Développement de micelles polymères d'acide oléanolique et évaluation de leur efficacité clinique

Introduction

Le vieillissement cutané comprend l'affaissement (laxité), l'amincissement et les rides. Elle peut être accélérée par une infection, le tabagisme, les rayons UV, un traumatisme, un déséquilibre hormonal, le stress et/ou des pro-oxydants tels que les hydrolases dont l'élastinase ou la collagénase [1]. Les espèces réactives de l'oxygène ou les radicaux libres générés par les causes mentionnées ci-dessus endommagent les cellules voisines et entraînent une réduction de l'élasticité et de l'amincissement de la peau [2, 3]. En particulier, la lumière UV est connue pour déclencher la génération d'espèces réactives de l'oxygène, qui endommagent les lipides membranaires, les protéines cellulaires et l'ADN, et accélèrent ainsi le développement des rides d'expression, des taches de rousseur et du mélasma [1,2,3,4]. L'acide oléanolique est un composant efficace d'origine végétale naturelle extrait de plusieurs espèces végétales et utilisé comme ingrédient médical et cosmétique majeur. On le trouve également dans les fruits comme les pommes ou les poires [5]. En tant que sorte de terpène hydroxy pentacyclique, l'acide oléanolique a d'abord été isolé de l'olive (Olea europaea ) feuilles et se trouve largement dans les plantes, y compris la swertia d'Asie de l'Est (Eugenia jambos ) et la gentiane jaune (Gentiana lutea ). Il favorise les fonctions anti-âge via la synthèse non seulement de pro-collagène, qui est important pour la synthèse de collagène, mais aussi de céramides et de filaggrine, et aussi en inhibant l'activité de la MMP-1, une enzyme qui dégrade les protéines comme le collagène. 5, 6]. Sur la base de ces résultats, on peut supposer que l'acide oléanolique a un double effet anti-âge en favorisant non seulement la production de collagène mais aussi en empêchant la dégradation du collagène [7]. De ce fait, l'acide oléanolique est un ingrédient anti-âge très prometteur pour les produits cosmétiques. Cependant, l'utilisation de l'acide oléanolique dans les produits cosmétiques comme ingrédient principal est limitée par sa faible solubilité aqueuse; ainsi, seules de petites quantités d'acide oléanolique dans le cadre d'une formulation émulsionnée ont été utilisées comme ingrédient subsidiaire dans des produits cosmétiques [8]. Ses propriétés physico-chimiques liées à l'absorption cutanée incluent son point de fusion, son poids moléculaire, son coefficient de partage et son hydrophilie. Son point de fusion est supérieur à 300°C, indiquant qu'il s'agit d'un matériau hautement cristallin. Les matériaux hautement cristallins nécessitent une plus grande énergie pour la dissolution, présentent une faible biodisponibilité en raison de leur solubilité limitée et sont donc mal absorbés [9]. De plus, les composés hautement hydrophiles ou lipophiles, ou les composés de poids moléculaire élevé sont connus pour ne pas pénétrer facilement la peau [10, 11]. La méthode la plus fréquemment utilisée pour améliorer la perméation cutanée de telles molécules est la synthèse de précurseurs ou l'utilisation de supports médicamenteux colloïdaux. À cet égard, les liposomes, les émulsions et les micelles polymères ont été activement étudiés [12].

Les micelles polymères sont des agrégats auto-assemblés à l'échelle nanométrique formant des structures cœur-coquille en solution aqueuse. Les micelles polymères sont souvent constituées de copolymères diblocs ou triblocs qui peuvent former un noyau interne hydrophobe et une enveloppe externe hydrophile [13, 14]. Les micelles polymères sont considérées comme plus stables physiquement que les micelles tensioactives car les propriétés des micelles polymères varient en fonction du type et du rapport des monomères polymères dans un copolymère séquencé et ont des concentrations de micelles critiques relativement faibles [15, 16].

Dans cette étude, nous avons préparé des micelles polymères d'acide oléanolique et évalué la taille et la forme de leurs particules, ainsi que l'efficacité d'encapsulation et le taux de perméation cutanée de l'acide oléanolique qui en résultent. La stabilité physique de l'acide oléanolique sous cette forme a également été évaluée pendant 3 mois. L'effet anti-rides humain de l'acide oléanolique dans la formulation de produits cosmétiques a également été étudié.

