Biosécurité et capacité antibactérienne du graphène et de l'oxyde de graphène in vitro et in vivo

Contexte

Ces dernières années, les implants chirurgicaux sont largement utilisés pour traiter les fractures osseuses et d'autres maladies, mais l'implant a besoin à la fois d'une bonne biosécurité et de propriétés antibactériennes pour éviter le rejet et l'infection. En effet, le traitement orthopédique des défauts osseux infectieux reste un problème majeur. Du côté des bactéries, Staphylococcus aureus est le pathogène le plus fréquent en orthopédie et implant orthopédique [1]. En raison d'un défaut osseux et d'une infection [2], le traitement est difficile et les patients ont besoin de beaucoup de temps pour guérir. Si la plaie ne guérit pas, le dernier traitement est l'amputation d'un membre [3, 4].

Un bon traitement du défaut osseux infectieux doit satisfaire à la fois le contrôle de l'infection et la demande de reconstruction de la réparation du défaut osseux simultanément. Avec le développement de l'ingénierie du tissu osseux, un nombre croissant d'applications de biomatériaux sont utilisés dans le domaine du traitement orthopédique. Le taux de guérison de l'infection dans les os peut donc être grandement amélioré. Ces matériaux comprennent principalement les os hétérogènes [5], les biocéramiques [6] (telles que l'hydroxyapatite [7] et le phosphate de calcium [8]), les polymères [9, 10], les matériaux protéiques (tels que les fibres de collagène [11]), etc. A côté de ces matériaux, Beatriz Pelaz et al. ont révélé l'importance et les perspectives prometteuses des nanotechnologies dans les implants [12]; parmi ces nanoparticules, le graphène et ses dérivés sont d'autres nouveaux matériaux pour répondre aux exigences de la réparation osseuse.

Le graphène est bidimensionnel, avec une seule ou quelques couches d'atomes de carbone dans une structure en nid d'abeille [13,14,15]. Il est largement utilisé dans les matériaux composites [16, 17], les capteurs [18, 19], l'énergie [16, 20] et d'autres domaines en raison de ses excellentes propriétés physiques. L'oxyde de graphène est un matériau de graphène fonctionnalisé en surface qui se trouve dans une couche d'atomes de carbone liés à une extension infinie bidimensionnelle des groupes tensioactifs de base contenant de l'oxygène et sa forme d'oxyde de graphène [21]. Le graphène (G) et ses dérivés ont suscité de vives inquiétudes dans le domaine biomédical en raison de sa structure bidimensionnelle unique, ainsi que de ses propriétés physiques et chimiques spécifiques [22]. Le graphène fonctionnalisé et ses dérivés ont de nombreuses fonctions telles que la charge médicamenteuse [23], antibactérien [24], la bio-imagerie [25, 26] et le traitement du cancer [27].

Sur l'aspect de la capacité antimicrobienne, Li et al. ont révélé que le mécanisme antimicrobien de G est principalement causé par le transfert de charge [28] et la migration bactérienne. Bactéries transférées à la surface de nanofeuillets tranchants, ce qui lacère les bactéries par les bords tranchants [29]. De plus, Tu et al. a également démontré un autre mécanisme antimicrobien potentiel que G peut pénétrer dans les cellules, conduisant à l'extraction de grandes quantités de phospholipides des membranes cellulaires [30]. Ainsi, le G et l'oxyde de graphène (GO) ont une bioactivité et une capacité antimicrobienne, qui répondent aux exigences pour être qualifiés de matériaux de réparation osseuse.

