Développement d'un capteur précis de pH lysosomal utilisant des nanoparticules de SiO₂ auto-décomposables

Résumé

Le pH acide des lysosomes est étroitement lié à l'autophagie ; ainsi, la connaissance précise des changements de pH lysosomal donnera plus d'informations sur le processus et le statut d'autophagie. Jusqu'à présent, cependant, seuls des changements de pH dans une gamme relativement large pouvaient être indiqués, la détection exacte du pH lysosomal n'ayant jamais été réalisée. Dans notre étude, nous avons établi un indicateur de pH endo/lysosomal basé sur un système de nanoparticules de SiO₂ auto-décomposables avec des paramètres de synthèse spécifiques. Le bleu de méthylène (BM) concentré au centre dans les nanoparticules à structure creuse centrale a présenté une libération sensible en fonction des valeurs de pH de 4,0 à 4,8, qui est exactement la gamme de pH des lysosomes. La corrélation linéaire des valeurs de densité optique (DO) et des valeurs de pH a été établie, qui a été utilisée pour la détection du pH lysosomal dans 6 lignées cellulaires différentes. De plus, par ce système, nous avons réussi à détecter précisément les changements moyens de pH des lysosomes avant et après l'endocytose de nanoparticules de silicium mésoporeux noir (BPSi), clarifiant le mécanisme de la terminaison de l'autophagie après l'endocytose de BPSi. Ainsi, l'indicateur de pH luminal basé sur des nanoparticules auto-décomposables peut fournir une nouvelle méthodologie et stratégie pour mieux connaître le pH lysosomal, puis indiquer plus de détails sur le processus d'autophagie ou d'autres signalisations importantes sur les métabolismes.

Introduction

Les lysosomes servent de destination finale pour les macromolécules, où celles-ci sont dégradées par des enzymes hydrolytiques activées par un pH bas. Le pH acide des lysosomes maintenu par l'ATPase vacuolaire de type H⁺ (v-ATPase) qui pompe les protons du cytoplasme vers la lumière lysosomale vise à maintenir l'activité d'environ 60 types d'enzymes hydrolytiques. De plus, des rapports récents de la littérature ont révélé que le pH acide des lysosomes est étroitement lié à l'autophagie, de sorte que la connaissance précise des changements de pH lysosomal donnera plus d'informations sur le processus et le statut d'autophagie. Basé sur nos études et la revue de littérature, l'endocytose de nanoparticules chargées positivement par des amines augmentera probablement le changement de pH dans les endo/lysosomes, comme les nanoparticules décorées PEG avec amines primaires et secondaires ou certaines décorations hydrophiles sur la surface des particules.

L'augmentation du pH induite par l'endocytose de nanoparticules amines augmentera dramatiquement la localisation nucléaire du facteur de transcription EB (TFEB), résultant non seulement en une régulation transcriptionnelle positive de la voie, mais causant aussi une dysfonction lysosomale, aboutissant finalement au blocage du flux autophagique. Comme TFEB régule l'autophagie, et par conséquent, sa surexpression mène à une augmentation significative de la production d'autophagosomes dans les cellules cultivées.

Ainsi, afin de prédire le processus d'autophagie et les détails de l'autophagie, la mesure précise du pH lysosomal et de son changement est très cruciale. Jusqu'à présent, d'après les revues de littérature sur l'indication de la valeur de pH endo/lysosomal et les produits commerciaux pour détecter les valeurs de pH endo/lysosomal, seuls des changements de pH dans une gamme relativement large pouvaient être indiqués, et la détection exacte du pH lysosomal n'a jamais été réalisée. Ainsi, pour connaître les détails profonds de l'autophagie, l'établissement d'une méthode de détection précise du changement de pH luminal est une approche importante.

Basé sur nos expériences précédentes sur les nanoparticules de SiO₂ auto-décomposables, dans cette étude, nous avons établi un indicateur de pH précis qui pourrait réaliser la détection des changements de pH luminal. Les nanoparticules de SiO₂ ont de bons avantages en taille ajustable et biocompatibilité. En définissant des paramètres de synthèse spécifiques, l'indicateur de pH auto-décomposable SiO₂ établi pouvait libérer de manière sensible la charge bleu de méthylène (BM) dans le pH 4,0–4,8, qui est exactement la gamme de pH des lysosomes. De plus, la libération du BM présentait une corrélation linéaire avec les changements de valeur de pH (schéma 1). Ensuite, nous avons testé la faisabilité de l'indicateur de pH au niveau cellulaire en introduisant 6 lignées cellulaires différentes, réussissant à déterminer les changements moyens de pH des lysosomes avant et après l'endocytose de NP de silicium mésoporeux noir (BPSi), clarifiant le mécanisme de la terminaison de l'autophagie après l'endocytose de BPSi. Ainsi, l'indicateur de pH luminal basé sur des nanoparticules auto-décomposables peut fournir une nouvelle méthodologie et stratégie pour mieux connaître le pH lysosomal, puis indiquer plus de détails sur le processus d'autophagie ou d'autres signalisations importantes sur le métabolisme.

Illustration schématique de la mesure du pH lysosomal par MB@SiO₂ dans les cellules vivantes.

Matériaux et méthodes

Section matériaux

Le silicure de sodium (NaSi) et les wafers Si (diamètre 20 cm, p+ (100), 0,01–0,02 Ω cm) ont été fournis par SiGNa Chemistry Inc. et Ocmetic Inc. respectivement. Bromure d'ammonium (NH₄Br, 99 %), bromure de sodium (NaBr, 99 %), toluène (anhydre, 99,8 %), acide chlorhydrique (HCl, 37 %), BM, et orthosilicate de tétraéthyle (TEOS) ont été achetés chez Sigma-Aldrich. Méthoxy-PEG-silane 0,5 kDa et 2 kDa ont été achetés chez Fluorochem Ltd. et Laysan Bio Inc. séparément. Le milieu RPMI 1640 a été fourni par Life Technologies. Le sérum bovin fœtal (FBS) a été acheté chez TianHang biological technology. Bicarbonate de sodium, sulfate de streptomycine, pénicilline G, HEPES, Solution de lysozyme, CellLight Early-endosomes-GFP, LysoTracker™ Red DND-99, Kit Pierce® BCA Protein Assay, chimiluminescence améliorée, conjugué pHrodo™ Red Transferrin, Solution Live Cell Imaging, et réactif Trizol ont été achetés chez Thermo Fisher Scientific. Éthanol et eau ammoniacale ont été fournis par Sinopharm. Kit BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis a été acheté chez Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd. Lysat RIPA a été acheté chez Heart Biological Technology Co., Ltd. Anticorps P62, TFEB et β-actine ont été achetés chez Proteintech Group, Inc. Anticorps LC 3B a été fourni par Abcam. 2-(4-Pyridyl)-5-((4-(2-diméthylaminoéthyl-aminocarbamoyl) méthoxy) phényl) oxazole (PDMPO) a été fourni par Yeasen Biotech Co., Ltd.

