressant, les ZnO NP vieillies présentaient une cytotoxicité plus faible que les homologues fraîches [23], pourtant les mécanismes de toxicité d'une telle variation sont flous. Dans la présente étude, nous nous sommes fixés pour explorer les raisons sous-jacentes des différentes cytotoxicités entre les ZnO NP fraîches et vieillies. Des ZnO NP avec deux tailles de particules différentes (20 nm et 90-200 nm) ont été appliquées systématiquement. Les essais de cytotoxicité ont démontré que les ZnO NP vieillies induisaient des anomalies morphologiques moins prononcées et des viabilités cellulaires relativement plus élevées que leurs homologues fraîches. Les données de séquençage d'ARN ont révélé que les gènes apoptotiques étaient enrichis dans les cellules traitées avec des ZnO NP fraîches, alors que ces gènes étaient beaucoup moins affectés par les traitements avec des ZnO NP vieillies. De plus, les cellules exposées aux ZnO NP vieillies montraient un niveau réduit de protéine Caspase-3 clivée, indiquant davantage la puissance plus élevée des ZnO NP fraîches pour déclencher l'apoptose dans les cellules cultivées. Combiné avec nos découvertes précédentes, cette étude a suggéré que la cytotoxicité diminuée des ZnO NP vieillies est attribuée à leur capacité atténuée à déclencher l'apoptose cellulaire.

Matériaux et méthodes

Nanoparticules et réactifs

Les nanopoudres de ZnO disponibles commercialement (ZnO NP), avec une taille moyenne rapportée par le fabricant de 20 nm (pureté 99,5 %, presque sphériques) et 90-200 nm (pureté 99,9 %, morphologie irrégulière), ont été achetées chez Nanostructured & Amorphous Materials (Houston, TX). Sauf indication contraire, tous les réactifs et produits chimiques utilisés dans cette étude ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine).

Dispersion, vieillissement et caractérisation des nanoparticules

Les suspensions mères de ZnO NP (1 mg/mL) ont été préparées en suspendant des nanopoudres sèches dans de l'eau Milli-Q H₂O (Millipore, 18 MΩ·cm) et stérilisées par autoclavage (120 °C, 30 min) puis stockées à 25 °C pour une période de vieillissement naturel allant de 0 à 60 jours. Les ZnO NP naturellement transformées à 0 et 60 jours étaient désignées comme NP fraîches et vieillies, respectivement. Pour assurer une dispersion appropriée, les suspensions fraîches et vieillies étaient soniquées (100 W) pendant 30 min dans un bain ultrasonique avant la caractérisation ou l'incubation avec les cellules. La morphologie, la taille des particules et l'agrégation des ZnO NP fraîches et vieillies étaient caractérisées en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM, JEOL JEM-2010, Tokyo, Japon). La structure cristalline des ZnO NP fraîches et vieillies était déterminée en utilisant la diffraction des rayons X sur poudre (XRD, PANalytical B.V., Shanghai, Chine) en comparant aux standards authentiques. Les détails du processus de vieillissement naturel et de la caractérisation sur les ZnO NP ont été décrits précédemment [23].

Culture cellulaire et traitement avec les ZnO NP

La lignée cellulaire A_L, un type de cellules hybrides humain-hamster formées par fusion du mutant gly2A de l'ovaire de hamster chinois (CHO) et de fibroblastes humains a été utilisée dans cette étude. Ces cellules hybrides contenaient un ensemble standard de chromosomes CHO-K1 et une seule copie du chromosome humain 11 et étaient cultivées dans le milieu Ham's F12 (Hyclone, Grand Island, NY) supplémenté avec du sérum fœtal bovin (8 %, Hyclone, Grand Island, NY), gentamicine (25 g/mL) et glycine (2 × 10⁻⁴ M) à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % CO₂ [24]. Les suspensions mères de ZnO NP fraîches et vieillies étaient dispersées par 30 min d'ultrasonication (100 W) pour prévenir l'agglomération, ensuite diluées à des concentrations appropriées avec le milieu de culture cellulaire pour l'exposition des cellules. Les cellules maintenues dans le milieu de culture cellulaire sans NP servaient de témoin dans chaque expérience.