Matériaux et méthodes

Matériaux

L'acide oléanolique, le Tween 80, le Tween 20 et le Tween 60 ont été achetés auprès de TCI (Tokyo, Japon). Le PEG 400, le Pluronic F127 et le Pluronic F68 ont été obtenus auprès de BASF (Ludwigshafen, Allemagne). Le propylène glycol, le PEG 300 et le PEG 200 ont été obtenus auprès de JUNSEI (Tokyo, Japon). TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 et Capryol™ PGMC ont été achetés auprès de Gattefossé (Lyon, France). EDTA disodique (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Corée), allantoïne (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA), dipropylène glycol (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Corée), propanediol (DuPont Tate &Lyle Bio Products Company, LLC, Loudon, USA), carbomer (The Lubrizol Corporation, Ohio, USA) PEG/PPG/polybutylène glycol-8/5/3 glycérine (NOF Corporation, Tokyo, Japon), sodium hyaluronate (TCI, Tokyo, Japon), bêta-glucane (SK Bioland, Cheonan, Corée), phénoxyéthanol (Daejung Chemical &Metals Co., Ltd., Siheung, Corée), caprylyl glycol (J TWO K BIO CO., Ltd. , Cheongju, Corée) et de l'éthylhexylglycérine (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Corée) ont été utilisés pour préparer le produit cosmétique contenant de l'acide oléanolique. L'acétonitrile de qualité HPLC a été obtenu auprès de Burdick &Jackson (Muskegon, MI, USA). De l'eau triple distillée a été utilisée et les autres solvants et réactifs étaient de qualité EP et GR. Crlori :Des souris femelles glabres SKH de 1 h ont été achetées auprès d'OrientBio (Seongnam, Corée).

Analyse HPLC

L'acide oléanolique a été analysé en utilisant la HPLC série Shimadzu LC-30 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japon). Une colonne analytique Kromasil 100 C18 250 mm × 4,6 mm, 5 μm (Teknokroma, Barcelone, Espagne) a été utilisée à température ambiante. La phase mobile était constituée d'acétonitrile et d'eau (85:15, v/v), le débit était de 1 mL/min et le volume d'injection de 10  μL. L'acide oléanolique a été analysé aux UV λ =210 nm. Toutes les mesures ont été prises à température ambiante [17].

Étude d'optimisation de la solubilité et de la formulation

Une quantité mesurée d'acide oléanolique a été ajoutée à un solubilisant, agitée à 60 °C pendant 48 h et soniquée pendant 5 min à l'aide d'un nettoyeur à ultrasons. La suspension a été centrifugée à 2000 rpm en utilisant une centrifugeuse Universal 320R (Hettich, Tuttlingen, Allemagne), et le surnageant a ensuite été récupéré. Ensuite, le surnageant a été filtré à travers un filtre à membrane PVDF de 0,45 µm (Whatman, Kent, UK). La solubilité de l'acide oléanolique dans le solubilisant correspondant a été estimée en soustrayant le poids des solides restants de la somme des poids initiaux de l'acide oléanolique et du solubilisant (tableau 1).

L'étude d'optimisation de la formulation a été menée en utilisant du poloxamer 188, du poloxamer 407, du Tween 60 et du Tween 80. Divers rapports de polymères amphiphiles et de tensioactifs ont été essayés, comme résumé dans le tableau 2. Chacun de l'acide oléanolique et du Capryol® 90 a été pesé, chauffé et agité. à plus de 60°C jusqu'à ce que des solutions claires soient observées. Les polymères/tensioactifs indiqués dans le tableau 2 ont ensuite été ajoutés à la solution limpide et agités à plus de 60°C jusqu'à ce que des solutions limpides soient observées. Les solutions ont ensuite été dispersées dans de l'eau distillée (Fig. 1). La solution résultante a été laissée pendant environ 48 h, et une inspection visuelle a ensuite été effectuée pour sélectionner la formulation optimale. Les résultats des inspections visuelles de chaque formulation dans le tableau 2, y compris les observations de précipitation, de séparation de phases, de transparence et de gélification, sont résumés dans le tableau 3.