Objectif, conception et cadre de l'étude

Le but de cette étude est (1) d'explorer l'influence des nanoparticules BPSi sur l'autophagie dans les cellules HepG2, (2) de découvrir le mécanisme sous-jacent des changements de valeur de pH lysosomal affectant l'autophagie, (3) d'établir un indicateur précis de pH lysosomal qui pourrait mesurer le pH des lysosomes précisément, et finalement, (4) d'indiquer l'influence de la fluctuation de pH sur l'autophagie. Afin de réaliser le but d'étude ci-dessus, nous avons employé l'expérience de séquençage du transcriptome pour explorer les changements de gènes du transcriptome dans les cellules HepG2 après alimentation en nanoparticules BPSi et l'avons vérifié par RT-qPCR et expériences Western. Des colorants fluorescents tels que PDMPO ont été utilisés pour mesurer le changement de pH lysosomal dans les cellules HepG2 après alimentation en BPSi. Pour mesurer le pH des lysosomes précisément, nous avons développé des nanoparticules MB@SiO₂ avec 10 paramètres et testé les caractérisations de ces 10 types de nanoparticules par des expériences telles que DLS et HR-TEM. L'efficacité de chargement du BM et l'étude de cinétique de libération des 10 systèmes de nanoparticules auto-décomposables en série ont été testées dans différentes solutions de pH et cellules HepG2. Pour vérifier la localisation intracellulaire des nanoparticules après entrée dans la cellule, nous avons fait l'expérience TEM cellulaire et microscopie confocale sur cellules vivantes. Finalement, nous avons mesuré les changements de pH lysosomal dans 6 types de cellules après alimentation en BPSi pour vérifier l'universalité des nanoparticules MB@SiO₂ pour mesurer les changements de pH lysosomal.

Synthèse des nanoparticules BPSi

Les nanoparticules BPSi ont été préparées par notre méthode précédente et fournies par notre collaborateur (Wujun Xu, Département de Physique Appliquée, Université de Finlande Orientale). La préparation de BPSi, NaSi, sel d'ammonium et NaBr (NaSi : NH₄Br : NaBr de 1:4:4, p/p/p) a été broyée dans une boîte à gants sous atmosphère Ar. Elles ont été laissées réagir dans un four tubulaire sous atmosphère N₂ à 240 °C pendant 5 h (Éq. 1). Après refroidissement à température ambiante, les microparticules obtenues ont été purifiées par rinçage avec des solutions 0,5 M HCl et 1,0 M HF séparément. Les microparticules ont été broyées à billes dans l'éthanol à 1000 tr/min pendant 15 min, et les nanoparticules BPSi avec le diamètre souhaité ont été collectées en ajustant la vitesse de centrifugation.

NaSi + NH₄Br → NaBr + NH₃ + Si/H + H₂ (1)

Par l'expérience de Diffusion Dynamique de la Lumière, la distribution de diamètre et la charge de surface des nanoparticules ont été étudiées. Toutes les NP étaient dispersées dans le milieu après stérilisation par ultrasons léger (5 s pour les disperser uniformément dans la solution, Nettoyeur ultrasons SB-5200DT, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.) juste avant leur introduction aux cellules.

Établissement du système de nanoparticules auto-décomposables en 10 séries

Les 10 séries de nanoparticules auto-décomposables ont été synthétisées par les méthodologies que nous avons rapportées auparavant, avec paramètres modifiés. Dans une procédure typique, une certaine quantité de BM a d'abord été ajoutée à un mélange d'éthanol (75 mL) avec solution d'eau ammoniacale (25 %, 3,4 mL), après quoi une certaine quantité de TEOS a été ajoutée. Les NP MB@SiO₂ de séries auto-décomposables ont été obtenues après agitation pendant 24 h et lavées 3 fois avant séchage. Les quantités de BM et TEOS ajoutées dans les protocoles étaient comme décrites dans le Tableau 1. La signification de 1,0/100 dans les NP₁,₀/₁₀₀ représentait l'inventaire de BM et TEOS lors de la synthèse des nanoparticules, avec 1,0 mg de BM et 100 μL de TEOS. Et les significations de 1,5/100 dans les NP₁,₅/₁₀₀ et autres sont cohérentes avec celle de 1,0/100.

Culture cellulaire

Afin de tester l'efficacité et l'universalité de l'indicateur de pH basé sur les nanoparticules auto-décomposables, nous avons essayé de le tester sur des lignées cellulaires cancéreuses spécifiques dérivées de tumeurs. Ainsi, nous avons sélectionné des lignées de cancer du foie, poumon, côlon et mélanocytome comme objets de recherche. Les lignées cellulaires de cellules de cancer du côlon humain HCT116, HCT8 et HCT15 ; cellules de cancer du foie humain HepG-2 ; cellules de cancer du poumon humain A549 ; et cellules de mélanome de souris B16 étaient maintenues en milieu RPMI 1640 (Life Technologies) supplémenté avec 10 % FBS inactivé par la chaleur, 2,0 g/L bicarbonate de sodium, 0,1 g/L sulfate de streptomycine, 0,06 g/L pénicilline G, et 5,958 g/L HEPES. Les cellules étaient maintenues dans un incubateur standard de culture cellulaire à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % CO₂.

Caractérisation des 10 systèmes de nanoparticules auto-décomposables en série

La morphologie de toutes les séries de nanoparticules a été caractérisée par HR-TEM en mode STEM, et le cartographie du Si a été étudiée par cartographie élémentaire EDS. L'analyse de distribution de taille des nanoparticules a été réalisée par logiciel ImageJ en calculant les diamètres des nanoparticules dans des images STEM sélectionnées aléatoirement. Le potentiel zêta des nanoparticules et l'indice de polydispersité (PDI) ont été mesurés par l'étude de diffusion dynamique de la lumière (DLS) dans des tampons de série avec des valeurs de pH spécifiques. Les données ont été analysées par SPSS15.0 et les résultats statistiques présentés comme moyenne ± ÉT.