Essai pour détecter la cytotoxicité

Les cellules A_L à une phase logarithmique de croissance étaient cultivées sur lames de verre dans des boîtes de Petri de 35 mm (6 × 10⁴ cellules/plat) pendant 24 h avant stimulation, suivies par un traitement avec 2 mL de milieu de culture contenant 1, 5, 10, 12, 15 et 20 µg/mL de ZnO NP fraîches ou vieillies pendant 72 h. Après la fin du temps de traitement, les images de morphologie cellulaire étaient obtenues en utilisant un microscope Leica DM4B (Leica, Allemagne). Le ZnCl₂ était inclus comme référence d'ions zinc pour comparer la cytotoxicité avec les ZnO NP.

Le kit de comptage cellulaire (CCK-8) (APExBIO, Shanghai, Chine) a été utilisé pour détecter la viabilité cellulaire. En détail, les cellules A_L étaient semées dans des plaques à 96 puits (4 × 10³ cellules/puits) avec le milieu de culture cellulaire pendant 24 h et traitées avec le milieu contenant diverses concentrations de ZnCl₂, ZnO NP fraîches et vieillies pendant 24, 48 et 72 h, respectivement. Pour la solution de travail, le volume de NP ajoutées de la suspension mère était inférieur à 5 % du volume total du milieu de culture dans chaque puits. Après la fin du temps de traitement, le milieu de culture était aspiré, et les cellules étaient incubées avec 100 µL de solution de travail CCK-8 pendant 2 h à 37 °C selon les instructions du fabricant. Ensuite, l'absorbance était enregistrée à 450 nm en utilisant un lecteur de fluorescence Spectra Max M2 (Molecular Devices, Wokingham, Berks, UK). La viabilité cellulaire était calculée en pourcentage d'absorbance dans les puits, avec chaque concentration de NP normalisée à l'absorbance des cellules témoins (100 %).

Extraction d'ARN, transcription inverse et PCR quantitative

Les cellules A_L à une phase logarithmique de croissance étaient semées dans des plats de Petri de 35 mm de diamètre (6 × 10⁴ cellules/plat) avec le milieu de culture cellulaire pendant 24 h. Ensuite, le milieu était remplacé avec 2 mL de milieu de culture contenant 12 µg/mL ZnCl₂, ZnO NP fraîches et vieillies pendant 72 h. Après la fin du temps de traitement, le milieu de culture était aspiré, et les cellules étaient lavées 3 fois avec PBS. Ensuite, 1 mL de réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) était ajouté à chaque plat pour extraire l'ARN total selon les instructions du fabricant. La concentration et la pureté de l'ARN total obtenu après l'extraction étaient quantifiées en utilisant un spectrophotomètre UV-Vis Q5000 (Quawell, USA). Après quantification, la transcription inverse était effectuée en utilisant le kit RT-PCR TransGene (TransGene Biotech, Beijing, Chine) pour obtenir l'ADNc à partir du modèle d'ARN selon les protocoles du fabricant. Les échantillons d'ADNc résultants étaient quantifiés en utilisant le spectrophotomètre UV-Vis Q5000 et ensuite analysés en utilisant le SYBR-Green comme colorant fluorescent (TransGene Biotech, Beijing, Chine) sur le système RT-PCR Roche (Applied Biosystems) [25].

Le gène d'entretien codant la Glycéraldéhyde-3-phosphate Déshydrogénase (Gapdh) a été utilisé comme contrôle interne pour évaluer l'expression d'ARNm de Il-1α, Il-1β, Caspase 3, CD69, Jun et MT1. Les résultats étaient exprimés comme le rapport d'expression relatif entre le gène ciblé et Gapdh. Les séquences d'amorces utilisées dans cette étude sont fournies dans le Tableau 1.