Représentation schématique de la préparation de micelles d'acide oléanolique

Préparation de micelles polymères d'acide oléanolique

Des micelles polymères d'acide oléanolique (PMO) ont été préparées en utilisant les formulations G et H du tableau 2 en utilisant la méthode illustrée à la figure 1. PMO-G et PMO-H ont été utilisés pour les expériences ultérieures et PMO-H dans les produits cosmétiques pour le essais cliniques.

Test de coloration

La micellisation polymère lorsque la formulation G ou la formulation H était dispersée dans l'eau a été confirmée par observation visuelle, c'est-à-dire par transparence. La formation de PMO (PMO-G ou PMO-H) a également été confirmée par un test de coloration. Du bleu de méthylène a été ajouté aux mélanges d'eau et de Capryol® 90, d'eau, de Capryol® 90, de PMO-G et de PMO-H et la couleur des solutions a été observée visuellement et photographiée.

Mesure de la taille des particules

La technique ELS (diffusion électrophorétique de la lumière) mesure la fluctuation de l'intensité de diffusion des particules en fonction du temps lorsque les particules présentent à la fois un mouvement brownien aléatoire et un mouvement électrophorétique orienté dans un champ électrique bien défini. La mobilité électrophorétique des particules est mesurée par la technique ELS [18] et a permis d'évaluer la taille des particules de PMO-G et PMO-H à l'aide d'un spectrophotomètre à diffusion de lumière électrophorétique (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Japon).

Analyse par cryomicroscopie électronique à balayage (Cryo-SEM)

La microscopie électronique à balayage cryogénique ou cryomicroscopie électronique à balayage (cryo-MEB) est une technique puissante pour visualiser l'état de la microstructure ou de la nanostructure des suspensions ou dispersions de polymères colloïdaux après qu'elles aient été immobilisées par congélation rapide et fracturées pour l'imagerie. La fracture est réalisée et examinée à − 196°C, le point d'ébullition normal de l'azote liquide et bien en dessous de la température de transition vitreuse des particules en vrac et totalement coalescées. Les images cryo-SEM révèlent une gamme de réponses des particules aux fractures qui se propagent à travers la glace [19]. La cryomicroscopie électronique à balayage (Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Sample Preparation System) a été utilisée pour observer la forme des PMO.

Efficacité de l'encapsulation

L'efficacité d'encapsulation des micelles polymères d'acide oléanolique a été évaluée. Le PMO a été centrifugé à 2000 rpm pendant 15 min, et le surnageant a été collecté et analysé par HPLC. L'efficacité d'encapsulation a été calculée comme la quantité d'acide oléanolique dans les micelles polymères divisée par la quantité d'acide oléanolique initialement ajoutée (mg) lors de la préparation du PMO.

Stabilité du PMO-H

La stabilité physique du PMO-H a été évaluée en le stockant à 40°C pendant 3 mois. Les changements de couleur, la séparation des phases, la présence de précipités et les changements de turbidité ont été évalués visuellement. Des échantillons de PMO-H prélevés à intervalles de temps réguliers ont été analysés par HPLC pour déterminer les quantités d'acide oléanolique restantes et par un ELS-Z pour déterminer la taille des particules de PMO-H. Les résultats sont présentés sur la figure 9

Test de perméation cutanée in vitro

Une étude de perméation cutanée in vitro a été réalisée à l'aide d'une cellule de diffusion de Franz pour étudier l'amélioration de la perméation cutanée de l'acide oléanolique. Le test a été réalisé sur PMO-G, PMO-H, le mélange d'acide oléanolique et de Tween 80 dispersé dans de l'eau distillée, et le mélange d'acide oléanolique et de propylène glycol dispersé dans de l'eau distillée. La peau d'une souris sans poils femelle âgée de 6 semaines a été coupée en morceaux de la taille requise. Des cellules de Franz verticales ont été utilisées et la peau a été fixée entre les deux chambres avec sa couche cornée tournée vers le haut. 330 μl de la formulation sélectionnée ont été appliqués sur la peau et les cellules de Franz ont été recouvertes de parafilm. Le récepteur a été rempli d'une solution de PBS (pH 7,4) et d'éthanol dans un rapport de 9:1 (v/v). La solution réceptrice a été rechargée avec une nouvelle solution de PBS à chaque instant d'échantillonnage. Des échantillons ont été prélevés à 2, 4, 6, 8, 10, 20 et 24 h et analysés par HPLC. Après 24 h, l'excès de formulation restant sur la peau a été éliminé avec Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Australie). La peau utilisée dans l'étude de perméation a été nettoyée avec une solution de PBS et l'acide oléanolique restant dans la peau a été mesuré par HPLC. Toutes les expériences de perméation ont été réalisées en triple.