Étude de l'efficacité de chargement et de la cinétique de libération du BM des 10 systèmes de nanoparticules auto-décomposables en série

Afin d'étudier l'efficacité de chargement et la cinétique de libération du BM, la courbe standard du BM en concentrations de série a d'abord été établie. L'absorption du BM a été réalisée par spectre UV-Vis avec l'absorbance à 660 nm, qui est le λmax du monomère BM. L'efficacité de chargement du BM a été calculée par l'équation ci-dessous, Efficacité de chargement BM (%) = quantité de BM encapsulée / (quantité totale de BM entrée).

La libération du BM des 10 séries de nanoparticules a été étudiée dans l'eau pure et tampons de pH avec différentes valeurs de pH (pH 4,0, pH 6,86 et pH 9,18) et Solution de Lysozyme (Thermo Scientific™ #90082). De plus, la cinétique de libération du BM après une durée spécifique dans différents tampons de pH a aussi été investiguée. Les valeurs DO à 660 nm et les pourcentages de libération du BM en fonction du temps ont alors été étudiés.

Plus en détail, les études de libération du BM ont été réalisées par les protocoles ci-dessous ; dissous les 10 séries de nanoparticules dans 15 mL de tampon standard de pH 4,0, 6,86 et 9,18 avec solution lysosomale respectivement ; et effectuée la libération du BM dans un mélangeur Hula à 37 °C. Pendant les 15 jours suivants, 1 mL de chaque échantillon a été collecté, puis centrifugé à 12000 tr/min pendant 10 min. Le surnageant et le précipité ont été mesurés pour leurs spectres d'absorption à 200–800 nm.

De plus, la libération du BM dans des tampons de pH précis avec solution de lysozyme dans la gamme de pH 4,1 à 5,5 a aussi été investiguée avec les mêmes protocoles ci-dessus. Des durées temporelles spécifiques (6 h, 12 h et 24 h) ont été placées comme points d'observation. Les absorptions à 660 nm ont été enregistrées dans chaque échantillon. La relation linéaire de l'absorption de chaque solution de pH et la somme des carrés des résidus ont été comptées à chaque point temporel, respectivement.

Pour détecter les profils de libération du BM dans les cellules, les cellules HepG-2 ont été cultivées dans un flacon de culture de 75 cm² et nourries avec NP (300 μg/mL) lorsque les cellules proliféraient à 70 % du flacon. Toutes les 30 min plus tard, les cellules étaient collectées. Les cellules étaient répétitivement gelées et dégelées pour libérer complètement le BM dans les cellules. Les lysats cellulaires étaient centrifugés à 12000 tr/min pendant 10 min. Le surnageant était obtenu et son absorbance mesurée à 660 nm pour calculrer la quantité totale de BM libéré. Dans cette étude, les cellules HepG2 ont été choisies comme objets de recherche, en raison de leur prolifération cellulaire rapide qui pouvait minimiser la variance parmi tous les 10 groupes testés.

Colocalisation cellulaire des 10 séries de nanoparticules et performance de libération dans 6 lignées cellulaires différentes

La TEM cellulaire a été employée pour étudier la colocalisation de la nanoparticule dans les endo/lysosomes suivant les protocoles standards de TEM cellulaire. Les cellules étaient ensemencées à l'intensité de 1 × 10⁶ cellules/flacon et incubées pendant 24 h, permettant l'attachement cellulaire. Dix séries de nanoparticules dans le milieu avec la même concentration (100 μg/mL) étaient incubées avec les cellules pendant 12 et 24 h respectivement. Les cellules étaient alors lavées par PBS 3 fois pour éliminer les nanoparticules en excès, puis fixées dans une solution de glutaraldéhyde 2,5 % pendant plus d'un jour. Les cellules fixées étaient alors lavées et colorées par tétroxyde d'osmium, 1 % dans l'eau déionisée pendant 1 h, suivies de lavage avec PBS 3 fois et eau DI 2 fois. Le protocole classique de TEM cellulaire a été réalisé ensuite, et des sections d'épaisseur 90 nm ont été collectées pour observation TEM. La libération du BM en fonction des valeurs de pH a été étudiée dans 6 lignées cellulaires avec NP₆/₁₀₀ et NP₇,₅/₈₀. Aussi, les valeurs DO de la libération du BM et les pourcentages de libération du BM étaient enregistrés pour l'analyse de données.

Investigation de l'internalisation intracellulaire des nanoparticules MB@SiO₂

La microscopie confocale sur cellules vivantes a été utilisée pour évaluer l'internalisation cellulaire et le devenir intracellulaire des nanoparticules MB@SiO₂. Les endosomes précoces des cellules HepG-2 étaient colorés (CellLight Early-endosomes-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific C10586, avec excitation/émission ~ 488/510 nm) pendant 16 h. Et puis les cellules étaient incubées avec NP₆/₁₀₀ (excitation/émission BM : 640/650–700 nm) à la concentration de nanoparticules de 100 μg/mL à des intervalles temporels spécifiques (2 h, 2,5 h, 3 h, 5 h et 6 h). Avant la prise d'images, le lysotracker était coloré avec LysoTracker™ Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific L7528, excitation/émission : 577/590 nm) pendant 40 min. Après cela, enlever la solution de coloration et laver les cellules 2–3 fois dans PBS. Les images étaient prises en utilisant un Microscope Confocal Nikon A1R.

Séquençage du transcriptome pour évaluer le changement d'expression génique après alimentation BPSi

L'extraction d'ARN total du groupe contrôle et groupe traité BPSi a été réalisée en utilisant le réactif Trizol suivant les procédures opératoires standard. La qualité de l'échantillon d'ARN total initial pour l'expérience de séquençage a été détectée en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop ND-2000. L'ARN total ayant passé le contrôle de qualité a été utilisé dans les expériences de séquençage subséquentes. Une comparaison de l'expression génique a été réalisée par séquençage de nouvelle génération. Tous les programmes de séquençage ont été réalisés par BGI-Shenzhen Corporation (Shenzhen, Chine) en utilisant la plateforme BGISEQ-500. Les données brutes obtenues par séquençage sont soumises à un contrôle de qualité pour déterminer si les données de séquençage sont appropriées pour l'analyse subséquente. Si passé, effectuer l'analyse quantitative des gènes basée sur les niveaux d'expression génique et effectuer l'analyse d'enrichissement significatif des fonctions ontologie des gènes (GO) sur les gènes différentiellement exprimés entre les échantillons sélectionnés.

