Administration d'acide oléanolique par micelles polymériques : solubilité accrue et efficacité anti-rides prouvée

Résumé

L'acide oléanolique n'a été utilisé jusqu'à présent qu'en tant qu'agent subsidiaire dans les produits cosmétiques. L'objectif de l'étude est de montrer l'effet de l'acide oléanolique en tant qu'ingrédient actif pour l'atténuation des rides chez l'homme et de développer une formulation en micelles polymériques qui permet à l'acide oléanolique, peu soluble, d'être utilisé comme ingrédient principal dans les produits cosmétiques pour réduire les rides. La solubilité de l'acide oléanolique a été évaluée dans des solubilants, tensioactifs et polymères. Les tailles et formes des particules des micelles polymériques contenant de l'acide oléanolique ont été évaluées par spectrophotomètre de diffusion de lumière électrophorétique et cryomicroscopie électronique à balayage. L'efficacité d'encapsulation et la perméation cutanée ont été mesurées par HPLC. La stabilité des micelles polymériques stockées à 40 °C pendant 3 mois a été évaluée par observation visuelle, mesure de la taille des particules et mesure de la teneur en acide oléanolique. Des micelles polymériques sous forme finale d'ampoule ont été appliquées autour des yeux de 23 sujets féminins pendant 8 semaines. Cinq paramètres cutanés ont été évalués par profilométrie optique toutes les 4 semaines pendant 8 semaines. En outre, des professionnels ont effectué des observations visuelles de la peau et une étude d'irritation cutanée humaine a été réalisée. Des micelles polymériques d'acide oléanolique avec une taille de particule inférieure à 100 nm ont été préparées en utilisant Capryol 90® et du poloxamer. Le taux de perméation cutanée de l'acide oléanolique dans les micelles polymériques était plus élevé que celui dans les autres solutions faites d'acide oléanolique dispersé dans 2 tensioactifs différents. Aucun changement significatif dans la taille des particules, la couleur ou la teneur en acide oléanolique n'a été observé, et les micelles polymériques stockées à 40 °C pendant 3 mois n'ont pas subi de séparation de phase. Après 8 semaines d'application, aucune irritation cutanée n'avait développé et les cinq paramètres évalués par profilométrie optique ainsi que les scores d'évaluation visuelle étaient significativement améliorés. Cette étude a montré que les micelles polymériques d'acide oléanolique préparées dans cette étude étaient stables et efficaces pour atténuer les rides chez l'homme en tant qu'ingrédient actif principal. Sur la base de ces résultats, on s'attend à ce que les micelles polymériques d'acide oléanolique puissent être largement utilisées dans les applications cosmétiques.

