Synthèse verte de nanoparticules de métal et d'oxyde métallique et leur effet sur l'algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii

Contexte

Les nanoparticules de métal et d'oxyde métallique (NP) ont fait l'objet d'une attention considérable de la recherche en raison de leurs propriétés électriques, optiques, magnétiques et catalytiques exceptionnelles. Ceux-ci ont permis leur large utilisation dans diverses applications industrielles, médicales, agricoles et environnementales, avec d'autres utilisations constamment en développement [1,2,3,4]. Les méthodes de synthèse traditionnelles des NPs de métaux et d'oxydes métalliques vierges comprennent la réduction et la stabilisation d'agents chimiques toxiques pour les humains et pour d'autres espèces à différents niveaux trophiques [5,6,7,8,9,10,11]. En réponse, les chercheurs recherchent maintenant des approches alternatives de « synthèse verte » dans le but de réduire ou d'éliminer les produits chimiques nocifs lors de la production de NP [12,13,14,15,16,17,18].

De nombreuses études ont rendu compte de la large gamme d'applications des NP de métaux et d'oxydes métalliques, en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques et étendues [19]. Les NP d'argent (Ag), par exemple, sont largement utilisées pour les applications médicales, textiles, d'emballage alimentaire et de traitement de l'eau [20,21,22,23]. Les NP d'or (Au) ont été utilisées dans la recherche biomédicale, tandis que les NP de platine (Pt) sont largement utilisées pour des applications industrielles en raison de leurs propriétés catalytiques [24, 25]. Enfin, les NP de palladium (Pd) ont été utilisées comme catalyseurs lors de la fabrication de produits pharmaceutiques [26, 27] et les NP d'oxyde de cuivre (CuO) comme agents antisalissures dans les peintures et les tissus en raison de leurs propriétés antibactériennes prouvées [28]. Les NP métalliques peuvent servir de catalyseurs pour dégrader une grande variété de contaminants environnementaux courants, notamment les polychlorobiphényles (PCB), les aliphatiques halogénés, les pesticides organochlorés, les métaux toxiques et les solvants organiques halogénés [29]. Les NP CuO, Ag et Au sont également utilisées pour détecter les gaz toxiques, tels que le monoxyde de carbone (CO), le cyanure d'hydrogène (HCN) et le dioxyde de soufre (SO₂ ) [30, 31]. Récemment, un certain nombre de NP métalliques (Au, Ag et Cu) qui présentent une résonance plasmonique de surface localisée ont été utilisées dans le développement de bio-nanocapteurs [24].

Malheureusement, les NP de métaux et d'oxydes métalliques ont le potentiel d'avoir un impact négatif à la fois sur la santé humaine et l'environnement en général, par ex. en générant de nouvelles classes de toxines qui peuvent affecter négativement les communautés microbiennes, avec des effets d'entraînement pour l'ensemble de l'écosystème [32,33,34,35]. En conséquence, les effets des NP sur les micro-organismes ont été largement étudiés. Par exemple, il a été démontré que les Ag NP inhibent la croissance des algues et la photosynthèse, modifiant ainsi la chlorophylle (Chl ) teneur en fluorescence de Chlamydomonas reinhardtii [36], altérant la croissance cellulaire de Thalassiosira pseudonana et Synéchocoques sp. [37] et affectant la croissance et la viabilité cellulaire de la plante aquatique lentille d'eau gonflée Lemna gibba [38][b>. Książyk et al. [39] et Sørensen et al. [40] ont rapporté que les Pt NP inhibaient la croissance des microalgues d'eau douce Pseudokirchneriella subcapitata [39, 40]. Sans surprise, les NP Ag et Pd ont été appliquées comme agents antibactériens utiles contre une variété de bactéries Gram-positives et Gram-négatives [41,42,43]. En revanche, on pense que les NP Au n'ont pas d'impact négatif sur les bactéries ou les algues [44, 45], bien qu'une étude ait montré qu'elles peuvent être toxiques, en fonction de leur charge et de la chimie de surface [46]. Des impacts négatifs ont été signalés pour les NP CuO sur C. reinhardtii [36, 47], P. sous-capitaine [48], élodée occidentale Elodea nuttallii [49] lentille d'eau Lemna sp. , Daphnia magna [48] ​​et les premiers stades de la vie du poisson zèbre Danio rerio [50, 51].

Les NP métalliques possèdent des propriétés physiques et chimiques qui peuvent endommager les cellules, par ex. par la génération excessive d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) avec des dommages ultérieurs à l'ADN, aux protéines et aux lipides. La formation de ROS par les Ag NPs a été détectée chez Chlorella vulgaris et Dunaliella tertiolecta cultures et dans L. gibba [52], ainsi que chez les bactéries [53]. Les NP CuO et Fe sont toutes deux capables de générer des radicaux hydrogène, une famille de ROS produits via la réaction de Fenton, qui peuvent nuire à une variété d'organismes aquatiques et terrestres [54, 55].