Essai RT-qPCR pour confirmer l'activation du réseau génique TFEB-CLEAR

L'ARN total a été extrait des cellules HepG-2 cultivées des groupes contrôle et traités BPSi en utilisant le réactif Trizol et rétro-transcrit en cDNA en utilisant le Kit BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis (Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd.) avec amorces aléatoires. Le cDNA a été utilisé pour amplifier le réseau génique TFEB-CLEAR par PCR quantitative avec le système Applied Biosystems™ 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) avec l'actine comme contrôle de référence. Les amorces utilisées pour RT-PCR quantitative étaient listées dans le Tableau S4.

Essai Western Blot pour confirmer que l'autophagie est activée après alimentation BPSi

Les protéines cellulaires du groupe contrôle et groupes traités BPSi à différentes concentrations ont été extraites par lysat RIPA (Heart Biological Technology Co., Ltd.). L'inhibiteur de protéase a été ajouté au lysat RIPA et pré-refroidi sur glace. Lavé les cellules 3 fois par PBS pré-refroidi. Vidangé le liquide complètement et placé la boîte en glace pendant 2 min. Quatre cents microlitres de lysat RIPA ont été ajoutés à la surface de toute la boîte, pipetés plusieurs fois avec une pipette, et incubés sur glace pendant 30 min, pendant laquelle la boîte a été secouée plusieurs fois pour lyser complètement les cellules. Le fluide cellulaire lysé a été transféré dans des tubes Eppendorf 1 ml et centrifugé à 13 000 tr/min pendant 10 min, 4 °C. Le surnageant obtenu a été bouilli dans l'eau pendant 10 min et placé à –20 °C pour usage ultérieur. La concentration en protéines a été quantifiée en utilisant le Kit Pierce® BCA Protein Assay (Thermo scientific).

Les extraits cellulaires contenant 25 μg protéines totales ont été directement soumis à SDS-PAGE et transférés. Les membranes ont été bloquées avec 5 % lait écrémé et sondées avec des anticorps primaires reconnaissant P62 (Proteintech #18420–1-AP), TFEB (Proteintech #13372–1-AP), LC 3B (Abcam #ab192890), et β-actine (Proteintech #20536–1-AP). Les anticorps secondaires ont été choisis selon l'espèce d'origine des anticorps primaires et détectés par chimiluminescence améliorée (Pierce) ou en utilisant le Système Bio-Rad ChemiDoc XRS + Gel Imaging (Bio-Rad, USA). L'intensité de bande normalisée de P62, TFEB et LC 3B relative à β-actine a été quantifiée par densitométrie utilisant le logiciel ImageJ dans les groupes BPSi, et les données sont la moyenne ± ÉT de trois expériences indépendantes.

Mesure du pH cellulaire par PDMPO et conjugué pHrodo™ Red Transferrin par microscopie confocale

Étude PDMPO

1 × 10⁵ cellules HepG-2 étaient cultivées sur plaques confocales stériles pendant la nuit et les nanoparticules BPSi étaient nourries avec une concentration de 100 μg/mL. Le lendemain, avant la coloration immunofluorescence, les lames étaient lavées trois fois avec du tampon phosphate salin (PBS) 0,01 M, pH 7,4, puis ajouté 1 μM colorant PDMPO (Ex/Em = 329/440). Après lavage avec PBS trois fois, les cellules étaient incubées avec du milieu de culture RPMI-1640 frais et observées sous un microscope à fluorescence (Nikon A1R, Japon) avec une caméra CCD et photos prises dans les 5 min, et le rapport d'intensité de fluorescence bleue et verte dans les lysosomes était alors calculé selon la procédure de Chen et al.

Étude du conjugué pHrodo™ Red Transferrin

Les cellules HepG-2 étaient plaquées dans des plaques confocales de la même manière pour l'attachement cellulaire pendant 24 h, puis gardées sur glace pendant 10 min. Lavage des cellules avec Live Cell Imaging Solution froide contenant 20 mM glucose et 1 % BSA. Ajout du conjugué pHrodo™ Red Transferrin (Ex/Em = 560/585 nm) à 25 μg/mL dans Live Cell Imaging Solution et incubation à 37 °C pendant 20 min, puis lavage des cellules dans Live Cell Imaging Solution. L'observation était aussi réalisée par microscopie confocale. L'analyse quantitative de l'intensité des images de microscopie était réalisée par logiciel ImageJ.

Détection du pH lysosomal cellulaire

Les cellules A549, HepG-2, HCT8, HCT15, HCT116 et B16 étaient cultivées dans un flacon de culture de 75 cm² et nourries avec NP lorsque les cellules proliféraient à 70 % du flacon, et 6 h plus tard, les cellules étaient collectées. Les cellules étaient répétitivement gelées et dégelées pour libérer complètement le BM dans les cellules. Les lysats cellulaires étaient centrifugés à 12000 tr/min pendant 10 min. Le surnageant était obtenu et son absorbance mesurée à 660 nm pour calculer la quantité totale de BM libéré. L'absorbance des NP₆,₀/₁₀₀ à un pH standard était comparée pour obtenir la valeur de pH de chaque cellule.

Analyse statistique

L'analyse statistique a été faite avec le logiciel SPSS15.0 en utilisant une analyse de variance (ANOVA) bidirectionnelle pour groupes indépendants et en utilisant la méthode Tukey HSD pour le test de comparaisons multiples. La signification statistique était basée sur une valeur de P < 0,05.

Résultats et discussion

Nous avons d'abord détecté l'expression différentielle des gènes lorsque les cellules étaient nourries avec les nanoparticules de silice poreuse noire à double fonctionnalisation PEG (NP BPSi) (offertes par notre laboratoire collaborateur). Le changement du potentiel zêta de –18,5 à +2,8 mV indiquait aussi que la double-PEGylation de surface était réussie (Figure S1a). Le diamètre moyen des nanoparticules BPSi était de 156 nm (Figure S1b). Basé sur la carte thermique de cluster de l'expression différentielle des gènes (Figure S2), nous avons sélectionné les expressions différentielles de plus de 2 fois pour investigation plus approfondie. GO et KEGG ont été introduits pour analyser les gènes différentiels. Des cartes à bulles d'enrichissement GO (Figure 1a), les gènes associés au métabolisme et aux lysosomes incluant l'assemblage phagolysosomal, la phagocytose et le processus métabolique xénobiotique ont été sélectionnés pour analyse plus approfondie. Notamment, les expressions géniques associées TFEB-CLEAR étaient significativement augmentées. Les résultats RT-PCR (Figure 1b) ont aussi vérifié les résultats du séquençage génique, les gènes sur la voie TFEB-coordonnée d'expression lysosomale et de régulation (CLEAR) ont significativement augmenté, tels que CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2 et TPP1. Ces gènes ont été marqués sur la voie lysosomale, comme montré Figure S3. Leur expression est plus élevée que celle du groupe contrôle et a une signification statistique (P_BPSi VS Contrôle < 0,05). Et TFEB régule positivement l'expression des gènes lysosomaux, contrôle la population lysosomale et favorise la dégradation cellulaire des substrats lysosomaux.