Introduction

Le vieillissement cutané comprend le relâchement (laxité), l'amincissement et les rides. Il peut être accéléré par l'infection, le tabagisme, la lumière UV, les traumatismes, les déséquilibres hormonaux, le stress et/ou les pro-oxydants tels que les hydrolases incluant l'élastinase ou la collagenase. Les espèces réactives de l'oxygène ou radicaux libres générés par les causes mentionnées ci-dessus endommagent les cellules voisines et entraînent une réduction de l'élasticité cutanée et un amincissement. En particulier, la lumière UV est connue pour déclencher la génération d'espèces réactives de l'oxygène, qui endommagent les lipides membranaires, les protéines cellulaires et l'ADN, et accélèrent ainsi le développement des rides d'expression, des taches de rousseur et du mélasma. L'acide oléanolique est un composant efficace d'origine végétale naturelle extrait de plusieurs espèces de plantes et utilisé comme ingrédient médical et cosmétique majeur. On le trouve également dans des fruits comme les pommes ou les poires. En tant que sorte de terpène pentacyclique hydroxyle, l'acide oléanolique a été isolé pour la première fois des feuilles d'olivier (Olea europaea) et se trouve largement dans les plantes incluant la swertia d'Asie de l'Est (Eugenia jambos) et la gentiane jaune (Gentiana lutea). Il favorise les fonctions anti-âge via la synthèse non seulement de pro-collagène, important pour la synthèse du collagène, mais aussi de céramides et de filaggrine, et aussi en inhibant l'activité de la MMP-1, une enzyme qui dégrade des protéines comme le collagène. Sur la base de ces résultats, on peut supposer que l'acide oléanolique a un double effet anti-âge en favorisant non seulement la production de collagène mais aussi en prévenant sa dégradation. Par conséquent, l'acide oléanolique est un ingrédient anti-âge très prometteur pour les produits cosmétiques. Cependant, l'utilisation de l'acide oléanolique dans les produits cosmétiques comme ingrédient principal est limitée par sa faible solubilité aqueuse ; ainsi, seule de petites quantités d'acide oléanolique dans une formulation émulsionnée ont été utilisées comme ingrédient subsidiaire dans les produits cosmétiques. Ses propriétés physicochimiques liées à l'absorption cutanée incluent son point de fusion, son poids moléculaire, son coefficient de partage et son hydrophilie. Son point de fusion est supérieur à 300 °C, indiquant qu'il s'agit d'un matériau hautement cristallin. Les matériaux hautement cristallins nécessitent une plus grande énergie pour la dissolution, montrent une biodisponibilité médiocre en raison de leur solubilité limitée et sont donc mal absorbés. De plus, les composés hautement hydrophiles ou lipophiles, ou les composés de poids moléculaire élevé sont connus pour ne pas pénétrer facilement la peau. La méthode la plus fréquemment utilisée pour améliorer la perméation cutanée de telles molécules est la synthèse de précurseurs ou l'utilisation de porteurs de médicaments colloïdaux. À cet égard, les liposomes, émulsions et micelles polymériques ont été activement étudiés.

Les micelles polymériques sont des agrégats auto-assemblés à l'échelle nanométrique formant des structures cœur-écorce en solution aqueuse. Elles sont souvent faites de copolymères di-blocs ou tri-blocs qui peuvent former un cœur interne hydrophobe et une écorce externe hydrophile. Les micelles polymériques sont considérées comme plus stables physiquement que les micelles tensioactives car leurs propriétés varient selon le type et le ratio des monomères polymères dans un copolymère bloc et ont des concentrations micellaires critiques relativement faibles.

Dans cette étude, nous avons préparé des micelles polymériques d'acide oléanolique et évalué leur taille et forme de particules, ainsi que l'efficacité d'encapsulation et le taux de perméation cutanée de l'acide oléanolique. La stabilité physique de l'acide oléanolique sous cette forme a également été évaluée pendant 3 mois. L'effet anti-rides humain de l'acide oléanolique dans une formulation réelle de produit cosmétique a également été étudié.

Matériaux et méthodes

Matériaux

L'acide oléanolique, Tween 80, Tween 20 et Tween 60 ont été achetés chez TCI (Tokyo, Japon). PEG 400, Pluronic F127 et Pluronic F68 ont été obtenus de BASF (Ludwigshafen, Allemagne). Propylène glycol, PEG 300 et PEG 200 ont été obtenus de JUNSEI (Tokyo, Japon). TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 et Capryol™ PGMC ont été achetés chez Gattefossé (Lyon, France). EDTA disodique (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Corée), allantoïne (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA), dipropylène glycol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Corée), propanediol (DuPont Tate & Lyle Bio Products Company, LLC, Loudon, USA), carbomère (The Lubrizol Corporation, Ohio, USA), PEG/PPG/polybutylène glycol-8/5/3 glycérine (NOF Corporation, Tokyo, Japon), hyaluronate de sodium (TCI, Tokyo, Japon), bêta-glucane (SK Bioland, Cheonan, Corée), phénoxyéthanol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Corée), caprylyl glycol (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Corée) et éthylhexylglycérine (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Corée) ont été utilisés pour préparer le produit cosmétique contenant de l'acide oléanolique. L'acétonitrile de grade HPLC a été obtenu de Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA). De l'eau triplement distillée a été utilisée, et les autres solvants et réactifs étaient de grade EP et GR. Des souris femelles glabres Crlori:SKH1-hr ont été achetées chez OrientBio (Seongnam, Corée).