Cependant, avec une production et une application à grande échelle, les problèmes de biosécurité du graphène sont particulièrement importants. Les travailleurs peuvent souffrir d'une exposition aux nanoparticules (NP) par le biais de multiples médiums, notamment l'inhalation, le contact cutané et les voies gastro-entériques. Andrea Prodi et al. ont suggéré une approche par étapes pour évaluer l'exposition aux NP pour une protection supplémentaire [31]. Hormis l'évaluation, la biosécurité et la biocompatibilité sont d'autres points clés de la recherche. Kan Wang et al. ont démontré la biocompatibilité de GO, qui présente une toxicité pour les cellules fibroblastiques humaines lorsque la dose est inférieure à 20 g/ml mais présente une cytotoxicité évidente lorsque la dose est supérieure à 50 g/ml, avec une diminution significative de l'adhésion cellulaire [32]. À l'heure actuelle, une vue plus cohérente confirme que G et GO ont un effet toxique sur les bactéries mais en contradiction avec un effet toxique sur les cellules [33,34,35,36]. La fonction et la toxicité de G et GO nécessitent encore une étude plus spécifique. Béatriz Pelaz et al. a soulevé une question, "comment réduire les risques et augmenter les avantages sont essentiels pour le développement de nanomédicaments sûrs et efficaces", qui rappelle et exhorte l'étude vers la combinaison des risques potentiels de G et GO et de la capacité antibactérienne in vivo et in vitro [12] .

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) sont des cellules souches adultes multipotentes. Ils sont devenus une source cellulaire importante pour la réparation des défauts osseux en ingénierie tissulaire [37, 38]. De plus, l'interaction entre le graphène et ses dérivés et les cellules souches manque encore de recherche [39, 40].

Par conséquent, cette étude a recherché l'effet de G et GO sur les tissus musculaires de souris BMSC in vitro, Staphylococcus aureus , visant à étudier la cytotoxicité et la capacité antibactérienne de G et GO in vivo et in vitro et à promouvoir la recherche sur la nanomédecine et la nanotoxicité des nanomatériaux de carbone.

Résultats

Cytotoxicité G et GO

G et GO Cytotoxicité in vitro

Au microscope électronique, les nanoparticules G ou GO ont montré une forme irrégulière avec une taille de 30,41 ± 5,59 nm, et une agglomération de particules a pu être trouvée (Fig. 1a, b). Après 7 jours de culture, la morphologie de la cellule a été modifiée en forme de fuseau (Fig. 1c). Des nodules de calcium se sont formés après culture avec un milieu de différenciation ostéogénique (Fig. 1d). L'accumulation d'huile s'est formée après différenciation adipogène (Fig. 1e).

Cytotoxicité G et GO (a , b). Images TEM de G (a ) et GO (b ) a montré le nano-réseau formé. c Cytomorphologie des BMSC. d Rouge alizarine pour les dépôts de calcium. e Huile rouge O pour lipide. f Activité cellulaire après traitement G et GO, *P <0,01 avec groupe témoin, ^# P <0,01 avec groupe témoin, ^○ P <0,05 avec groupe G 50 g/ml, ^{☆, □, △} P <0,01 avec la même concentration de groupe G. r 2 (G) =0,843, r 2 (ALLER) =0,939. Barres d'échelle a , b 200 nm, c , d 100 m, e 50 µm. r , coefficient de corrélation

Lorsque la concentration était supérieure à 10 g/ml, G ou GO inhibait la croissance des BMSC. La cytotoxicité était la plus élevée dans le groupe 1000 g/ml et a montré la manière dose-dépendante. Lorsque la concentration était supérieure à 10 g/ml, la cytotoxicité du groupe GO était supérieure à celle du groupe G à la même concentration. La différence était plus significative avec l'augmentation de la concentration (Fig. 1f).

Sous l'observation du SEM, lorsque la concentration de G ou GO était de 10 g/ml, les BMSC étaient en bon état avec une bonne adhérence et une bonne forme. Lorsque la concentration de G était supérieure à 50 g/ml, les cellules se sont avérées changer, y compris une diminution de la taille, une augmentation de la sécrétion de surface et une extension des microvillosités à la surface cellulaire. Lorsque la concentration de GO était supérieure à 50 g/ml, les BMSC se sont avérées rétrécies et déformées et la plupart des cellules étaient mortes. Ces résultats ont indiqué que GO avait une cytotoxicité plus élevée pour les BMSC par rapport à G sous la même concentration (Fig. 2).