L'autophagie est activée dans les cellules HepG-2 après alimentation BPSi. a Carte à bulles d'enrichissement GO des gènes différentiellement exprimés trouvés par séquençage du transcriptome. b Vérification des changements géniques dans le réseau génique TFEB-CLEAR après traitement BPSi par expériences RT-qPCR. c Expression des protéines P62, TFEB, LC3B II/I après traitement BPSi. d Intensité de bande grise normalisée de P62, TFEB, LC3B II/I protéines dans les groupes traités BPSi selon le groupe contrôle. Données présentées comme moyenne ± ÉT.

De plus, TFEB régule l'autophagie, et sa surexpression mène à une augmentation significative de la production d'autophagosomes dans les cellules cultivées car la fonction majeure du gène TFEB est d'induire la biosynthèse de lysosome et de promouvoir l'occurrence d'autophagie. L'analyse Western blot a aussi été employée pour témoigner si l'autophagie se produisait lorsque les cellules étaient nourries avec NP BPSi. Le but du test Western était de confirmer davantage que l'expression de TFEB était augmentée et l'occurrence d'autophagie cellulaire après alimentation BPSi. Les protéines LC3B et P62 sont toutes deux des marqueurs d'autophagie. Lorsque l'autophagie se produit, l'expression de la protéine microtubule-associée 1A/1B-light chain 3B (LC3B) II/I augmente. P62 est un récepteur pour vésicules qui seront dégradées par autophagie et est aussi un récepteur pour agrégats de protéines ubiquitinéées à éliminer, et son expression diminue lorsque l'autophagie se produit. Donc nous mesurons l'expression de ces protéines dans l'expérience Western.

D'après les résultats Western blot montrés Figure 1c, d, TFEB (P_80 μg/ml VS contrôle = 0,000008), LC3B II/I (P_80 μg/ml VS contrôle = 0,000297), et p62 (P_80 μg/ml VS contrôle = 0,000016) protéines étaient toutes significativement régulées positivement. Comme la régulation positive de TFEB et LC3B II/I indiquant l'activation de l'autophagie, nous soupçonnions que l'endocytose BPSi promouvait l'occurrence d'autophagie. Cependant, la protéine p62 est supposée être régulée négativement pendant le processus d'autophagie, due à sa nature de protéine porteuse qui amène les endosomes aux lysosomes et finalement dégradée. Dans notre étude, la régulation positive significative de p62 indiquait la terminaison de la dégradation pendant le processus de fusion endo-lysosome, ce qui était probablement causé par l'augmentation du pH dans les vésicules endo/lysosomes. Ainsi, l'endocytose BPSi peut d'abord induire l'occurrence d'autophagie, puis inhiber le processus d'autophagie en augmentant les valeurs de pH endo/lysosomales, en raison de son alcalinité d'amide.

Afin de témoigner les caractéristiques d'augmentation de pH dans les endo/lysosomes par endocytose BPSi, deux sondes fluorescentes de pH commerciales ont été employées dans notre étude, pHrodo™ Red Transferrin Conjugate (Thermo Fisher #P35376), et RatioWorks™ PDMPO.

pHrodo™ Red comme indicateur commercial de pH intracellulaire présente généralement une fluorescence faible à pH neutre mais une fluorescence croissante quand le pH chute. Il était supposé quantifier le pH cytosolique cellulaire dans la gamme 9–4 avec un pKa de ~6,5 avec excitation/émission de 560/585 nm. Nous pouvions obtenir une conclusion d'analyse qualitative à partir des déterminations de 6 lignées cellulaires que l'endocytose de NP BPSi a la capacité d'augmenter les valeurs de pH dans les endo/lysosomes, due à l'affaiblissement des signaux fluorescents rouges (Figure S4 et S5). Cependant, après répétition des expériences plusieurs fois suivant les protocoles d'opération du produit, nous pouvions difficilement analyser quantitativement la valeur exacte de pH qui diminuait parmi différentes lignées cellulaires avant ou après alimentation avec NP BPSi en raison de l'absence de corrélation entre l'intensité et les valeurs de pH établie.

PDMPO a alors été employé comme meilleure solution pour indiquer les changements de valeur de pH après endocytose BPSi, qui introduit les techniques d'imagerie de ratio dans la mesure quantitative de pH. PDMPO [2-(4-pyridyl)-5-((4-(2-diméthylaminoéthyl-aminocarbamoyl) méthoxy) phényl) oxazole] est caractérisé comme sonde de pH acido-trope à double excitation et double émission. Il émet une fluorescence verte intense à pH bas et donne une fluorescence bleue intense à pH haut. Cette fluorescence unique dépendante du pH fait de PDMPO une sonde de pH idéale pour organelles acides avec pKa = 4,47. PDMPO étiquette sélectivement les organelles acides (tels que lysosomes) de cellules vivantes et les deux pics d'émission distincts peuvent être utilisés pour surveiller les fluctuations de pH de cellules vivantes en mesures de ratio. Cependant, nous avons encore échoué à mesurer les valeurs de pH dans 6 lignées cellulaires avant et après alimentation BPSi. Comme les résultats montrés Figure S6, aucune différence significative n'a été observée dans toutes les 6 lignées cellulaires avant et après alimentation BPSi. Bien qu'une corrélation ait été établie entre le Ratio Bleu/Vert et les valeurs de pH (Figure S7), la corrélation non-linéaire de pH 4–5 fait échouer la méthode PDMPO dans l'analyse quantitative des endo/lysosomes avant et après alimentations BPSi.