Analyse des données de séquençage d'ARN

Les échantillons d'ARN total des cellules A_L du groupe témoin, du groupe traité avec ZnO NP vieillies et du groupe traité avec ZnCl₂ ont été séquencés par BangFei Bioscience (Beijing, Chine). Brièvement, l'ARN total des cellules A_L a été extrait suivant les protocoles TRIZOL, jusqu'à la précipitation d'isopropanol. Ensuite, les échantillons d'ARN étaient remis en suspension dans le tampon d'extraction avant le séquençage. Les données brutes de comptage de séquençage d'ARN ont été analysées en utilisant le package R Deseq2 [Eric1]. Le diagramme de Venn a été généré par le package R VennDiagram [Eric1.2]. Les gènes significativement changés ont été utilisés pour l'analyse d'enrichissement de voie ultérieure. Les expériences ont été faites en trois répétitions indépendantes. Les gènes d'ARNr, les gènes mitochondriaux et les gènes détectés à moins de 40 pb étaient exclus de l'analyse.

Les données de séquençage d'ARN, séries de référence GSE97852, GSE60159 et GSE39444, ont été obtenues de Gene Expression Omnibus [Eric 2, 3, 4]. Le graphique d'analyse d'enrichissement de jeux de gènes a été généré par R (version 3.6.2) en utilisant le package fgsea [Eric 5]. Les gènes d'apoptose avec changement significatif de 1,5 fois et valeur p < 0,05 ont été utilisés pour l'analyse ultérieure. La carte de chaleur avec arbre de gènes a été générée par le package R "ComplexHeatmap" [Eric 6]. La liaison moyenne a été utilisée comme méthode de regroupement, et la distance euclidienne a été utilisée comme méthode de mesure de distance. L'analyse d'enrichissement de voie a été précédée en utilisant STRING2.0 [Eric 7].

Western Blotting

Les cellules A_L à une phase logarithmique de croissance étaient semées dans des plats de Petri de 60 mm de diamètre (1,5 × 10⁵ cellules/plat) avec le milieu de culture cellulaire pendant 24 h. Ensuite, le milieu était remplacé avec 4 mL de milieu de culture contenant 12 µg/mL ZnO NP fraîches ou vieillies pendant 24 h. À la fin de la période d'exposition, le milieu de culture était aspiré, et ensuite, les cellules étaient lavées 3 fois avec PBS et lysées sur glace avec le tampon de lyse RIPA (Beyotime, Chine) pour collecter les protéines cellulaires. Des quantités égales de protéines cellulaires étaient séparées sur des gels SDS-PAGE à 12 % et ensuite transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (Roche, Suisse). Brièvement, après 2 h de blocage avec 5 % de lait écrémé dans TBST à 25 °C, les membranes étaient ensuite incubées avec l'anticorps primaire aux dilutions appropriées (selon les protocoles du fabricant) à 4 °C pendant la nuit, suivies par incubation avec des anticorps secondaires conjugués HRP (1:5000, Promega, Madison, USA) pendant 2 h à 25 °C. Finalement, l'immunomarquage était détecté en utilisant une solution de chimiluminescence amplifiée (ECL) (BOSTER, Chine). Les anticorps primaires anti-pro/caspase-3 clivée et anti-Actine étaient achetés chez Cell Signaling Technology et ImmunoWay, respectivement.

Statistiques

L'analyse statistique a été compilée sur les moyennes des résultats obtenus d'au moins trois expériences indépendantes. Toutes les données étaient présentées comme moyennes ± écart type (SD) et comparées statistiquement en utilisant l'analyse de variance à un facteur (ANOVA). Dans tous les graphiques, les valeurs p < 0,05 étaient montrées comme * et considérées comme statistiquement significatives.

Résultats

Caractérisation des ZnO NP

Pour déterminer les différences dans les caractéristiques physicochimiques détaillées entre les ZnO NP fraîches et vieillies, nous avons d'abord observé la morphologie des NP en utilisant TEM (Fig. 1A). Nos résultats indiquaient que les ZnO NP fraîches de 20 nm étaient des cristaux presque sphériques et les ZnO NP fraîches de 90-200 nm étaient des cristaux en bâtonnets/cubiques irréguliers. La taille de particule unique était cohérente avec la taille fournie par le fabricant. Évidemment, les ZnO NP de 20 nm et 90-200 nm étaient enclines à s'agréger dans l'eau ultrapure. Aussi, indépendamment de la forme et de la taille des NP originales, la microstructure des ZnO NP de 20 nm et 90-200 nm a été dramatiquement changée d'une structure cristalline claire à un état amorphe ou feuilleté/aigu après vieillissement de 60 jours. De plus, la nature cristalline et la pureté de phase des NP fraîches et vieillies étaient déterminées en utilisant la diffraction des rayons X (XRD) avec rayonnement Cu Kα (λ = 0,15418 nm) à 25 °C, comme montré dans la Fig. 1B. Le motif XRD des ZnO NP fraîches indiquait que les échantillons étaient composés de structure wurtzite cristalline et aucun pic d'impureté caractéristique n'était identifié, suggérant une haute qualité des NP fraîches. Pour les NP vieillies, le motif XRD exhibait la néoformation de Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ (numéro de carte 00-011-0287) et Zn(OH)₂ (numéro de carte 00-003-0888) phases solides, indiquant la transformation chimique des ZnO NP (20 et 90-200 nm) pendant le processus de vieillissement.