La chimie verte est un ensemble de principes ou de pratiques qui encouragent la conception de produits et de procédés qui réduisent ou éliminent l'utilisation et la génération de substances dangereuses [56,57,58]. Les pratiques actuelles de nanotechnologie verte impliquent souvent l'utilisation de sources naturelles, de solvants non dangereux, de matériaux biodégradables et biocompatibles et de procédés économes en énergie dans la préparation des NP [59]. À titre d'exemple, les biopolymères, tels que la cellulose, le chitosane, le dextrane ou les gommes d'arbre, sont souvent utilisés comme agents réducteurs et stabilisants pour la synthèse des NP métalliques [12, 60, 61, 62]. La gomme karaya (GK) utilisée dans cette étude est une gomme d'arbre naturelle de Sterculia composé d'environ 13 à 26 % de galactose et 15 à 30 % de rhamnose, 30 à 43 % d'acide galacturonique, 37 % de résidus d'acide uronique et environ 8 % de groupes acétyle [63]. Des études toxicologiques ont prouvé que le GK était non toxique, permettant son utilisation même comme additif alimentaire [62,63,64,65].

Dans cette étude, nous avons cherché à utiliser une approche de chimie verte pour préparer un certain nombre de NP de métaux (Ag, Au, Pt, Pd) et d'oxydes métalliques (CuO) en utilisant des solutions aqueuses d'un polymère naturel, GK. L'effet biologique de ces NP nouvellement préparées a été étudié sur C. reinhardtii en utilisant une gamme de réponses cellulaires, y compris la croissance des algues, le stress oxydatif, les dommages membranaires, Chl fluorescence et photosynthèse. La stabilité, la taille et le potentiel zêta des NP ont été déterminés dans un milieu de croissance algale, ainsi que la solubilité et les tests abiotiques de la génération de ROS.

Méthodes

Matériaux

GK commercial, nitrate d'argent (AgNO₃ ), le tétrachloroaurate d'hydrogène (HAuCl₄ ·3H₂ O), chlorure de cuivre (CuCl₂ ·2H₂ O), acide chloroplatinique (H₂ PtCl₆ ), tétrachloropalladate(II) de potassium (K₂ PdCl₄ ), le chlorure d'hydrogène (HCl), l'hydroxyde de sodium (NaOH) et l'hydroxyde d'ammonium (NH₄ OH) ont tous été achetés chez Sigma-Aldrich, USA. De l'eau déminéralisée (DI) a été utilisée pour toutes les expériences. Tous les produits chimiques et réactifs utilisés dans cette étude étaient de qualité analytique.

Le C. reinhardtii la culture d'algues (souche CPCC11) a été obtenue du Centre canadien de culture phycologique (CPCC, Département de biologie, Université de Waterloo, Canada).

Traitement GK

La poudre de GK (1 g) a été introduite dans un bécher en verre contenant 1 L d'eau DI et doucement agitée pendant une nuit sur un agitateur magnétique. La solution de gomme a ensuite été laissée à température ambiante (20 °C) pendant 18 h pour séparer toute matière non dissoute. La solution de gomme a ensuite été filtrée à travers un entonnoir en verre fritté (taille de pores de 10 à 16 μm) et la solution claire a été lyophilisée et conservée jusqu'à utilisation.

Synthèse de NP de métaux et d'oxydes métalliques à l'aide de GK

En bref, 100 μL d'aliquotes de 10 mM AgNO₃ , HAuCl₄ , H₂ PtCl₆ et K₂ PdCl₄ les solutions ont été ajoutées à 10 mL de solution aqueuse de GK dans des fioles coniques de 50 mL séparées. Le pH de la dispersion colloïdale a été ajusté en ajoutant 0,1 N de HCl ou 0,1 N de NaOH afin d'obtenir un rendement maximal de formation de NP. Pour synthétiser les NPs Ag, Au, Pt et Pd, les AgNO₃ , HAuCl₄ , H₂ PtCl₆ , et K₂ PdCl₄ et les mélanges de GK ont été agités dans un agitateur orbital Innova 43 (New Brunswick Scientific, USA) à 250 tr/min à des températures allant de 45 à 95 °C pendant 1 h. Les solutions virent respectivement au jaune clair, au rouge vin, au noir intense et au noir sourd, indiquant la formation de NP Ag, Au, Pt et Pd. Dans le cas du Pt, la réduction et la formation de NP se sont produites à un pH de 8,0 et à une température de 90 °C, tandis que des NP de Pd se sont formées à un pH de 8,5 et 95 °C. Voir plus dans Padil et al. [66, 67].