Analyse HPLC

L'acide oléanolique a été analysé en utilisant un HPLC Shimadzu série LC-30 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japon). Une colonne analytique Kromasil 100 C18 250 mm × 4,6 mm, 5 μm (Teknokroma, Barcelone, Espagne) a été utilisée à température ambiante. La phase mobile consistait en acétonitrile et eau (85:15, v/v), le débit était de 1 mL/min, et le volume d'injection de 10 μL. L'acide oléanolique a été analysé à UV λ = 210 nm. Toutes les mesures ont été prises à température ambiante.

Étude de solubilité et d'optimisation de la formulation

Une quantité mesurée d'acide oléanolique a été ajoutée à un solubilant, agitée à 60 °C pendant 48 h, et soniquée pendant 5 min à l'aide d'un nettoyeur ultrasonique. La suspension a été centrifugée à 2000 tr/min à l'aide d'une centrifugeuse Universal 320R (Hettich, Tuttlingen, Allemagne), et le surnageant a ensuite été collecté. Ensuite, le surnageant a été filtré à travers un filtre membrane PVDF de 0,45 μm (Whatman, Kent, UK). La solubilité de l'acide oléanolique dans le solubilant correspondant a été estimée en soustrayant le poids des solides restants de la somme des poids initiaux de l'acide oléanolique et du solubilant (Tableau 1).

L'étude d'optimisation de la formulation a été menée en utilisant le poloxamer 188, poloxamer 407, Tween 60 et Tween 80. Divers ratios de polymères amphiphiles et tensioactifs ont été essayés comme résumé au Tableau 2. Chacun de l'acide oléanolique et du Capryol® 90 a été pesé, chauffé et agité à plus de 60 °C jusqu'à observation de solutions claires. Les polymères/tensioactifs montrés au Tableau 2 ont ensuite été ajoutés à la solution claire et agités à plus de 60 °C jusqu'à observation de solutions claires. Les solutions ont ensuite été dispersées dans l'eau distillée (Fig. 1). La solution résultante a été laissée pendant environ 48 h, et une inspection visuelle a ensuite été faite pour sélectionner la formulation optimale. Les résultats des inspections visuelles de chaque formulation au Tableau 2, incluant les observations de précipitation, séparation de phase, transparence et gélification, sont résumés au Tableau 3.

Préparation des micelles polymériques d'acide oléanolique

Les micelles polymériques d'acide oléanolique (PMO) ont été préparées en utilisant les formulations G et H du Tableau 2 en utilisant la méthode montrée à la Fig. 1. PMO-G et PMO-H ont été utilisés pour les expériences subséquentes et PMO-H dans les produits cosmétiques pour les essais cliniques.

Test de coloration

La micellisation polymérique lorsque la formulation G ou H était dispersée dans l'eau a été confirmée par observation visuelle, c.-à-d. transparence. La formation de PMO (PMO-G ou PMO-H) a également été confirmée par un test de coloration. Du bleu de méthylène a été ajouté aux mélanges d'eau et Capryol® 90, eau, Capryol® 90, PMO-G et PMO-H et la couleur des solutions a été observée visuellement et photographiée.

Mesure de la taille des particules

La technique ELS (diffusion de lumière électrophorétique) mesure la fluctuation de l'intensité de diffusion des particules en fonction du temps lorsque les particules présentent à la fois un mouvement brownien aléatoire et un mouvement électrophorétique orienté dans un champ électrique bien défini. La mobilité électrophorétique des particules est mesurée par la technique ELS et a permis d'évaluer la taille des particules de PMO-G et PMO-H à l'aide d'un spectrophotomètre de diffusion de lumière électrophorétique (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Japon).

Analyse par cryomicroscopie électronique à balayage (Cryo-SEM)

La microscopie électronique à balayage cryogénique ou cryomicroscopie électronique à balayage (cryo-SEM) est une technique puissante pour visualiser l'état de la microstructure ou nanostructure de suspensions ou dispersions de polymères colloïdaux après qu'elles ont été immobilisées par congélation rapide et fracturées pour l'imagerie. La fracture est faite et examinée à −196 °C, le point d'ébullition normal de l'azote liquide et bien en dessous de la température de transition vitreuse des particules massiques et entièrement coalescées. Les images cryo-SEM révèlent une gamme de réponses des particules aux fractures qui se propagent à travers la glace. La cryomicroscopie électronique à balayage (Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Sample Preparation System) a été utilisée pour observer la forme des PMO.