Statistiques de l'étude

Les expériences ont été réalisées en trois répétitions indépendamment, et les résultats de cette étude ont été rapportés en moyenne ± SD. L'analyse statistique a été vérifiée par t indépendant test, et la valeur de p <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Préparation d'ampoules avec PMO-H

Pour le test clinique, le PMO-H a été utilisé comme produit de test. Du PMO-H, de l'eau purifiée, de l'EDTA disodique, de l'allantoïne, du dipropylène glycol, du propanediol, du carbomère et du PEG/PPG/polybutylène glycol-8/5/3 glycérine ont été ajoutés et agités pendant 10 à 15 min à l'aide d'un agitateur magnétique, puis du potassium de l'hydroxyde a été ajouté et le mélange a encore été agité pendant 5 à 10 min. Une fois les ingrédients mélangés de manière homogène, du hyaluronate de sodium et du bêta-glucane ont été ajoutés et agités pendant 2 à 5 min supplémentaires, puis du phénoxyéthanol, du propanediol, du caprylyl glycol et de l'éthylhexylglycérine ont été ajoutés et agités pendant 2 à 5 min. La formule finale a été ajoutée à une ampoule comme produit d'essai. Les bulles d'air de l'ampoule ont été éliminées à l'aide d'une étuve sèche sous vide avant l'utilisation d'essai. Un contrôle a été préparé selon la même méthode pour le produit à tester sauf que l'acide oléanolique a été exclu.

Tests d'application humaine

Étude sur l'irritation de la peau humaine

Un patch test cutané du produit cosmétique, qui contenait du PMO-H dans une ampoule, a été réalisé sur 25 sujets masculins et féminins âgés de 22 à 56 ans qui avaient accepté de participer à un test d'irritation de la peau humaine. Chaque substance d'essai a été déposée sur la partie supérieure du bras et fixée avec un patch. Le patch a été fixé pendant 24 h et le degré de stimulation a été observé par 2 professionnels 30 min, 24 h et 48 h après le retrait du patch selon les critères de l'International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG).

Essai clinique pour l'amélioration des rides

Des micelles polymères contenant de l'acide oléanolique dans une ampoule sous forme de produit final ont été appliquées autour des yeux de 23 sujets féminins âgés de 30 à 65 ans qui avaient accepté de participer au test d'amélioration des rides. Les sujets remplissaient les critères d'inclusion et aucun des critères d'exclusion et ont accepté de participer au test d'application humaine. La méthode en double aveugle a été suivie par les chercheurs et les sujets de test. Le test a été effectué pendant 8 semaines et l'évaluation a été effectuée toutes les 4 semaines. La méthode en double aveugle et la répartition aléatoire ont été utilisées. Le produit à tester et le contrôle ont été appliqués séparément au hasard sur le côté gauche ou droit du visage du même sujet. Cinq paramètres ont été évalués par profilométrie optique à l'aide du visiomètre cutané SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Cologne, Allemagne) toutes les 4 semaines pendant 8 semaines — la rugosité moyenne (R3) était le critère d'évaluation principal, et les quatre paramètres de la rugosité de la peau (R1) , la rugosité maximale (R2), la profondeur de lissage (R4) et la rugosité moyenne arithmétique (R5) étaient les critères secondaires. Les augmentations ou diminutions des cinq paramètres sur la même zone du sujet ont été mesurées au cours du temps, et les valeurs moyennes d'augmentation ou de diminution des cinq paramètres ont été calculées et comparées entre les traitements du produit témoin et test. De plus, une observation visuelle de la peau a été réalisée par des professionnels. Des photographies des rides des yeux ont été prises en utilisant Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Suwon, Corée). Les critères utilisés pour déterminer les scores d'évaluation visuelle sont présentés sur la figure S1 et les résultats visuels sont présentés sur la figure 13. Les paramètres ont été comparés et analysés à l'aide d'échantillons appariés t test avec une fiabilité de 95 % [20,21,22,23,24,25].