D'après les données des deux indicateurs de pH commerciaux ci-dessus, nous avons d'abord démontré notre suspicion que les nanoparticules décorées PEG avec amide sur la chaîne PEG pourraient faire augmenter le pH endo/lysosomal en raison de la nature alcaline de l'amide. Cependant, sans l'analyse quantitative des changements précis de pH (gamme 0,1 pH), nous ne pouvions toujours pas établir les corrélations entre le statut d'autophagie et les valeurs de pH endo/lysosomal, échouant ainsi dans la prédiction d'autophagie.

Basé sur notre étude précédente sur les nanoparticules auto-décomposables, nous avons maintenu la même concentration d'hydroxyde d'ammonium dans l'éthanol 75 %, mais ajusté les concentrations de BM et TEOS. Deux séries de quantité de TEOS ont été fixées à 100 μL et 80 μL, afin d'obtenir différentes épaisseurs de coquille et tailles de pores. Dix séries de quantité de BM ont été fixées pour obtenir différentes tailles de structure creuse centrale et efficacités de chargement BM.

Les quantités de BM et TEOS ajoutées dans les protocoles étaient comme décrites dans le Tableau 1 ci-dessous.

Comme montré Figure 2a, b, la taille des nanoparticules augmentait avec l'augmentation de la quantité de BM, dans les deux concentrations de TEOS (100 μL et 80 μL). À la même concentration de BM, la taille des particules augmentait avec l'augmentation de la quantité de TEOS. De plus, avec l'augmentation de la quantité de TEOS, l'épaisseur de la coquille augmentait, ce qui a été prouvé par le cartographie élémentaire (montré Figure 2c). L'indice de polydispersité (PDI) et la charge de surface des nanoparticules sont montrés Figure S8 et Tableau S1. Les études de morphologie prédisaient qu'avec l'augmentation de la quantité de BM, l'efficacité de chargement augmentera, menant à un profil de libération plus rapide, tandis qu'avec l'augmentation de la quantité de TEOS, la libération ralentira. Et nous devons trouver la concentration appropriée de BM et TEOS, avec laquelle nous pourrions obtenir les systèmes de nanoparticules optimisés, que nous pourrions être capables de rendre le profil de libération du BM linéairement corrélé avec les changements de pH.

Caractérisation de morphologie de 10 nanoparticules auto-décomposables différentes avec quantité spécifique de BM ou TEOS. a Figures STEM. b Analyse de distribution de taille des nanoparticules. c Cartographie Si de 10 nanoparticules auto-décomposables. Barres d'échelle dans toutes les figures sont 100 nm. L'analyse de distribution de taille a été réalisée en choisissant aléatoirement 100 nanoparticules des figures STEM et mesurées par logiciel ImageJ. Données présentées comme moyenne ± ÉT.

L'efficacité de chargement du BM a été déterminée par spectre UV-Vis. La courbe standard (Figure S9) du BM a d'abord été tracée en utilisant des concentrations de série de solution BM (de 6,25 à 46,88 μg/mL), avec l'équation y = 67,63x + 0,10919, R² = 0,9987. Comme calculé avec l'équation ci-dessus, nous obtenons l'efficacité de chargement du BM de 10 nanoparticules auto-décomposables avec paramètres spécifiques, données détaillées montrées Figure S10.

Avant l'étude des profils de libération du BM dans différentes solutions de pH, les profils de libération dans l'eau pure ont été étudiés. Comme montré Figures S11 et S12, toutes les nanoparticules avec quantité de TEOS de 80 μL présentaient une libération de BM augmentée avec l'augmentation de la durée, ce qui se reflétait par l'absorption UV-Vis. De plus, avec l'augmentation de la quantité de BM encapsulée, la tendance de croissance de la libération de BM devient plus significative. Aussi, la vitesse de libération grandit plus vite. Cependant, quand la quantité de TEOS augmente à 100 μL, la surface des particules devient plus dense et la libération devient plus lente quand la quantité de BM est en dessous de 3,0 mg ; presque aucune tendance d'augmentation n'a pu être observée dans la libération de BM dans l'eau pendant 14 jours de libération. Aussi longtemps que la quantité de BM augmente au-dessus de 4,0 mg, une tendance d'augmentation évidente de la libération de BM pouvait être observée. Une chose à remarquer est que le paramètre de nanoparticules à la fois NP₇,₅/₈₀ et NP₆,₀/₁₀₀ présentaient une croissance solide à mesure que le temps s'allonge, montrant presque une tendance d'augmentation linéaire pendant les premiers 7 jours, puis atteignant le plateau.

Ensuite, nous nous sommes concentrés sur le comportement de libération du BM dans différents tampons de pH pour déterminer si les nanoparticules auto-décomposables avec paramètres spécifiques pouvaient avoir une libération de BM linéairement dépendante du pH.

Premièrement, nous avons réalisé les expériences de libération du BM à solution tampon pH 4,0. De Figure S13, nous pouvions facilement conclure qu'avec la même quantité de TEOS de 100 μL, la vitesse de libération du BM présentait une tendance similaire observée dans les 5 systèmes de nanoparticules de TEOS à 80 μL (Figure S14), la corrélation positive centrale avec la quantité de BM encapsulée.

Le BM concentré diffuse dans la solution environnante via diffusion due à la différence de concentration. Le gradient de concentration plus grand fait la libération de BM plus rapide. Comparé avec la libération du BM dans l'eau pure, nous avons trouvé que l'environnement acide accélérait la libération du BM (Figures S13 et S14 comparées aux Figures S11 et S12), indiquant que la libération du BM n'est pas seulement entraînée par la diffusion ; cependant, dans les solutions acides, la répulsion électrostatique est aussi une force motrice importante due à la nature de charge positive du BM. Nous avons alors calculé le pourcentage de libération de chaque paramètre de nanoparticules selon l'efficacité de chargement du BM, la courbe standard du BM et le rapport de dilution aux mesures. Le pourcentage de libération reflétait la vitesse de libération du BM en solution acide pH 4,0, et les résultats (Figure 3) montraient que seul le pourcentage de libération de NP₇,₅/₈₀ présentait une libération linéaire en solution pH 4,0. Les autres systèmes de nanoparticules avec paramètres spécifiques de BM et TEOS montraient des tendances de libération similaires, et le pourcentage de libération n'avait pas de croissance linéaire. Une exception est NP₆/₁₀₀, et la libération du BM a atteint le plateau en seulement 72 h ; ainsi, il était difficile de dire si la libération du BM pouvait croître linéairement avant cette durée à ce stade.