Efficacité d'encapsulation

L'efficacité d'encapsulation des micelles polymériques d'acide oléanolique a été évaluée. Le PMO a été centrifugé à 2000 tr/min pendant 15 min, et le surnageant a été collecté et analysé par HPLC. L'efficacité d'encapsulation a été calculée comme la quantité d'acide oléanolique dans les micelles polymériques divisée par la quantité d'acide oléanolique initialement ajoutée (mg) pendant la préparation du PMO.

Stabilité du PMO-H

La stabilité physique du PMO-H a été évaluée en le stockant à 40 °C pendant 3 mois. Les changements de couleur, séparation de phase, présence de précipités et changements de turbidité ont été évalués visuellement. Des échantillons de PMO-H prélevés à intervalles de temps réguliers ont été analysés par HPLC pour déterminer les quantités d'acide oléanolique restantes et par un ELS-Z pour déterminer la taille des particules du PMO-H. Les résultats sont présentés à la Fig. 9.

Test de perméation cutanée in vitro

Une étude de perméation cutanée in vitro a été réalisée à l'aide d'une cellule de diffusion de Franz pour étudier l'amélioration de la perméation cutanée de l'acide oléanolique. Le test a été effectué sur PMO-G, PMO-H, le mélange d'acide oléanolique et Tween 80 dispersé dans l'eau distillée, et le mélange d'acide oléanolique et propylène glycol dispersé dans l'eau distillée. La peau d'une souris femelle glabre de 6 semaines a été découpée en morceaux de la taille requise. Des cellules de Franz verticales ont été utilisées, et la peau a été fixée entre les deux chambres avec son stratum corneum face vers le haut. 330 μL de la formulation sélectionnée a été appliqué sur la peau et les cellules de Franz ont été recouvertes de parafilm. Le récepteur a été rempli avec une solution PBS (pH 7,4) et de l'éthanol dans un rapport 9:1 (v/v). La solution du récepteur a été renouvelée avec une solution PBS fraîche à chaque temps d'échantillonnage. Des échantillons ont été prélevés à 2, 4, 6, 8, 10, 20 et 24 h et analysés par HPLC. Après 24 h, l'excès de formulation restant sur la peau a été retiré avec des Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Australie). La peau utilisée dans l'étude de perméation a été nettoyée avec une solution PBS et l'acide oléanolique restant dans la peau a été mesuré par HPLC. Toutes les expériences de perméation ont été réalisées en triplicat.

Statistiques de l'étude

Les expériences ont été réalisées en trois répétitions indépendantes, et les résultats de cette étude ont été rapportés comme moyenne ± ET. L'analyse statistique a été vérifiée par test t indépendant, et la valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Préparation d'ampoule avec PMO-H

Pour le test clinique, PMO-H a été utilisé comme produit test. PMO-H, eau purifiée, EDTA disodique, allantoïne, dipropylène glycol, propanediol, carbomère et PEG/PPG/polybutylène glycol-8/5/3 glycérine ont été ajoutés et agités pendant 10–15 min à l'aide d'un agitateur magnétique, puis de l'hydroxyde de potassium a été ajouté et le mélange agité pendant 5–10 min supplémentaires. Une fois les ingrédients mélangés homogènement, l'hyaluronate de sodium et le bêta-glucane ont été ajoutés et agités pendant 2–5 min supplémentaires, puis le phénoxyéthanol, le propanediol, le caprylyl glycol et l'éthylhexylglycérine ont été ajoutés et agités pendant 2–5 min. La formule finale a été ajoutée dans une ampoule comme produit test. Les bulles d'air de l'ampoule ont été éliminées en utilisant un four à vide sec avant l'utilisation pour le test. Un contrôle a été préparé suivant la même méthode pour le produit test sauf que l'acide oléanolique a été exclu.