Les CuO NPs ont été synthétisées à l'aide d'un procédé de synthèse thermique colloïdale [13]. En bref, 100 μL d'aliquotes d'une solution à 10 mM de chlorure de cuivre dihydraté (CuCl₂ ·2H₂ O) a été mélangé avec 10 mL de la solution de GK (100 mg dispersés dans 10 mL d'eau DI) et du NaOH dans des fioles coniques de 50 mL séparées, avec du CuCl₂ ·2H₂ O et NaOH maintenus à un rapport molaire de 2:5. Le mélange contenant le CuCl₂ ·2H₂ O et GK ont été agités à 250 tr/min à une température de 75 °C pendant 1 h dans un agitateur orbital. La couleur du mélange a progressivement changé du bleuâtre au noir, indiquant la formation de CuO NPs. Le précipité résultant a été obtenu par centrifugation et lavé d'abord avec de l'éthanol puis de l'eau DI.

Caractérisation des NP de synthèse verte

La concentration de métal dans les NP fraîchement synthétisées a été mesurée par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS, OPTIMA 2100 DV, Perkin Elmer).

La formation et la stabilité des NP métalliques ont été évaluées à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis Cintra 202 (GBC, Australie), la stabilité des NP étant déterminée après 6 mois.

Des images de microscopie électronique à transmission (MET) des NP d'Ag, Au, Pt, Pd et CuO ont été obtenues à l'aide d'un microscope Tecnai F 12 (FEI, Thermo Fisher Scientific, Oregon, États-Unis) fonctionnant à une tension d'accélération de 15 kV. Les échantillons ont été préparés pour l'analyse MET en laissant tomber 10 à 20 μL de dispersion GK-NP inorganique sur une grille de cuivre et en séchant à température ambiante, après avoir éliminé l'excès de solution.

Conditions de culture d'algues

Chlamydomonas reinhardtii a été cultivé en milieu TAPx4 (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S1, informations complémentaires) à 20 °C dans un incubateur (Infors, Suisse) équipé d'un agitateur tournant en continu à 100 rpm et d'un régime d'éclairage de 114,2 μmol phot m ^{− 2} s ⁻¹ . Les cellules d'algues ont été cultivées à une vitesse exponentielle afin d'obtenir environ 10 ⁶ cellules/mL.

Caractérisation des NP dans le milieu d'exposition aux algues

Distribution de la taille des NP dans le C. reinhardtii Le milieu TAPx4 a été mesuré en utilisant la technique de sédimentation centrifuge différentielle (DCS) sur une centrifugeuse à disque DC24000UHR (CPS Instruments Inc., USA). Les mesures ont été effectuées à une vitesse de rotation du disque de 24 000 tr/min et la sédimentation des particules a été effectuée à l'aide d'une méthode de 8 à 24 % (w /w ) gradient de densité de saccharose. Avant chaque mesure d'échantillon, l'instrument a été calibré à l'aide d'étalons de nanosphères de PVC (470 nm). Les NP ont également été caractérisées par la mobilité électrophorétique et l'approximation de Smoluchowski utilisée pour déterminer le potentiel zêta (ZP) sur un Zetasizer ZS (Malvern Instruments Ltd., Royaume-Uni). Chaque mesure a été effectuée sur 10 runs avec des fonctions d'autocorrélation de 10 s, chaque résultat étant obtenu à partir de mesures en triple du même échantillon.

La méthode d'ultrafiltration a été utilisée pour déterminer la quantité d'ions métalliques dans le milieu algal (Cheloni et al. [47]; Ma et al. [68]). Des aliquotes prélevées à différents intervalles de temps (2 et 24 h) ont été centrifugées pendant 30 min à 7 500 tr/min pour séparer les particules et les agrégats. Le surnageant a ensuite été filtré à travers des filtres d'ultrafiltration Amicon Ultracel 3K avec un seuil de coupure de poids moléculaire de 3 kDa (Millipore, USA) pour séparer les ions des particules. Les NP et les agrégats d'un diamètre supérieur à 1,3 nm ont été retenus sur le filtre, et le filtrat a été analysé par ICP-MS pour les ions dissous [68].

La génération de ROS abiotiques avec une concentration croissante de NPs dans un milieu algal a été déterminée à l'aide de diacétate de dichlorodihydroflourescéine fluorescent (H₂ DCF-DA, Sigma–Aldrich, Suisse), comme décrit dans des études antérieures [47, 69].