Pourcentage de libération du BM de 10 séries de nanoparticules auto-décomposables après une durée spécifique en tampon pH 4,0. Toutes les expériences étaient triplément répétées, et les données étaient montrées comme moyenne ± ÉT.

Pendant ce temps, nous avons testé les profils de libération du BM dans des tampons quasi-neutres et alcalins (pH 6,86 et pH 9,18). Les résultats dans Figures S15, S16, S17 et S18 démontrent que la libération du BM ralentissait avec l'augmentation du pH de la solution à 6,86 ; de plus, avec l'augmentation de la concentration centrale de BM, le pourcentage de libération du BM diminuait. À pH 9,18, toutes les nanoparticules avec 10 paramètres spécifiques présentaient une libération de BM très lente (Figures S19 et S20) ; peu importe en absorption UV-Vis ou pourcentage de libération, la tendance était similaire à celle dans le tampon pH 6,86, mais avec un pourcentage de libération encore plus bas. Donc, il était clair que les nanoparticules auto-décomposables ne présentaient une croissance linéaire de libération du BM que dans les solutions acides. Nous avons repensé au pH endo/lysosomal, de 4 à 5, qui est exactement la gamme de pH de la croissance linéaire du BM en fonction du temps dans un paramètre spécifique BM/TEOS. Ainsi, nous sommes plus confiants que le système de nanoparticules auto-décomposables peut être un outil de mesure précis pour déterminer quantitativement le pH moyen endo/lysosomal, puis fournir des preuves sur la valeur exacte de pH du statut d'autophagie.

La précondition d'utilisation des nanoparticules auto-décomposables spécifiques comme indicateur de pH endo/lysosomal est que les nanoparticules restent stables dans l'endo/lysosome pendant tout le processus de mesure. Deuxièmement, la libération du BM dans l'endo/lysosome doit se produire sans heurt lorsque la mesure est effectuée.

La colocalisation de la nanoparticule dans les endo/lysosomes par étude TEM cellulaire et la libération du BM dans 6 lignées cellulaires différentes ont été étudiées. D'après les résultats TEM cellulaires, toutes les 10 séries de nanoparticules restaient dans les endo/lysosomes sans s'échapper, après 24 h d'incubation avec les cellules HepG-2 (Figure 4). Puisque le diamètre des cellules HepG2 utilisées dans Figure 4 est d'environ 10–20 μm et le diamètre des nanoparticules MB@SiO₂ est entre 75 et 200 nm, il sera très difficile de clarifier les morphologies des nanoparticules en utilisant les images à faible grossissement (comme montré Figure S21). Nous avons aussi investigué la localisation intracellulaire des nanoparticules dans les 5 autres lignées cellulaires, et 4 nanoparticules ont été sélectionnées aléatoirement pour démontrer que les nanoparticules étaient piégées dans les endo/lysosomes (Figure S22). Les nanoparticules avec tous les paramètres montraient une structure creuse centrale dans toutes les 5 autres lignées cellulaires après 24 h d'incubation, indiquant la libération du BM. De plus, sous observation plus précise, nous avons remarqué que la libération du BM pouvait être différente due à différentes tailles de cavité, pointant vers le fait que (1) le pH endo/lysosomal dans différentes cellules est différent et (2) la libération du BM des nanoparticules est très sensible au pH endo/lysosomal, surtout pour NP₆/₁₀₀ et NP₇,₅/₈₀. De Figure S23, nous pouvons trouver que les nanoparticules ont déjà réalisé l'endocytose et sont restées dans les vésicules 2 h après l'alimentation en nanoparticules, puis les nanoparticules s'accumulaient graduellement dans les lysosomes.

Colocalisation de la nanoparticule dans les endo/lysosomes par étude TEM cellulaire après 12 et 24 h d'incubation avec les 10 séries de nanoparticules. La barre d'échelle est 200 nm dans les images TEM.

Nous avons ensuite évalué la corrélation entre les valeurs de pH et les valeurs DO dans pH 4,0–4,8. D'après les résultats Figure 5 et Figure S24, pour les systèmes de nanoparticules NP₆/₁₀₀ et NP₇,₅/₈₀, la libération du BM présentait une diminution linéaire en fonction du pH dans la gamme de pH 4,0 à 4,8.

Libération du BM en fonction des valeurs de pH dans NP₆/₁₀₀ et NP₇,₅/₈₀ après durée d'incubation spécifique, 6 h, 12 h et 24 h. Les équations de corrélation linéaire ont aussi été calculées pour 6 h et 12 h pour la libération du BM des NP₆/₁₀₀ et NP₇,₅/₈₀ en fonction des valeurs de pH. Toutes les expériences étaient triplément réalisées, et les données étaient montrées comme moyenne ± ÉT.

Nous avons ensuite converti la valeur DO en pourcentage de libération du BM selon l'efficacité de chargement du BM et la quantité d'alimentation. Comme montré Figure S25, dans les premières 6 h, le pourcentage de libération du BM dans les systèmes de nanoparticules NP₆/₁₀₀ et NP₇,₅/₈₀ présentait aussi en fonction des valeurs de pH. Nous avons alors calculé la somme des carrés des résidus et le coefficient de corrélation de Pearson à 6 h et 12 h de durée de libération, respectivement, comme la somme des carrés des résidus présente une corrélation négative avec la proximité de l'ajustement linéaire, tandis que plus la valeur absolue du coefficient de corrélation de Pearson est proche de 1, plus c'est linéaire. Comme montré Tableaux S2 et S3, le degré de linéarité le plus élevé est l'ajustement du système de nanoparticules NP₆,₀/₁₀₀, suivi par celui de NP₇,₅/₈₀ à 6 h de libération.

Jusqu'alors, nous étions si excités par les résultats que la méthode pour surveiller précisément les valeurs de pH a été établie, surtout avec une précision inférieure ou égale à 0,1 intervalle de valeur de pH. Cela signifie que nous avons de grandes possibilités de découvrir la corrélation entre les valeurs de pH endo/lysosomal et le statut d'autophagie, ce qui est d'une grande signification pour mieux étudier le mécanisme d'autophagie et prédire le processus d'autophagie. Comme nous pouvons voir Figure S26, la libération du BM dans les cellules HepG-2 a déjà atteint le plateau après incubation pendant 4 h. Ainsi, nous avons choisi 6 h comme point d'observation temporel.