Tests d'application humaine

Étude d'irritation cutanée humaine

Un test de patch du produit cosmétique, qui contenait PMO-H dans une ampoule, a été réalisé sur 25 sujets masculins et féminins âgés de 22 à 56 ans qui avaient accepté de participer à un test d'irritation cutanée humaine. Chaque substance test a été gouttée sur le bras supérieur et fixée avec un patch. Le patch a été attaché pendant 24 h et le degré de stimulation a été observé par 2 professionnels 30 min, 24 h et 48 h après le retrait du patch selon les critères du Groupe de Recherche International sur la Dermatite de Contact (ICDRG).

Essai clinique pour l'amélioration des rides

Des micelles polymériques contenant de l'acide oléanolique dans une ampoule sous forme de produit final ont été appliquées autour des yeux de 23 sujets féminins âgés de 30 à 65 ans qui avaient accepté de participer au test d'amélioration des rides. Les sujets répondaient aux critères d'inclusion et aucun des critères d'exclusion et ont accepté de participer au test d'application humaine. La méthode en double aveugle a été suivie par les chercheurs et les sujets test. Le test a été conduit pendant 8 semaines, et l'évaluation a été effectuée toutes les 4 semaines. La méthode en double aveugle et l'allocation aléatoire ont été utilisées. Le produit test et le contrôle ont été appliqués séparément au hasard soit du côté gauche soit du côté droit du visage du même sujet. Cinq paramètres ont été évalués par profilométrie optique en utilisant le Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Cologne, Allemagne) toutes les 4 semaines pendant 8 semaines — la rugosité moyenne (R3) était le critère principal, et les quatre paramètres de rugosité cutanée (R1), rugosité maximale (R2), profondeur de lissage (R4) et rugosité moyenne arithmétique (R5) étaient les critères secondaires. Les augmentations ou diminutions des cinq paramètres sur la même zone du sujet ont été mesurées au fil du temps, et les valeurs moyennes d'augmentation ou de diminution des cinq paramètres ont été calculées et comparées entre les traitements contrôle et produit test. En outre, une observation visuelle de la peau a été faite par des professionnels. Des photographies des rides des yeux ont été prises en utilisant Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Suwon, Corée). Les critères utilisés pour déterminer les scores d'évaluation visuelle sont montrés à la Fig. S1, et les résultats visuels sont présentés à la Fig. 13. Les paramètres ont été comparés et analysés en utilisant un test t pour échantillons appariés à une fiabilité de 95 %.

Résultats et discussion

Détermination du solubilant, tensioactif et polymère

La solubilité de l'acide oléanolique dans des solubilants biocompatibles, spécifiquement tensioactifs et polymères, est montrée au Tableau 1. L'acide oléanolique tend à être soluble dans les huiles hydrophobes avec un équilibre hydrophile-lipophile (HLB) faible. Le Capryol® 90 a une valeur HLB légèrement plus élevée comparée aux huiles générales. Cependant, l'acide oléanolique montre une solubilité relativement élevée dans le Capryol® 90. De plus, le Capryol® 90 peut être facilement stabilisé comme cœur interne des micelles. Après la sélection du Capryol® 90, plusieurs types de tensioactifs ou poloxamers ont été criblés pour la partie écorce des micelles d'acide oléanolique. Les compositions de micelles d'acide oléanolique montrées au Tableau 2 sont celles qui étaient transparentes immédiatement après dilution avec de l'eau distillée. Cependant, certaines compositions étaient instables et subissaient précipitation, séparation de phase ou gélification dans les 24 h. Des images représentatives des états précipité, séparation de phase, liquide transparent et gel sont montrées à la Fig. 2. L'état final de chaque formule est résumé au Tableau 3. Les compositions G et H restaient transparentes même après 24 h. Bien que la composition I restait claire, c'était un gel plutôt qu'un liquide. Les compositions A à D sont devenues opaques avec précipitation après 24 h. Donnés ces résultats, les compositions G et H ont été sélectionnées pour un développement ultérieur.