Résultats et discussion

Détermination du solubilisant, du tensioactif et du polymère

La solubilité de l'acide oléanolique dans les solubilisants biocompatibles, en particulier les tensioactifs et les polymères, est indiquée dans le tableau 1. L'acide oléanolique a tendance à être soluble dans les huiles hydrophobes avec un faible équilibre hydrophile-lipophile (HLB). Capryol® 90 a une valeur HLB légèrement supérieure à celle des huiles générales [26]. Cependant, l'acide oléanolique présente une solubilité relativement élevée dans le Capryol® 90. De plus, le Capryol® 90 peut être facilement stabilisé en tant que noyau interne des micelles [27]. Après avoir sélectionné le Capryol® 90, plusieurs types de tensioactifs ou poloxamères ont été criblés pour la partie enveloppe des micelles d'acide oléanolique [27,28,29,30]. Les compositions micellaires d'acide oléanolique présentées dans le tableau 2 sont celles qui étaient transparentes immédiatement après avoir été diluées avec de l'eau distillée. Cependant, certaines compositions étaient instables et ont subi une précipitation, une séparation de phases ou une gélification dans les 24  h. Des images représentatives d'états précipités, séparés de phases, de liquide transparent et de gel sont présentées sur la figure 2. L'état final de chaque formule est résumé dans le tableau 3. Les compositions G et H sont restées transparentes même après 24 h. Bien que la composition soit restée claire, c'était un gel plutôt qu'un liquide. Les compositions A à D deviennent opaques avec précipitation après 24 h. Compte tenu de ces résultats, les compositions G et H ont été sélectionnées pour un développement ultérieur.

Images représentatives de a précipitations, b séparation de phases, c liquide transparent, et d gélification des micelles d'acide oléanolique

Caractéristiques des micelles polymères de l'acide oléanolique

Les structures des micelles polymères de l'acide oléanolique ont été étudiées par un test de coloration. La figure 3 montre les images du mélange de Capryol® 90 et eau distillée, Capryol® 90, eau distillée, et les micelles polymériques de composition G (PMO-G) et de composition H (PMO-H), après ajout de bleu de méthylène à la solution. Une nette séparation des phases s'est produite pour le mélange de Capryol® 90 et d'eau distillée. Une précipitation de bleu de méthylène a été observée dans le cas du Capryol® 90. L'eau distillée virait au bleu foncé après l'ajout de bleu de méthylène. PMO-G et PMO-H sont également devenus bleus, indiquant que les micelles polymères étaient constituées d'un noyau interne en phase huileuse et d'une enveloppe externe en phase aqueuse. En d'autres termes, un polymère amphiphile, le poloxamère 407 dans les compositions G et H, sert d'enveloppe externe et aide à former avec succès des micelles polymères d'acide oléanolique en encapsulant le noyau interne de Capryol® 90 contenant de l'acide oléanolique [31].

Test de coloration au bleu de méthylène :(a ) mélange de Capryol® 90 et d'eau distillée, (b ) Capryol® 90, (c ) eau distillée, (d ) PMO-G, et (e ) PMO-H

La taille, la distribution granulométrique et la forme des particules peuvent être de bons indicateurs pour prédire la stabilité physique des formulations micellaires. La taille moyenne des particules de PMO-G était de 80,4 nm et celle de PMO-H était de 57  nm (Fig. 4). Les histogrammes de PMO-A, G et H sont présentés sur la figure 5 pour comparer les distributions de taille affectées par l'état de phase. Comme le montre le tableau 3, PMO-A est opaque en raison des précipitations, et PMO-G et H sont transparents. La taille des particules de PMO-A est supérieure à 100  nm, et PMO-A montre une distribution granulométrique plus large que PMO-G et H (Fig. 5). Le PMO-H présente une distribution granulométrique plus étroite que le PMO-G et présente une fluidité adaptée aux produits cosmétiques.

La taille moyenne des particules de PMO-G et PMO-H du tableau 2 : 80,4 ± 11,1 nm (PMO-G) et 57 ± 5,24  nm (PMO-H)

Histogramme d'analyse de particules de trois échantillons PMO différents. un PMO-A, 121,28  nm; b PMO-G, 80,4 nm ; et (c ) PMO-H, 57 nm

L'efficacité d'encapsulation pour le PMO-G et le PMO-H était de 99 à 100 %, ce qui indique que près de 100 % de l'acide oléanolique était encapsulé dans le noyau interne du PMO (Fig. 6).