Effet des NP sur la croissance des algues, l'intégrité membranaire et la génération de stress oxydatif

L'effet des NP de métal et d'oxyde métallique sur la croissance des algues, l'intégrité de la membrane et la génération de stress oxydatif a été testé par cytométrie en flux (FCM; BD Accuri C6 Flow Cytometer, BD Biosciences, USA). L'expérience a été réalisée dans des flacons transparents (PS, 50 mL, Semadeni, Suisse) contenant 5 mL de suspension d'algues et des NP à des concentrations de 1, 5, 10 et 20 mg/L. Des échantillons de contrôle sans NP ont été analysés en parallèle. Les cellules d'algues ont été chauffées dans de l'eau bouillante (100 °C) pendant 15 min afin de fournir un contrôle positif pour les membranes cellulaires endommagées. Les cellules d'algues ont également été traitées avec du cumin (Sigma-Aldrich, États-Unis), un agent d'espèce oxydante, pendant 30 minutes dans l'obscurité en tant que contrôle positif du stress oxydatif (ROS). Tous les échantillons non traités et les échantillons traités avec les NP ont été incubés dans des conditions similaires à celles adoptées pour le maintien des cultures. Des sous-échantillons ont été prélevés après 1, 3, 5 et 24 h pour évaluer l'effet des NP sur l'intégrité de la membrane cellulaire et le stress oxydatif à l'aide de la FCM. Une aliquote de 250 μL de chaque échantillon a été transférée dans une plaque à fond plat à 96 puits Microtiter®. Pour évaluer l'intégrité de la membrane cellulaire, des sondes fluorescentes à l'iodure de propidium (PI) (P4170, Sigma-Aldrich, USA) ont été ajoutées à l'échantillon à une concentration finale de 7 μM. Pour la détection du stress oxydatif, le CellROX® Green Reagent (ROS) (C10444, Life Technologies, USA) a été ajouté aux échantillons conformément aux instructions du produit. En bref, le PI se lie à l'ADN et à l'ARN après pénétration intracellulaire à travers les membranes cellulaires altérées, mais il est exclu des cellules saines. CellROX® Green Reagent est une sonde de mesure du stress oxydatif dans les cellules vivantes. Le colorant perméable aux cellules est faiblement fluorescent lorsqu'il est dans un état réduit, mais présente une fluorescence photostable vert vif lors de l'oxydation par les ROS et de la liaison ultérieure à l'ADN. Ainsi, son signal est principalement localisé sur le noyau et les mitochondries. Les plaques ont été incubées dans l'obscurité pendant 20 min (PI) et 30 min (ROS) avant la mesure du FCM. Les suspensions d'algues ont ensuite été passées à travers le FCM avec un laser d'excitation bleu à 488 nm. CellROX Green a été mesuré dans le canal FL1 à 533/30 nm, la fluorescence rouge PI dans le canal FL2 à 585/40 nm et l'autofluorescence rouge de la chlorophylle a (Chla ) dans le canal FL3> 670 nm. L'expérience a été réalisée en double et répétée.

Les données FCM ont été analysées à l'aide du logiciel CFlow Plus (BD Biosciences, USA). Les échantillons ont été bloqués, sur la base des propriétés de diffusion vers l'avant et de l'autofluorescence rouge de Chla , pour éliminer les signaux des NPs, débris et autres contaminants. Le nombre de cellules, le pourcentage de membranes cellulaires endommagées ou de cellules soumises à un stress oxydatif et les données d'autofluorescence ont été récupérés sur la base de l'autofluorescence de Chla (670 nm), cellules marquées PI (585 nm) et ROS Green (533 nm) (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1).

Efficacité du photosystème algal II

Des suspensions de NP de métal et d'oxyde métallique ont été ajoutées à la même culture d'algues (environ 10 ⁶ cellules/mL) dans des flacons en verre de 15 mL afin d'atteindre des concentrations finales de 1, 5, 10 et 20 mg/L. Des cultures d'algues sans NP ont été préparées comme témoins négatifs. Tous les échantillons ont ensuite été transférés dans un incubateur dans les mêmes conditions que celles utilisées pour les cultures d'algues originales. Des aliquotes (2,2 mL) de chaque échantillon ont été prélevés immédiatement et après 1, 3, 5 et 24 h d'incubation afin de détecter le rendement quantique (QY) du photosystème II à l'aide d'un fluoromètre AquaPen-C AP-C 100 (PSI Ltd., République tchèque République). Toutes les mesures ont été effectuées en triple. QY représente le rapport de fluorescence variable (F _v = F _m − F ₀ ) au maximum de fluorescence (F _m ), avec QY = F _v :F _m utilisé comme indicateur de l'efficacité de la trempe photochimique [70]. F _m a été obtenu en appliquant un éclairage à 680 nm pendant quelques secondes avant et à la fin de l'éclairage, avec une fluorescence minimale (F ₀ ) étant la mesure initiale au niveau de fluorescence minimum en l'absence de lumière photosynthétique.