Observation morphologique des cellules A_L exposées aux ZnO NP fraîches et vieillies

Le traitement par NP entraîne un changement notable de la forme cellulaire, ou morphologie, in vitro [26]. Par conséquent, les cellules A_L exposées aux ZnO NP fraîches ou vieillies à 10 et 15 µg/mL pendant 72 h ont été examinées sous un microscope stéréoscopique. Comme montré dans la Fig. 2, la morphologie cellulaire dans le groupe témoin restait normale. Les cellules adhéraient bien, la plupart s'attachant dans les 2 h. La plupart des cellules étaient en forme de fuseau ou polygonales, avec quelques cellules nouvellement divisées montrant un cytoplasme plus transparent et une meilleure dispersion pendant le processus d'adhérence. Le traitement avec 12 µg/mL de ZnO NP fraîches (20 nm et 90-200 nm) pendant 72 h a significativement changé la morphologie cellulaire. Bien que la plupart des cellules adhéraient dans les 3-5 h, elles ne pouvaient pas bien s'étaler, et certaines cellules devenaient arrondies et perdaient la forme polygonale. Lorsque la concentration de ZnO NP était augmentée à 15 µg/mL, les cellules traitées s'atrophiaient et ne pouvaient pas adhérer, suggérant leur viabilité cellulaire significativement plus faible que celle des cellules traitées avec 10 µg/mL. Ces résultats indiquaient que la LC100 pour les ZnO NP fraîches est probablement inférieure à 15 µg/mL par un traitement de 72 h. En contraste, la morphologie cellulaire dans les groupes traités avec des NP vieillies de 20 nm et 90-200 nm (15 µg/mL) n'était pas significativement affectée, et la plupart des cellules survivantes pouvaient adhérer et s'étaler, avec moins de la moitié de cellules mortes observées, révélant que les ZnO NP vieillies sont beaucoup moins cytotoxiques que les ZnO NP fraîches.

Les ZnO NP vieillies induisent une cytotoxicité plus faible que les NP fraîches

Pour étudier davantage la différence de cytotoxicité entre les ZnO NP fraîches et vieillies, nous avons examiné la viabilité cellulaire en utilisant des kits CCK-8. Comme montré dans la Fig. 3, l'incubation des cellules A_L avec des doses graduelles de ZnO NP fraîches et vieillies (allant de 0 à 20 µg/mL, 20 nm et 90-200 nm) pendant 24 h, 48 h ou 72 h a montré une diminution dose-dépendante de la viabilité cellulaire. Aucune cytotoxicité évidente n'était observée en traitant les cellules avec des ZnO NP ≤ 10 µg/mL. Lorsque le dosage de ZnO NP fraîches et vieillies était élevé à 12 et 15 µg/mL, la viabilité cellulaire montrait une tendance à la diminution temps-dépendante. Évidemment, la viabilité cellulaire dans les groupes traités avec des NP vieillies était significativement plus élevée que dans les groupes traités avec des NP fraîches. De plus, le traitement par ZnCl₂ compromettait aussi la viabilité cellulaire d'une manière dose- et temps-dépendante, alors que la cytotoxicité du ZnCl₂ était beaucoup moins que celle des ZnO NP fraîches et vieillies.