Efficacité d'encapsulation de PMO-G et PMO-H montrant une efficacité d'encapsulation de près de 100 % :98,26 ± 0,17 % (PMO-G) et 99,18 ± 1,06 % (PMO-H)

La forme de PMO-G et PMO-H a été étudiée par cryomicroscopie électronique à balayage (Cryo-SEM). Cryo-SEM a montré que PMO-G et PMO-H étaient des micelles polymères de forme sphérique. Cependant, les micelles polymères PMO-H étaient plus cohérentes en taille et en forme que les micelles polymères PMO-G (Fig. 7).

Images cryomicroscopiques électroniques à balayage de a PMO-G et b PMO-H

Étude de perméation cutanée in vitro du PMO

La quantité totale d'acide oléanolique restant dans la peau et la quantité totale d'acide oléanolique pénétrant à travers la peau en fonction du temps ont été mesurées en utilisant la peau d'une souris sans poils femelle âgée de 6 semaines. Quatre formulations différentes, PMO-G, PMO-H, le mélange d'acide oléanolique et de Tween 80 dispersé dans de l'eau distillée (OTw), et le mélange d'acide oléanolique et de propylène glycol dispersé dans de l'eau distillée (OPG) ont été comparés en termes de peau efficacité de perméation de l'acide oléanolique. Les quantités totales d'acide oléanolique pénétrées à travers la peau après 24 h étaient de 29,49 ± 4,00 % pour PMO-H, 21,39 ± 5,91 % pour PMO-G, 13,66 ± 0,81 % pour OTw et 5,90 ± 2,47 % pour OPG. Comme le montre la figure 7, la première détection d'acide oléanolique dans le cas du PMO-G et du PMO-H était possible à 8 h, tandis que la première détection d'acide oléanolique dans OTw était possible à 10 h et OPG à 20 h. Les proportions d'acide oléanolique laissées dans la peau étaient de 56,22 ± 13,50 % pour PMO-H, 36,74 ± 0,72 % pour PMO-G, 27,44 ± 7,02 % pour OTw et 26,28 ± 5,42 % pour OPG. PMO-H a montré la plus grande quantité d'acide oléanolique pénétrant à travers la peau et d'acide oléanolique restant dans la peau (Fig. 8). Ces résultats indiquent que les PMO peuvent imprégner plus rapidement et plus que les formulations qui ne forment pas de micelles.

Quantité totale d'acide oléanolique dans le PMO-G, le PMO-H, l'acide oléanolique et le mélange de Tween 80 dispersé dans de l'eau distillée (Otw) et un mélange d'acide oléanolique et de propylène glycol dispersé dans de l'eau distillée (OPG) pénétrant à travers la peau et la quantité d'acide oléanolique acide dans chaque formulation en fonction du temps. Quantité d'acide oléanolique restée dans la peau après 24 h :36,74 ± 0,72 % (PMO-G), 56,22 ± 13,50 % (PMO-H), 27,44 ± 7,02 % (Otw) et 26,28 ± 5,42 % (OPG). Quantité d'acide oléanolique imprégnée après 24 h :21,39 ± 5,91 % (PMO-G), 29,49 ± 4,00 % (PMO-H), 13,66 ± 0,81 % (Otw) et 5,90 ± 2,67 % (OPG)

Stabilité des micelles polymères d'acide oléanolique liquide

Sur la base des études de caractérisation et de perméation in vitro, le PMO-H a finalement été sélectionné pour la préparation des ampoules. Avant la préparation des ampoules, la stabilité de l'ONM-H a été évaluée. Pour l'étude de stabilité, le PMO-H a été stocké dans des flacons dans des conditions d'étude de stabilité accélérée à 40 °C/75 % HR pendant 3 mois. Les précipitations, la séparation des phases, les changements de couleur et la transparence ont ensuite été évalués visuellement. La proportion d'acide oléanolique a ensuite été mesurée par HPLC, et les changements de taille des particules ont également été vérifiés. La stabilité a été vérifiée dans le temps. Le PMO-H est resté transparent sans précipitation ni séparation de phases, et sa couleur n'a pas changé pendant 3 mois dans les conditions de stabilité accélérée. La proportion d'acide oléanolique mesurée par HPLC et l'évolution de la taille des particules au fil du temps sont illustrées à la figure 9. La proportion d'acide oléanolique est restée supérieure à 98 % et la taille des particules de 49,6 ± 5 nm est restée presque constante pendant les 3 mois de stabilité. Période d'étude. Ces résultats montrent que le PMO-H est physiquement et chimiquement stable pendant 3 mois dans les conditions de stabilité accélérée.