Analyse statistique

L'effet des NP de métal et d'oxyde métallique sur C. reinhardtii ont été testés en utilisant l'analyse de variance ANOVA et le test de Dunnett (GraphPad PRISM, USA). Les niveaux de signification ont été fixés à *P < 0,05, ***i>P < 0,01 et ****P < 0.001.

Résultats

Formation et caractérisation primaire des NP

Les images MET des NPs Ag, Au, Pt, Pd et CuO synthétisées à l'aide de GK montrent des NPs sphériques bien séparées avec des diamètres allant de 2 à 100 nm (Fig. 1a–e). Les solutions aqueuses de NP colloïdales examinées par spectroscopie UV-Vis (Fig. 1f) présentaient une résonance plasmonique de surface distincte à 412 et 525 nm, compatible avec la formation de NP Au et Ag au sein du réseau GK. Aucune résonance plasmonique de surface distincte n'a été observée pour les NP de Pt, Pd ou CuO. Les mesures UV-Vis après 6 mois ont confirmé la stabilité de toutes les NP, les spectres affichant un seul pic avec une taille moyenne similaire à celle des NP fraîchement synthétisées (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2).

Images de microscopie électronique à transmission de a Au, b Pt, c Ag, d Pd et e Nanoparticules de CuO synthétisées à l'aide de gomme karaya et de leurs sels métalliques correspondants. un , b , c , d et e les inserts graphiques montrent la distribution de la taille des particules de pointe par le poids des nanoparticules dans les milieux d'algues, tel que déterminé par sédimentation centrifuge différentielle. (F) Spectres UV-Vis pour les nanoparticules Au, Ag, Pt, Pd et CuO

Caractérisation des NP dans le milieu d'exposition aux algues

La taille des NP, basée sur la distribution du poids, variait de 180 à 5 nm comme suit :CuO > Au > Pt > Ag > Pd. Toutes les NP étaient chargées négativement à pH 7 (tableau 1 et fichier supplémentaire 1 :figure S3). Les NP de Pt, Ag et CuO avaient les concentrations de métaux ioniques les plus élevées (33-36 μg/L) et les NPs d'Au et de Pt les plus faibles (6-7 μg/L) (tableau 1). Les formes ioniques des métaux ont été détectées dans le milieu algal (Tableau 1).

Effet sur la croissance des algues

Non affecté C. reinhardtii la culture avait un taux de croissance de 1 × 10 ⁶ cellules/h. En présence de 1 mg/L d'Ag, Pd et CuO NP, le taux de croissance a fortement diminué à 2,2 × 10 ⁴ , 1,7 × 10 ⁴ et 0,2 × 10 ⁴ cellules/h, respectivement (P < 0,001). Au fur et à mesure que la concentration de NP augmentait, la croissance des algues était complètement inhibée (Fig. 2). Lorsque les algues ont été exposées aux NP Au et Pt, le taux de croissance était également significativement réduit par rapport au témoin (P < 0,001), mais l'augmentation des concentrations n'a pas augmenté l'effet.

Taux de croissance de Chlamydomonas reinhardtii exposés à Au, Pt, Pd, Ag et CuO métaux et nanoparticules d'oxydes métalliques (1, 5, 10 et 20 mg/L). Le taux de croissance du témoin non exposé (culture d'algues) était de 1 × 10 ⁶ cellules/h après 24 h. Les barres d'erreur représentent l'écart type des expériences répétées utilisant des échantillons en double