Le traitement par ZnO NP fraîches active les voies d'apoptose et surexprime les gènes apoptotiques

Pour dévoiler les mécanismes sous-jacents menant à la cytotoxicité plus faible des NP vieillies, nous avons analysé les données de séquençage d'ARN des ZnO NP fraîches et vieillies. Comme montré dans la Fig. 4A, B, après traitement avec des ZnO NP fraîches, la voie d'apoptose était activée dans les cellules Jurkat (p = 0,017) et les cellules HMDM (p = 0,041). Les gènes d'apoptose : ANXA1, CYLD, TNFSF10, IER3, CDKN1A, JUN, SAT1, PMAIP1, CD38 et ISG20 étaient significativement enrichis dans les cellules Jurkat traitées avec des ZnO NP fraîches. Les gènes d'apoptose : CD38, TNFRSF12A, CCNA1, BMP2, PPP2R5B, EREG, IFNGR1, CD44, CD14, GNA15, GCH1, TIMP1, BTG2, IL1B, IL1A, BTG3, BCL2L11, SC5D et SPTAN1 étaient significativement enrichis dans les cellules HMDM traitées avec des ZnO NP fraîches (Fig. 4C, D). Puisque les cellules Jurkat (cellules T lymphocytaires du sang périphérique) et les cellules HMDM (macrophages dérivés de monocytes humains) sont différents types de cellules, la façon dont elles déclenchent l'apoptose pourrait être différente. En somme, ces résultats montraient que l'exposition aux ZnO NP fraîches pouvait activer différentes voies d'apoptose dans divers types de cellules.

Les ZnO NP vieillies ne surexpriment pas les gènes apoptotiques comme les ZnO NP fraîches

Nos données de séquençage d'ARN des cellules A_L traitées avec des ZnO NP vieillies montraient que les voies de signalisation p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutathion, ErbB, HIF-1, Ocytocine et Jak-STAT étaient enrichies (Fig. 5A). Les gènes d'apoptose enrichis dans les cellules Jurkat et HMDM n'étaient pas significativement affectés dans les cellules traitées avec des ZnO NP vieillies (Fig. 5B). Pour confirmer davantage les résultats, nous avons testé l'expression des gènes apparentés par PCR en temps réel. Nous avons trouvé que certains des gènes d'apoptose : BMP2, PMAIP1, IL1α, CD69, CCNA1, CD38 et IL1β étaient indétectables dans les cellules A_L traitées avec des ZnO NP vieillies (données non montrées), probablement parce que la plupart de ces gènes sont exprimés dans les cellules du système immunitaire. Les autres gènes d'apoptose surexprimés (IL1α, IL1β et CD59) observés dans les groupes traités avec des ZnO NP fraîches n'étaient pas significativement changés dans les niveaux d'expression par le traitement avec des ZnO NP vieillies. Alors que MT1 qui sert de contrôle positif était significativement augmenté dans un niveau d'expression, l'expression de Caspase 3 n'était pas significativement changée (Fig. 5C). Ces données suggéraient que les ZnO NP vieillies, contrairement à leurs homologues fraîches, sont moins puissantes dans l'activation des gènes de la voie d'apoptose dans les cellules A_L.

Les ZnO NP fraîches mais pas vieillies augmentent le niveau d'expression de la protéine Caspase 3 activée

La détection de l'expression du gène Caspase 3 seule ne peut pas indiquer directement l'activation de la voie d'apoptose. Pour analyser davantage si le traitement par ZnO NP pouvait changer les niveaux de protéines apoptotiques, l'expression de la protéine Caspase 3 clivée, un biomarqueur couramment utilisé pour indiquer l'activation de l'apoptose cellulaire [27], a été examinée par analyse de Western blotting. Comme montré dans la Fig. 6, comparé au groupe témoin, le traitement par ZnO NP fraîches (20 nm) a augmenté le niveau cellulaire de protéine Caspase 3 clivée de 1,31 ± 0,023 fois, ce qui était significativement plus élevé que celui du groupe traité avec des ZnO NP vieillies de 20 nm (1,12 ± 0,039 fois). Lorsque la taille de particule des ZnO NP fraîches était augmentée à 90-200 nm, l'expression de la protéine Caspase 3 clivée induite par les NP fraîches était augmentée de 1,46 ± 0,078 fois, significativement plus grande que celle des NP vieillies (1,07 ± 0,075 fois). Ces données illustraient davantage la puissance plus élevée des ZnO NP fraîches dans l'induction de l'apoptose cellulaire, en comparaison avec leurs homologues vieillies.