Le contenu et la granulométrie du PMO-H changent au cours de 3 mois de test de stabilité en condition d'accélération à 40 °C/75% HR. Proportion d'acide oléanolique dans le PMO-H :100 ± 1,6% (0 mois), 99,9 ± 0,2% (1 mois), 99,5 ± 0,2% (2 mois) et 99,3 ± 0,2% (3 mois). Taille des particules de PMO-H :55,3 ± 6,5  nm (0 mois), 54,6 ± 7 nm (1 mois), 51,0 ± 5,56 nm (2 mois) et 49,6 ± 5 nm (3 mois)

Test clinique

Test d'irritation humaine

Avant l'essai clinique, un test d'irritation humaine a été réalisé sur 25 volontaires sains, femmes et hommes, âgés de 22 à 56 ans. Le produit testé a été appliqué sur le haut du bras des sujets pendant 24 h et l'indice d'irritation de la peau a été mesuré 30 min, 24 h et 48 h après le retrait du patch. Aucune irritation n'a été observée avec la formule d'ampoules cosmétiques contenant du PMO-H à 1 h ou 48 h après le retrait du patch.

Essai clinique

L'essai clinique a été mené sur 23 sujets féminins, âgés de 30 à 65 ans et présentant des rides autour des yeux; à l'exclusion des 3 abandons, 20 sujets ont terminé l'essai en appliquant séparément à la fois le produit à tester, l'ampoule PMO-H et le contrôle sur les côtés gauche ou droit de leur visage pendant 8 semaines. Les modifications de la peau ont été évaluées en fonction de cinq paramètres :la rugosité moyenne (R3) comme critère d'évaluation principal et quatre paramètres supplémentaires comme critères d'évaluation secondaires, à savoir la rugosité de la peau (R1), la rugosité maximale (R2), la profondeur de lissage (R4) et la rugosité moyenne arithmétique. (R5). Le score d'évaluation visuelle a ajouté un autre critère d'évaluation secondaire. Les résultats sont résumés dans le tableau 4.

Le critère d'évaluation principal R3 avait diminué de 0,673 % après 4  semaines d'utilisation du produit testé et de manière statistiquement significative de 7,835% après 8  semaines d'utilisation (p =0,006). Avec l'application de contrôle, R3 avait augmenté de 5,127% après 4  semaines d'utilisation et de manière statistiquement significative de 9,971% après 8  semaines d'utilisation (p =0,010). The difference in R3 value between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.000) but not statistically significant after 4 weeks of use, perhaps due to inter-subject variation (Fig. 10).

Changes in primary endpoint value, R3, before, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of an ampoule containing polymeric micelles of oleanolic acid and the control during clinical trial. R3 value of test product use:0.094 ± 0.023 before use, 0.093 ± 0.023 after 4 weeks use, 0.086 ± 0.020 after 8 weeks use. R3 value of control product:0.087 ± 0.023 before use, 0.091 ± 0.025 after 4 weeks use, 0.095 ± 0.024 after 8 weeks use (A.U. for arbitrary unit). * ¹ The wrinkle analysis of R3 value decreased statistically significantly. * ² The wrinkle analysis of R3 value increased statistically significantly