Génération de stress oxydatif dans les cellules

Le stress oxydatif variait selon le type de NP (Fig. 3). L'effet le plus élevé, avec près de 100 % des cellules affectées, a été causé par 5 à 20 mg/L de NP Ag et CuO (Fig. 3d, e et fichier supplémentaire 1 :Tableau S2). Lorsque les cellules d'algues ont été exposées aux NP Au, le stress oxydatif était beaucoup plus faible, avec la plupart < 10% des cellules affectées. Les concentrations les plus élevées de NP Au (20 mg/L) n'affectaient que 15 % des cellules (P < 0,001). Le pourcentage de cellules stressées a diminué progressivement au fil du temps, sans aucun stress oxydatif détecté après 24 h pour toutes les concentrations d'Au testées (Fig. 3a). Les NP de Pt ont causé un stress oxydatif dans moins de 8 % des cellules d'algues au cours des 5 premières heures d'exposition (Fig. 3b). Ce n'est qu'à des concentrations de 10 et 20 mg/L qu'un stress a été généré dans 10 et 19 % des cellules, respectivement, après 24 h (P < 0,001 ; Fichier supplémentaire 1 :Tableau S2), sans aucun stress détecté à des concentrations plus faibles (P> 0,1) après 24 h d'exposition (Fig. 3b). L'exposition à 1 mg/L d'Ag NPs n'a pas réussi à induire de stress oxydatif dans les cellules d'algues sur une période de 24 h (P> 0.9). Cependant, l'exposition à 5 mg/L a entraîné un stress oxydatif après 5 h, et l'exposition à 10 et 20 mg/L a entraîné un stress oxydatif après 3 h. Après 24 h d'exposition aux Ag NPs, 100 % des cellules étaient stressées (P < 0,001 ; Fig. 3c et fichier supplémentaire 1 :Tableau S2). CuO NPs induit significative (P < 0,001) stress oxydatif dans les cellules d'algues plus rapidement (3 h) que les autres NP métalliques testées à 10 et 20 mg/L (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S2), à l'exception des NP Ag. Le stress oxydatif était déjà significatif à 5 mg/L après 5 h. Toutes les concentrations (> 5 mg/L) ont eu un effet significatif sur le stress oxydatif cellulaire (Fig. 3d, e). En tant que paramètre complémentaire, nous avons également déterminé les ROS abiotiques générés par les NP. Contrairement à C. reinhardtii taux de croissance et pourcentage de C. reinhardtii cellules présentant un stress oxydatif, les NP Au n'ont généré qu'une légère augmentation des ROS abiotiques (P> 0,05 ; Fichier supplémentaire 1 :Figure S4).

Pourcentage de Chlamydomonas reinhardtii cellules présentant un stress oxydatif suite à une exposition à des concentrations croissantes (1, 5, 10 et 20 mg/L) de a Au, b Pt, c Pd, d Ag et e Nanoparticules de CuO après 1, 3, 5 et 24 h. Les barres d'erreur représentent l'écart type d'expériences répétées utilisant des échantillons en double. Notez différents y -échelles des axes pour Au et Pt

Effet sur l'intégrité de la membrane algale

Les NP Au et Pt ont causé des (P < 0,001) dommages à la membrane cellulaire à toutes les concentrations de 1 à 5 h (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S3) ; cependant, aucun effet significatif (P> 0,05) a été observée après 24 h (Fig. 4a, b). Dans le cas des Ag NPs, 100% des cellules ont été endommagées (P < 0,001) après 1 h d'exposition à 1–20 mg/L (Fig. 4c, Fichier supplémentaire 1 :Tableau S3, Ag). Le pourcentage de membranes cellulaires endommagées suite à une exposition à 1 et 5 mg/L de NP de Pd (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S3, Pd) était comparable à celui du témoin sur 24 h (P> 0.4). En revanche, des dégâts importants (P < 0,001) a été observé après 24 h d'exposition à 20 mg/L de NP de Pd (Fig. 4d). L'effet de CuO augmentait avec l'augmentation de la concentration et du temps, atteignant son impact le plus élevé après 24 h (Fig. 4e et fichier 1 supplémentaire :Tableau S3).

Pourcentage de Chlamydomonas reinhardtii cellules dont les membranes sont endommagées suite à une exposition à des concentrations croissantes (1, 5, 10 et 20 mg/L) de a Au, b Pt, c Pd, d Ag et e Nanoparticules de CuO après 1, 3, 5 et 24 h. Les barres d'erreur représentent l'écart type d'expériences répétées utilisant des échantillons en double. Notez différents y -échelles des axes pour Au et Pt

Effet sur la chlorophylle (Chl ) Fluorescence

Chl la fluorescence n'a pas été significativement affectée (P> 0,1) par Au NPs à n'importe quelle concentration sur la période de 24 h et par Pt sur la période de 5 h (Fig. 5a, b et fichier supplémentaire 1 :Tableau S4). En revanche, les NPs Ag, Pd et CuO inhibent fortement (P < 0.001) Chl fluorescence avec une concentration et un temps d'exposition croissants, par ex. Chl la fluorescence a été réduite de 98 % (1 h) à 22 % (24 h) (P < 0,001) lorsque les cellules d'algues ont été cultivées en présence de 5 mg/L d'Ag (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S4). Une réduction similaire de la fluorescence a également été observée pour 10 et 20 mg/L d'Ag, avec des niveaux tombant à 20 et 9 % (P < 0,001), respectivement (Fig. 5c). Les NP CuO et Pd (20 mg/L chacune) ont provoqué une forte baisse de Chl fluorescence après 24 h (P < 0,001). Il n'y avait aucun effet observable (P> 0.1), cependant, pour 1 ou 5 mg/L de Pd et pour 1 mg/L d'Ag et CuO NPs (Fig. 5c–e).