Discussion

Les ZnO NP ont été rapportées pour subir une transformation physicochimique en Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ avec libération de Zn²⁺ pendant le processus de vieillissement naturel [23, 28]. Cependant, la cytotoxicité induite par les ZnO NP transformées (vieillies) et les mécanismes sous-jacents restent flous. Ici, pour dévoiler le mécanisme de cytotoxicité diverse entre les ZnO NP fraîches et vieillies, l'analyse de séquençage d'ARN et le test RT-PCR ont été conduits. Aussi, le Western blotting a été appliqué pour examiner le niveau de protéine de Caspase 3, l'exécuteur clé dans l'apoptose cellulaire.

Nos données montraient que les ZnO NP vieillies induisaient beaucoup moins de cytotoxicité que les ZnO NP fraîches dans les cellules A_L. La LC₁₀₀ des deux ZnO NP fraîches (90-200 nm et 20 nm) dans notre étude présente était inférieure à 15 µg/mL (Fig. 3), ce qui était cohérent avec les découvertes précédentes que la LC₁₀₀ des ZnO NP avec 19-36 nm vers NIH-3T3 ou cellules MSTO est d'environ 15 µg/mL [29]. Nous avons confirmé que les transformations environnementales des propriétés physicochimiques dans les NP peuvent dramatiquement altérer leur toxicité. Il a été rapporté que le processus de sulfuration des ZnO NP change leur charge, hydrophobicité et état d'agrégation, résultant dans l'adsorption de NP d'état sulfuré dans la salive humaine, la sueur et le liquide de lavage bronchoalvéolaire. Et la protéine adsorbée par les ZnO NP forme une couronne protéique spéciale, qui affecte son effet biologique [19]. Les phosphates largement présents dans les solutions physiologiques (tels que la salive) pourraient convertir les ZnO NP en ZnHPO₄ métastable et Zn₃(PO₄)₂ en environ 5-10 h et montraient une cytotoxicité aux cellules épithéliales du tractus digestif [20]. Ivask et al. ont prouvé l'occurrence de transformation complète des ZnO NP (≤ 3 µg/mL) dans le système d'exposition in vitro aux lymphocytes T humains (37 °C, milieu de culture cellulaire RPMI1640 contenant 10 % FBS pendant 24 h) en utilisant la spectroscopie d'absorption des rayons X par rayonnement synchrotron (XANES). Le spectre et la cytotoxicité des produits de transformation étaient cohérents avec ceux du ZnSO₄ [21]. Nos résultats ont révélé la toxicité dose- et temps-dépendante du ZnCl₂ sur les cellules A_L, où sa cytotoxicité est beaucoup plus faible que les ZnO NP fraîches et vieillies (Fig. 3). L'observation explique davantage la découverte que la cytotoxicité des ZnO NP fraîches n'est pas entièrement attribuée à ses Zn²⁺ libérés [30].