Caractéristiques des micelles polymériques d'acide oléanolique

Les structures des micelles polymériques d'acide oléanolique ont été étudiées par test de coloration. La Fig. 3 montre les images du mélange de Capryol® 90 et eau distillée, Capryol® 90, eau distillée, et les micelles polymériques de composition G (PMO-G) et de composition H (PMO-H), après ajout de bleu de méthylène à la solution. Une séparation de phase claire s'est produite pour le mélange de Capryol® 90 et eau distillée. Une précipitation de bleu de méthylène a été observée dans le cas de Capryol® 90. L'eau distillée est devenue bleu foncé après l'ajout de bleu de méthylène. PMO-G et PMO-H sont aussi devenues bleues indiquant que les micelles polymériques consistaient en un cœur interne de phase huileuse et une écorce externe de phase aqueuse. En d'autres termes, un polymère amphiphile, le poloxamer 407 dans les compositions G et H, sert d'écorce externe et aide à former avec succès les micelles polymériques d'acide oléanolique en encapsulant le cœur interne de Capryol® 90 contenant l'acide oléanolique.

La taille des particules, la distribution de taille et la forme peuvent être de bons indicateurs pour prédire la stabilité physique des formulations micellaires. La taille moyenne des particules de PMO-G était de 80,4 nm, et celle de PMO-H de 57 nm (Fig. 4). Les histogrammes de PMO-A, G et H sont montrés à la Fig. 5 pour comparer les distributions de taille affectées par l'état de phase. Comme montré au Tableau 3, PMO-A est opaque en raison de la précipitation, et PMO-G et H sont transparents. La taille des particules de PMO-A est supérieure à 100 nm, et PMO-A montre une distribution de taille plus large que PMO-G et H (Fig. 5). PMO-H montre une distribution de taille des particules plus étroite que PMO-G et présente une fluidité adaptée aux produits cosmétiques.

L'efficacité d'encapsulation pour PMO-G et PMO-H était de 99 à 100 %, indiquant que presque 100 % de l'acide oléanolique était encapsulé dans le cœur interne de PMO (Fig. 6).

La forme de PMO-G et PMO-H a été étudiée par cryomicroscopie électronique à balayage (Cryo-SEM). Le Cryo-SEM a montré que PMO-G et PMO-H étaient des micelles polymériques de forme sphérique. Cependant, les micelles polymériques PMO-H étaient plus cohérentes en taille et forme que les micelles polymériques PMO-G (Fig. 7).

Étude de perméation cutanée in vitro des PMO

La quantité totale d'acide oléanolique restant dans la peau, et la quantité totale d'acide oléanolique ayant permeé à travers la peau en fonction du temps ont été mesurées en utilisant la peau d'une souris femelle glabre de 6 semaines. Quatre formulations différentes, PMO-G, PMO-H, le mélange d'acide oléanolique et Tween 80 dispersé dans l'eau distillée (OTw), et le mélange d'acide oléanolique et propylène glycol dispersé dans l'eau distillée (OPG) ont été comparées en termes d'efficacité de perméation cutanée de l'acide oléanolique. Les quantités totales d'acide oléanolique ayant permeé à travers la peau après 24 h étaient de 29,49 ± 4,00 % pour PMO-H, 21,39 ± 5,91 % pour PMO-G, 13,66 ± 0,81 % pour OTw, et 5,90 ± 2,47 % pour OPG. Comme montré à la Fig. 7, la première détection de l'acide oléanolique dans le cas de PMO-G et PMO-H était possible à 8 h, tandis que la première détection dans OTw était possible à 10 h, et OPG à 20 h. Les proportions d'acide oléanolique resté dans la peau étaient de 56,22 ± 13,50 % pour PMO-H, 36,74 ± 0,72 % pour PMO-G, 27,44 ± 7,02 % pour OTw, et 26,28 ± 5,42 % pour OPG. PMO-H a montré la plus grande quantité à la fois d'acide oléanolique permeé à travers la peau et d'acide oléanolique resté dans la peau (Fig. 8). Ces résultats indiquent que les PMO peuvent permeer plus rapidement et davantage que les formulations qui ne forment pas de micelles.