Nous avons ensuite soigneusement investigué la libération du BM de NP₆,₀/₁₀₀ dans 6 lignées cellulaires dans la durée d'interaction nanoparticule-cellule de 6 h, incluant la lignée de cancer du foie HepG-2, lignées de cancer du côlon HCT8, HCT15 et HCT116, lignée de cancer du poumon A549, et lignée de cancer myélomélanocytaire B16.

Comme montré Tableau 2, nous différencions clairement les endo/lysosomes dans 6 lignées cellulaires cancéreuses, avec une précision à 0,01 valeurs de pH, ce qui est impossible à faire avec les kits commerciaux d'indicateur de pH intraoculaire.

De plus, nous avons réévalué les valeurs de pH dans les endo/lysosomes des cellules HepG2 avant et après culture avec nanoparticules BPSi. Nous avons conclu que l'internalisation BPSi augmentait significativement les valeurs de pH endo/lysosomales, de 4,70 ± 0,09 à 5,59 ± 0,05, illustrant parfaitement la raison pour laquelle l'internalisation BPsi induisait l'autophagie initialement puis terminait le flux d'autophagie. L'internalisation intracellulaire de BPSi fait augmenter les quantités d'endo/lysosomes, ce qui était cohérent avec les résultats du séquençage génique, que les gènes liés à l'autophagie (TFEB-CLEAR) étaient activés. Pendant ce temps, la terminaison de l'autophagie par les valeurs de pH augmentées dans les endo/lysosomes coïncide aussi avec les résultats de régulation positive des protéines p62 dans l'étude Western blot.

Discussion

Les nanoparticules peuvent généralement causer l'autophagie dans les cellules, et des études ont montré que la réponse autophagique aux nanoparticules présentant une surface neutre ou anionique implique une élimination accrue de la cargaison autophagique. L'exposition cellulaire aux nanoparticules présentant une surface cationique, d'autre part, résulte en une régulation transcriptionnelle positive de la voie TFEB, mais cause aussi une dysfonction lysosomale, aboutissant finalement au blocage du flux autophagique. Et nos résultats sont en accord avec ces conclusions précédentes. Dans notre étude, nous avons trouvé que l'expression des gènes et protéines liés à l'autophagie dans les cellules HepG2 a été augmentée après alimentation de NP BPSi par séquençage du transcriptome, RT-qPCR et expériences Western. Cependant, le niveau d'expression de la protéine P62 liée à l'autophagie ne diminue pas comme l'autophagie est activée. Nous suspectons que le PEG-amine sur la surface des NP BPSi augmente la valeur de pH du lysosome, résultant en l'inhibition de la dégradation P62. Les indicateurs de pH lysosomaux existants ne peuvent pas vérifier notre hypothèse. Pour mesurer avec précision le pH lysosomal de cellules vivantes, nous avons établi une nouvelle méthode pour la détermination qualitative du pH endo/lysosomal basée sur les systèmes de nanoparticules auto-décomposables. Dix systèmes de nanoparticules avec paramètres BM/TEOS spécifiques ont été employés pour obtenir une méthode de mesure optimisée répondant au pH de manière sensible. Le gradient de concentration radiale de BM de l'intérieur vers l'extérieur servait comme force motrice majeure pour la libération du BM. La libération du médicament se déroulait avec la décomposition simultanée du vecteur, qui était entraînée par un mécanisme contrôlé par diffusion. De plus, comme la valeur de pH diminue, la concentration en ions hydrogène augmente, et l'interaction électrostatique renforcée favorise le BM interne à se libérer plus vite que dans la solution neutre. Le système de nanoparticules creuses centrales optimisé pouvait libérer le BM concentré central comme une fonction linéaire de valeurs de pH précises dans la gamme pH 4,0–4,8, qui est exactement le pH des lysosomes. Finalement, par cet indicateur de pH qualitatif basé sur nanoparticules auto-décomposables, nous avons réussi la détection des valeurs moyennes de pH des lysosomes dans 6 lignées cellulaires. De plus, par ce système, nous pouvons qualifier les changements de pH des lysosomes avant et après l'endocytose de nanoparticules BPSi par cellules HepG-2, clarifiant le mécanisme de l'occurrence puis terminaison de l'autophagie après endocytose BPSi. Les systèmes de nanoparticules auto-décomposables ouvrent une voie toute neuve pour l'étude des valeurs de pH luminal, fournissant de nouveaux outils pour mieux connaître la signalisation cellulaire et le métabolisme, et puis fournissant de nouvelles voies et méthodes pour le traitement du cancer.

Conclusion

Dans cette étude, nous avons trouvé que BPSi peut promouvoir l'autophagie cellulaire par séquençage du transcriptome, mais les groupes aminés sur la surface des nanoparticules peuvent augmenter le pH du lysosome et inhiber la dégradation du flux autophagique. Ainsi, le pH lysosomal influence significativement les stades d'autophagie. Et l'acquisition précise de l'information de pH lysosomal promouvra la perception de l'autophagie. Cependant, les indicateurs fluorescents de pH lysosomal existants ne pouvaient déterminer qu'une large gamme de pH lysosomal ; ainsi, nous avons établi un indicateur précis de pH lysosomal basé sur le système d'auto-dissociation. En ajustant les paramètres de synthèse de MB@SiO₂, la libération du BM chargé sur les nanoparticules était linéairement et négativement corrélée avec le pH. Et les nanoparticules restent principalement dans le lysosome après entrée dans la cellule. En mesurant la quantité de BM libérée dans les cellules, la valeur de pH du lysosome peut être calculée exactement selon la fonction linéaire. L'indicateur de pH précis établi a fourni un outil et une méthodologie tout neufs pour étudier précisément les valeurs de pH lysosomal et acquérir plus d'informations sur l'autophagie.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données générées ou analysées pendant cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'information supplémentaires.

Abréviations

BPSi :

Silicium mésoporeux noir

FBS :

Sérum bovin fœtal

GO :

Ontologie des gènes

HCl :

Acide chlorhydrique

KEGG :

Encyclopédie de Kyoto des gènes et génomes

BM :

Bleu de méthylène

NaBr :

Bromure de sodium

NaSi :

Silicure de sodium

NH₄Br :

Bromure d'ammonium

NP :

Nanoparticules

DO :

Densité optique

PBS :

Tampon phosphate salin

PDMPO :

2-(4-Pyridyl)-5-((4-(2-diméthylaminoéthyl-aminocarbamoyl) méthoxy) phényl) oxazole

RT-qPCR :

Réaction de polymérisation en chaîne par transcription inverse quantitative

TEOS :

Orthosilicate de tétraéthyle