Pourcentage de Chlamydomonas reinhardtii cellules avec de la chlorophylle (Chl ) fluorescence après exposition à des concentrations croissantes (1, 5, 10 et 20 mg/L) de a Au, b Pt, c Pd, d Ag et e Nanoparticules de CuO après 1, 3, 5 et 24 h. Les barres d'erreur représentent l'écart type des expériences répétées utilisant des échantillons en double

Effet des NP sur le photosystème algal II

Les NP Au, Pt et CuO ont eu un léger effet significatif (P < 0,05) sur le photosystème II QY à certains moments au cours de la période de 24 h à des concentrations allant de 1 à 20 mg/L (Fig. 6 et Fichier supplémentaire 1 :Tableau S5). En revanche, QY a été significativement réduit (P < 0,001) après seulement 1 h après le contact avec les Ag NP à toutes les concentrations (Fig. 6c et fichier supplémentaire 1 :Tableau S5). Les NP de Pd et de CuO ont entraîné une réduction significative de QY à la concentration la plus élevée de 20 mg/L (Fig. 6d, e et fichier supplémentaire 1 :Tableau S5).

Effet de a Au, b Pt, c Pd, d Ag et e Nanoparticules de CuO (1, 5, 10 et 20 mg/L) sur l'efficacité du photosystème II (QY %) après 1, 3, 5 et 24 h. Cent pour cent le y -L'axe représente le QY de la culture d'algues témoin sans nanoparticules. Les barres d'erreur représentent l'écart type d'expériences répétées d'échantillons dupliqués

Discussion

Dans le présent travail, nous avons cherché à explorer l'élimination de la production de déchets toxiques lors de la synthèse de nanomatériaux métalliques et d'oxydes métalliques dans la mise en œuvre de l'approche de la chimie verte [16, 57, 58], l'accent étant mis sur l'utilisation de dispersants et matériaux renouvelables et biodégradables. Nous avons utilisé avec succès le GK, un matériau naturel, renouvelable et biodégradable pour la synthèse et la stabilisation d'une gamme de NP. En utilisant l'eau DI comme solvant, les groupes fonctionnels présents dans GK (c. 68]. Les NP synthétisées dans notre étude (Au, Pt, Pd, Ag et CuO) étaient comparables en termes de taille, de stabilité et de rentabilité à d'autres NP synthétisées vertes d'études précédentes [13, 69].

Nous avons ensuite utilisé une gamme de concentrations à l'échelle nanométrique (1 à 20 mg/L) liées aux concentrations environnementales attendues ou enregistrées [39, 71, 72, 73] pour évaluer l'effet biologique des NP sur le C. reinhardtii en utilisant des paramètres tels que la croissance des algues, l'intégrité de la membrane, Chl efficacité du photosystème II de fluorescence et stress oxydatif. Nos résultats ont révélé deux groupes distincts :les NPs Au et Pt ayant peu ou pas d'effet sur l'algue, et les NPs Ag, Pd et CuO affichant un effet important sur presque tous les paramètres (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S6). Les études de toxicité des NP de métal ou d'oxyde métallique ont identifié plusieurs caractéristiques physico-chimiques clés des NP qui peuvent être liées à leur toxicité, notamment la composition, le revêtement, la taille, la forme et l'homo- ou l'hétéroagrégation [69, 74, 75, 76, 77, 78]. De plus, la toxicité des métaux dissous (forme ionique) a déjà été démontrée sur les algues en utilisant une gamme de critères, y compris la génération intracellulaire de ROS, Chl déplétion et inhibition de la photosynthèse [79,80,81]. Nous avons clairement détecté la génération de ROS et un effet sur la croissance, Chl production et photosystème II après exposition aux NPs Ag, Pd et CuO.

Alors que les NP Pd ont généralement été considérées comme un groupe toxique, elles n'ont pas été largement étudiées et elles n'ont été reconnues que récemment comme des NP antibactériennes importantes [41]. On pense généralement que la petite taille (1,5 à 3 nm) des NP Pd contribue à leurs attributs antibactériens, facilitant éventuellement le transport vers les cellules à travers les pores de la paroi cellulaire des bactéries ou des algues, qui ont des diamètres allant de 5 à 20 nm [82, 83] . In our study, Pd NPs of 1.5 nm mean size could directly enter algal cell walls and cause damage when releasing ions in the cell membrane and chloroplasts (Chl fluorescence, PS II, ROS). There is clear evidence that soluble Pd salt was able to enter P. subcapitata cells, where Pd precipitates were mostly formed in chloroplasts [78] which could increase generation of ROS and thus oxidative stress. It was also reported that Pd NPs (127 nm z -average hydrodynamic size) were less toxic toward P. subcapitata than soluble Pd salt [69] maybe due to larger size of NPs that could not directly enter the cells, while Pd salt could. On the other hand, Pd NPs could form hetero-aggregates with algal cells leading to physical entrapment. Surprisingly, the entrapment is not inevitably lethal because the cells could recover their growth after transfer to clean medium [69].