Stabilité des micelles polymériques liquides d'acide oléanolique

Sur la base des études de caractérisation et de perméation in vitro, PMO-H a été finalement sélectionné pour la préparation d'ampoule. Avant la préparation d'ampoule, la stabilité de PMO-H a été évaluée. Pour l'étude de stabilité, PMO-H a été stocké dans des flacons sous conditions d'étude de stabilité accélérée à 40 °C/75 % HR pendant 3 mois. Précipitation, séparation de phase, changements de couleur et transparence ont ensuite été évalués visuellement. La proportion d'acide oléanolique a ensuite été mesurée par HPLC, et les changements de taille des particules ont également été vérifiés. La stabilité a été vérifiée au fil du temps. PMO-H est resté transparent sans précipitation ni séparation de phase, et sa couleur n'a pas changé pendant 3 mois sous les conditions de stabilité accélérée. La proportion d'acide oléanolique mesurée par HPLC et les changements de taille des particules au fil du temps sont montrés à la Fig. 9. La proportion d'acide oléanolique est restée supérieure à 98 %, et la taille des particules de 49,6 ± 5 nm est restée presque constante pendant la période d'étude de stabilité de 3 mois. Ces résultats montrent que PMO-H est physiquement et chimiquement stable pendant 3 mois sous les conditions de stabilité accélérée.

Test clinique

Test d'irritation humaine

Avant l'essai clinique, un test d'irritation humaine a été conduit sur 25 volontaires sains hommes et femmes âgés de 22–56 ans. Le produit test a été appliqué par patch sur le bras supérieur des sujets pendant 24 h, et l'indice d'irritation cutanée a été mesuré 30 min, 24 h et 48 h après le retrait du patch. Aucune irritation n'a été observée avec la formule cosmétique en ampoule contenant PMO-H à 1 h ou 48 h après le retrait du patch.

Essai clinique

L'essai clinique a été conduit sur 23 sujets féminins, âgés de 30–65 ans avec des rides autour des yeux ; en excluant les 3 abandons, 20 sujets ont complété l'essai en appliquant séparément à la fois le produit test, l'ampoule PMO-H, et le contrôle soit du côté gauche soit du côté droit de leur visage pendant 8 semaines. Les changements cutanés ont été évalués selon cinq paramètres — la rugosité moyenne (R3) comme critère principal, et quatre paramètres additionnels comme critères secondaires, à savoir la rugosité cutanée (R1), la rugosité maximale (R2), la profondeur de lissage (R4) et la rugosité moyenne arithmétique (R5). Le score d'évaluation visuelle a ajouté un critère secondaire supplémentaire. Les résultats sont résumés au Tableau 4.

Le critère principal R3 avait diminué de 0,673 % après 4 semaines d'utilisation du produit test et de manière statistiquement significative de 7,835 % après 8 semaines d'utilisation (p = 0,006). Avec l'application du contrôle, R3 avait augmenté de 5,127 % après 4 semaines d'utilisation et de manière statistiquement significative de 9,971 % après 8 semaines d'utilisation (p = 0,010). La différence de valeur R3 entre les zones traitées par le produit test et celles traitées par le contrôle était statistiquement significative après 8 semaines d'utilisation (p = 0,000) mais pas après 4 semaines, peut-être en raison de la variation inter-sujets (Fig. 10).

L'analyse du critère secondaire R1 a montré que la valeur avait diminué de 4,629 % après 4 semaines d'utilisation du produit test et de manière statistiquement significative de 9,973 % après 8 semaines d'utilisation (p = 0,017). Avec l'application du contrôle, R1 avait augmenté de 8,037 % après 4 semaines d'utilisation et de 4,799 % après 8 semaines d'utilisation. La différence des valeurs R1 entre les zones utilisant le produit test et le contrôle n'était pas statistiquement significative après 4 semaines d'utilisation mais l'était après 8 semaines (p = 0,024). Le critère secondaire R2 avait diminué de 1,048 % après 4 semaines d'utilisation du produit test et de 5,803 % après 8 semaines. Avec l'application du contrôle, il avait augmenté de 7,261 % après 4 semaines et de 9,536 % après 8 semaines. La différence de valeur R2 entre les zones traitées par le produit test et celles traitées par le contrôle était statistiquement significative après 8 semaines d'utilisation (p = 0,016) mais pas après 4 semaines. Le critère secondaire R4 avait significativement diminué de 8,594 % (p = 0,039) après 4 semaines d'utilisation du produit test et de 9,747 % après 8 semaines d'utilisation. Avec le contrôle, R4 avait augmenté de 10,764 % après 4 semaines d'utilisation et de 3,491 % après 8 semaines d'utilisation. Fait intéressant, la différence de valeur R4 entre les zones utilisant le produit test et le contrôle était statistiquement significative après 4 semaines d'utilisation (p = 0,008) mais pas après 8 semaines. Le critère secondaire R5 avait diminué de 6,333 % après 4 semaines d'utilisation du produit test et de 8,556 % après 8 semaines d'utilisation. La différence de valeur R5 entre les zones utilisant le produit test et le contrôle n'était pas statistiquement significative ni après 4 semaines ni même après 8 semaines d'utilisation.