Notre étude précédente a aussi montré que les ZnO NP vieillies présentent une puissance plus élevée dans l'élucidation des ESP (espèces réactives de l'oxygène), ainsi qu'une capacité atténuée à tuer les cellules comparées aux ZnO NP fraîches [23]. Nous raisonnons que la cytotoxicité plus faible induite par les ZnO NP vieillies pourrait être plus tolérable dans les cellules mammaliennes. La présente étude des données de séquençage d'ARN a illustré que les gènes apoptotiques ont été surexprimés dans les cellules traitées avec des ZnO NP fraîches, où ils étaient beaucoup moins affectés dans les groupes traités avec des NP vieillies. IL1α et IL1β sont des membres de la famille de cytokines interleukine 1. La libération de IL1α et IL1β active l'apoptose partiellement dépendante de Caspase 8 [31]. CD69 code un membre de la superfamille des lectines calcium-dépendantes de récepteurs transmembranaires de type II. L'expression accrue de CD69 était associée à une expression accrue des marqueurs d'apoptose annexine V et CD95 (Fas) [32]. JUN est une sous-unité du facteur de transcription AP-1. L'activité accrue de JUN clive protéolytiquement l'alpha-fodrine, un substrat de l'enzyme de conversion de l'interleukine 1beta (ICE), et de la famille des protéases cystéine CED-3, ce qui cause davantage la mort cellulaire programmée [33]. L'expression accrue de ces gènes apoptotiques a révélé que les NP fraîches déclenchent l'apoptose de plusieurs façons différentes. Après l'élévation de ces expressions de gènes apoptotiques, les processus d'apoptose sont éventuellement exécutés par les protéines apoptotiques (Fig. 7). Caspase 3 est la protéase centrale pour divers scénarios apoptotiques ; la clivage de cette protéine est nécessaire pour activer les voies apoptotiques extrinsèques et intrinsèques [34, 35]. Par conséquent, la détection de caspase 3 clivée est une méthode courante pour identifier l'apoptose induite par une grande variété de signaux apoptotiques [36]. Nos données de Western blotting ont révélé que, pour les deux ZnO NP de 20 nm et 90-200 nm, l'exposition sous-létale n'a pas altéré le niveau de Pro caspase 3 dans tous les groupes de traitement. En contraste, la caspase 3 clivée était significativement élevée par le traitement avec des NP fraîches, où les NP vieillies montraient peu (sinon aucun) effets sur le niveau de caspase 3 clivée (Fig. 6). Combiné avec l'analyse d'expression d'ARN, nos résultats élucidaient clairement la puissance plus élevée des ZnO NP fraîches dans l'induction de l'apoptose cellulaire.

Conclusions

Dans la présente étude, la transformation physicochimique naturelle des ZnO NP dans l'eau ultrapure a été confirmée, et les variations de cytotoxicité induites par les NP fraîches et vieillies ont été investiguées. Nous nous sommes concentrés sur les données de séquençage d'ARN de nos cellules A_L traitées avec des ZnO NP vieillies et celles des NP fraîches de la base de données. Nous avons comparé ces voies de signalisation spécifiquement enrichies dans le groupe traité avec des NP vieillies, qui sont différentes de celles des groupes traités avec des NP fraîches ou du ZnCl₂. Nos données indiquaient que la cytotoxicité plus faible des ZnO NP vieillies est étroitement liée à sa capacité atténuée à induire l'apoptose, tandis que la régulation transcriptionnelle des multiples voies activées par les NP favorise l'établissement de l'homéostasie cellulaire dans les cellules mammaliennes.

Disponibilité des données et matériaux

Non applicable.

Abréviations

NP :

Nanopoudres

ZnO :

Oxyde de zinc

Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ :

Hydrozincite

Zn(OH)₂ :

Hydroxyde de zinc

ZnCl₂ :

Chlorure de zinc

ZnSO₄ :

Sulfure de zinc

ZnHPO₄ :

Phosphate d'hydrogène de zinc

Zn₃(PO₄)₂ :

Phosphate de zinc

A_L cellules :

Cellules hybrides humain-hamster

Cellules CHO :

Cellules d'ovaire de hamster chinois

Cellules Jurkat :

Cellules lymphocytaires T du sang périphérique

Cellules HMDM :

Macrophages dérivés de monocytes humains

Cellules NIH-3T3 :

Cellules embryonnaires de souris

Cellules MSTO :

Cellules de cancer du poumon humain

RPMI1640 :

Roswell Park Memorial Institute 1640

ICE :

Enzyme de conversion de l'interleukine 1beta

CED-3 :

Gène de mort de Caenorhabditis elegans

IL1α :

Interleukine 1alpha

IL1β :

Interleukine 1beta

ARNm :

Acide ribonucléique messager

ADNc :

Acide désoxyribonucléique complémentaire

FBS :

Sérum fœtal bovin

TEM :

Microscopie électronique à transmission

XRD :

Diffraction des rayons X

RT-PCR :

Réaction en chaîne par polymérase en temps réel

CPI :

Inventaire des produits de consommation en nanotechnologie

XANES :

Spectroscopie de structure d'absorption proche du bord par rayonnement synchrotron

RIPA :

Test d'immunoprécipitation radioactif

SDS-PAGE :

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

PVDF :

Fluorure de polyvinylidène

ECL :

Chimiluminescence amplifiée

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8