Numerous studies have shown that Ag NPs toxicity to algae was mainly driven by Ag ions dissolved in the exposure medium rather than Ag NPs and also depended on Ag NPs coatings and sizes [80, 84,85,86,87,88,89]. Our study revealed high toxicity of Ag NPs thus suitable for algicidal applications. The ionic Ag and/or Ag NPs (5 nm) could directly enter algal cells [90], causing damage to the cell membranes and other cellular compartments by ROS formation. Moreover, Ag NPs could damage algal cells by direct interaction between NPs and algal cells [72] or the type of NPs coating could play a significant role. For example, dexpanthenol, polyethylene glycol and polyvinyl polypyrrolidone coatings caused a similar effect as AgNO₃ on C. reinhardtii , while carbonate, chitosan, and citrate decreased the Ag effect on photosynthesis [87]. Our Ag NPs showed strong effect toward C. reinhardtii regardless GK coating.

The ecotoxicity of CuO NPs has been extensively studied [36, 47,48,49, 69, 91]. We observed CuO NPs harming cell membranes right after 1 h, while the ROS elevated after 3 h at concentrations higher than 5 mg/L and also Chl fluorescence substantially decreased over 24 h. It is possible that the CuO NPs (or ionic Cu)-damaged membranes could increase further uptake of Cu and oxidative stress in the C. reinhardtii cells [91] where observed hetero-aggregation of NPs and the cells (data not shown) could even enhance this interaction. von Moos et al. [36] stated that free Cu ²⁺ or the NPs themselves were the main mediators of toxicity toward C. reinhardtii , while Cheloni et al. [47] believed ion Cu at lower CuO NPs concentrations was the driving force, being unable to clarify the contribution of dissolved Cu in CuO NPs . This was probably elucidated by other study revealed much stronger effect of soluble ionic Cu and soluble fraction of CuO NPs on P. subcapitata than bare CuO NPs [69].

Au NPs slightly increased membrane impairment and oxidative stress after 3 and 5 h, but these effects disappeared after 24 h. Interestingly, abiotic ROS were constantly generated during whole 24 h study contrary to all other NPs. We assume that stable conditions allowed the cells to cope with such small level of stress. Previous study has reported a range of EC50 values for dissolved Au on C. reinhardtii of between 5.9 and 1.7 mg/L, depending on exposure time [92]. In our opinion, almost any Au NP toxicity would not have been exacerbated or affected by the degree of ion Au and would have had nearly no bearing on any of the criteria adopted for our experiments. Moreover, Au NPs seemed to be well dispersed in exposure media and we did not observe any aggregates or direct interactions with the C. reinhardtii cells (data not shown).

We found that Pt NPs caused slight Chl and a growth rate decrease after 24 h for all concentrations. These not so pronounced effects could be caused by both ionic Pt and Pt NPs. Up to now, there has been only limited knowledge about the toxicity of Pt NPs on algae. For example, Pt NPs decreased growth rate, and Chl fluorescence and oxidative stress on P. subcapitata and C. reinhardtii [39, 40]. The latter authors also suggested that the toxicity of Pt NPs might be only partly attributed to dissolved form of Pt in the case of P. subcapitata and that also the shading effect might influence toxicity [40]. In our study, we did not find such evidence.

Conclusions

Green-synthesised metal and metal oxide NPs were produced at nanoscale sizes of 42 nm (Au), 12 nm (Pt), 1.5 nm (Pd), 5 nm (Ag) and 180 nm (CuO):all with a negative charge. GK, a natural hydrocolloid, was successfully applied as a safe, cost-effective stabiliser and showed no aggregation (all NPs) after 6 months at + 4 °C. The biological effect (algal growth, membrane integrity, oxidative stress, Chl fluorescence and photosystem II efficiency) of these NPs was investigated on green alga C. reinhardtii . All NPs had a significant effect on algal growth rate; however, Au and Pt NPs inhibited algal growth far less than the other NPs (Pd, Ag and CuO). In terms of other biological effects, Pd, Ag and CuO NPs caused significant cell membrane damage, highly affected Chl fluorescence and caused oxidative stress. Ag and Pd NPs mostly inhibited photosystem II, while it was not much affected by CuO (only the highest concentration of 20 mg/L significantly decreased QY) and Au or Pt. Generally, metal and metal oxide NPs were successfully synthesised following green chemistry rules, without harmful side-products and showing high stability. Some could find reasonable application in algicides (Ag and CuO) or antimicrobial surfaces (Pd, Ag and CuO), while Au and Pt proved to be almost non-toxic to green alga C. reinhardtii .