L'analyse du critère secondaire supplémentaire, l'évaluation visuelle des rides, a montré que le score d'évaluation visuelle avait diminué de 2,917 % après 4 semaines d'utilisation du produit test et de manière statistiquement significative de 8,333 % après 8 semaines d'utilisation (p = 0,034). Avec l'application du contrôle, le score d'évaluation visuelle avait augmenté de 1,667 % après 4 semaines et de 4,167 % après 8 semaines. La différence du score d'évaluation visuelle entre les zones traitées par le produit test et par le contrôle était statistiquement significative après 8 semaines d'utilisation (p = 0,046) mais pas après 4.

En résumé, l'analyse de la zone ridée autour des yeux a montré que la différence de la valeur du critère principal R3 entre les zones traitées par le produit test et par le contrôle était statistiquement significative après 8 semaines d'utilisation. En termes de critères secondaires, toutes les valeurs avaient diminué après l'utilisation du produit test et augmenté après l'utilisation du contrôle. La différence des valeurs R4 entre les zones traitées par le produit test et celles traitées par le contrôle était statistiquement significative après 4 semaines d'utilisation, mais la différence des valeurs R1 et R2 n'était statistiquement significative qu'après 8 semaines d'utilisation (Fig. 11). Le score d'évaluation visuelle par des professionnels a montré que tous les scores moyens d'évaluation visuelle pour les rides avaient diminué après 4 semaines et 8 semaines de traitement par le produit test comparé au contrôle (Tableau 5). La différence du score d'évaluation visuelle entre les zones traitées par le produit test et par le contrôle était statistiquement significative après 8 semaines d'utilisation (Fig. 12). Globalement, selon tous les critères, la formule cosmétique contenant PMO-H comme ingrédient principal a été trouvée pour aider à améliorer les rides après 8 semaines d'utilisation (Fig. 13).

Conclusions

Les tensioactifs sont des excipients couramment utilisés dans les produits cosmétiques pour améliorer la solubilité des matériaux peu solubles. Une mise en garde serait la quantité incluse dans le produit. Les tensioactifs devraient être ajoutés en quantité suffisante pour dissoudre les matériaux peu solubles sans précipitation. Seule une quantité minimale devrait être ajoutée pour des raisons de sécurité. La formulation en micelles pourrait être la solution à ce problème. Les micelles polymériques d'acide oléanolique développées dans cette étude améliorent la solubilité de l'acide oléanolique avec une quantité minimale de tensioactifs et améliorent la perméation de l'acide oléanolique à travers la peau. Des micelles polymériques stables d'acide oléanolique ont été développées en utilisant Capryol 90 et poloxamer. Les micelles polymériques d'acide oléanolique développées dans cette étude étaient stables, c.-à-d. qu'elles ne montraient aucune précipitation, séparation de phase ou dégradation à 40 °C après 3 mois. L'essai clinique a montré qu'en tant qu'ingrédient actif principal, l'acide oléanolique dans la formulation en micelles polymériques est efficace pour atténuer les rides humaines. Sur la base de ces résultats, on peut conclure que l'acide oléanolique, qui est peu soluble dans l'eau et donc inutilisable sous forme native comme ingrédient principal pour atténuer les rides cutanées, peut être formulé en micelles polymériques applicables. De plus, on s'attend à ce que les micelles polymériques d'acide oléanolique développées dans cette étude s'avèrent très utiles pour atténuer les rides humaines et s'avèrent largement applicables aux applications cosmétiques.