The analysis of the secondary endpoint R1 showed that the value had decreased by 4.629% after 4 weeks of test product use and statistically significantly by 9.973% after 8 weeks of use (p =0.017). With control application, R1 had increased by 8.037% after 4 weeks of use and 4.799% after 8 weeks of use. The difference in R1 values between the areas using the test product and the control was not statistically significant after 4 weeks of use but was after 8 weeks of use (p =0.024). The secondary endpoint R2 had decreased by 1.048% after 4 weeks of test product use and 5.803% after 8 weeks. With control application, it had increased by 7.261% after 4 weeks and 9.536% after 8 weeks. The difference in R2 value between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.016) but not after 4 weeks of use. The secondary endpoint R4 had significantly decreased by 8.594% (p =0.039) after 4 weeks of test product use and by 9.747% after 8 weeks of use. With the control, R4 had increased by 10.764% after 4 weeks of use and 3.491% after 8 weeks of use. Interestingly, the difference in R4 value between the areas using the test product and the control was statistically significant after 4 weeks of use (p =0.008) but not after 8 weeks. The secondary endpoint R5 had decreased by 6.333% after 4 weeks of test product use and 8.556% after 8 weeks of use. The difference in R5 value between the areas of using the test product and the control was not statistically significant following 4 weeks or even 8 weeks of use.

The analysis of the further secondary endpoint, the visual evaluation of wrinkles, showed that the visual evaluation score had decreased by 2.917% after 4 weeks of test product use and statistically significantly decreased by 8.333% after 8 weeks of use (p =0.034). With application of the control, the visual evaluation score had increased by 1.667% after 4 weeks and 4.167% after 8 weeks. The difference of the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.046) but not after 4.

In summary, the analysis of the wrinkled area around the eyes showed that the difference in the primary endpoint value R3 between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use. In terms of the secondary endpoints, all values had decreased after test product use and increased after control use. The difference in R4 values between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 4 weeks of use, but the difference of the R1 and R2 values were statistically significant only after 8 weeks of use (Fig. 11). The visual evaluation score by professionals showed that all the average visual evaluation scores for wrinkles had decreased after 4 weeks and 8 weeks of test product treatment compared to the control (Table 5). The difference in the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (Fig. 12). Overall, according to all endpoints, the cosmetics formula containing PMO-H as a primary ingredient was found to help improve wrinkles after 8 weeks of use (Fig. 13).

Results of secondary endpoint R1, R2, R4, and R5 for skin wrinkle measurement—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Please refer to Table 4 for the exact values (A.U. for arbitrary unit)

Results of visual evaluation of skin—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Test product:3.050 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.999 after 4 weeks use, and 2.75 ± 0.851 after 8 weeks. Control product:2.900 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.945 after 4 weeks use, and 3.000 ± 0.918 after 8 weeks use. * ¹ The visual evaluation grade of wrinkles by professionals decreased significantly. * ² The visual evaluation grade of wrinkles by professionals increased significantly

Pictures of the tested areas

Conclusions

Surfactants are commonly used excipients in cosmetic products to improve solubility of poorly soluble materials. One caveat would be the amount included in the product. Surfactants should be added in sufficient amount to dissolve poorly soluble materials without precipitation. Only a minimal amount should be added for safety reasons. Micelle formulation could be the solution to this problem. Polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study improve the solubility of oleanolic acid with a minimum amount of surfactants and enhance the permeation of oleanolic acid through the skin. Stable polymeric micelles of oleanolic acid were developed using Capryol 90 and poloxamer. The polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study were stable, that is, they did not show any precipitation, phase separation, or degradation at 40 °C after 3 months. The clinical trial showed that, as a main active ingredient, the oleanolic acid in the polymeric micelle formulation is effective for alleviating human wrinkles. Based on these findings, it can be concluded that oleanolic acid, which is poorly soluble in water and therefore, unusable in a native form as a principal ingredient for alleviating skin wrinkles, can be formulated into applicable polymeric micelles. Furthermore, it is expected that the polymeric micelles of oleanolic acid developed in this study will prove very useful for alleviating human wrinkles and will prove widely applicable to cosmetic applications.

Disponibilité des données et des matériaux

Not applicable

Abréviations

PMO:

Polymeric micelles of oleanolic acid

PEG :

Polyéthylène glycol

TRANSCUTOL P:

Highly purified diethylene glycol monoethyl ether

LABRASOL:

PEG-8 Caprylic/Capric Glycerides

LAUROGLYCOL FCC:

Propylene glycol monolaurate (type I, monoesters>45%)

LABRAFAC:

Caprylic/Capric Triglyceride

Capryol® 90:

Propylene glycol monocaprylate (type II, monoesters>90%)

Capryol™ PGMC:

Propylene glycol monocaprylate (type I, monoesters>55%)

EDTA :

Ethylenediaminetetraacetic Acid

ELS:

Electrophoretic light scattering