Images SEM de co-culture de G, GO et BMSC. un Groupe G, 10 µg/ml. Les cellules sont en bon état. b Groupe G, 50 µg/ml. La taille des cellules diminue, la sécrétion de surface augmente et les microvillosités à la surface des cellules deviennent longues. c Groupe GO, 50 g/ml. Les BMSC rétrécissent et se déforment. G graphène, GO oxyde de graphène, B BMSCs

Sous l'observation du MET, nous avons découvert que G ou GO pouvaient pénétrer dans les BMSC et se déposer à l'intérieur de la cellule. Et lorsque la concentration était supérieure à 50 g/ml, des modifications du microenvironnement cellulaire, notamment un trouble de la structure cellulaire et des microvillosités, ont été trouvées, indiquant la cytotoxicité plus élevée de GO par rapport au groupe G (Fig. 3).

Images MET de co-culture de G, GO et BMSC. un groupe G. b Groupe GO. G et GO peuvent tous deux entraîner un trouble de la structure cellulaire et des microvillosités à la surface de la cellule ; GO provoque des modifications du microenvironnement cellulaire à cytotoxicité élevée

Sur la base du résultat de l'observation SEM et MET, nous avons constaté que 10 g/ml était la concentration critique de sécurité pour G et GO. Lorsque la concentration de GO était supérieure à 10 g/ml, GO avait une cytotoxicité plus élevée pour les BMSC par rapport à G.

G et GO Cytotoxicité In Vivo

Pour analyser la cytotoxicité G et GO in vivo, nous sélectionnons le tissu squelettique pour représenter et simuler la circonstance de transplantation locale en orthopédie. Le résultat de la coloration HE du tissu squelettique dans le groupe témoin et le groupe G a présenté la structure normale avec des myofibrilles musculaires parallèles à l'axe vertical. En coupe transversale, la section myofibrillaire présentée comme des taches minces et le noyau était situé au bord des cellules. Les changements mentionnés ci-dessus pourraient également être trouvés dans les cellules squelettiques normales, indiquant que G a peu de toxicité vis-à-vis des tissus musculaires.

Au contraire, dans le groupe GO, les lignes transversales des fibres musculaires en coupe longitudinale étaient fracturées et peu nettes, révélant l'atrophie et la nécrose du muscle. Ainsi, GO avait une toxicité plus élevée pour les animaux (Fig. 4).

Coupes de tissus colorées avec une coloration HE. un Le témoin représente le tissu non lésé. b groupe G. Cellules squelettiques présentes sous forme de bande droite. Les myofibrilles musculaires sont parallèles le long du grand axe, les lignes transversales sont claires et la section transversale est constituée de blocs irréguliers. La section myofibrillaire se présente sous la forme de taches minces ; le noyau est situé au bord. c Groupe GO. Les lignes transversales des fibres musculaires en coupe longitudinale sont fracturées et floues

Propriétés antibactériennes G et GO

Capacité antibactérienne in vitro

Dans l'expérience de bactériostase in vitro, l'intensité photonique du ROI de G ou GO a montré une manière dose-dépendante. Et l'intensité des photons diminuait parallèlement à l'augmentation de la concentration. Par rapport au groupe G à la même concentration, le groupe GO avait une intensité photonique plus faible (Fig. 5).

Surveillance de l'intensité de la bioluminescence de S . aureus in vitro. G et GO montrent une manière dose-dépendante de la capacité antibactérienne in vitro. un Bioluminescence du Xen-29 imagée in vitro après 0, 8 et 24 h d'incubation à 37 °C, avec des variations de couleur représentant l'intensité lumineuse (Bin M(8), FOV12, f1, 15 s). b PI =0 h, r 2 (GO-0h) =0,924. c PI =8 h, r 2 (G-8 h) =0,584, r 2 (GO-8h) =0,960. d PI =24 h, r 2 (G-24 h) =0,616, r 2 (GO-24h) =0.943.*P <0,01 avec groupe témoin, ^# P <0,01 avec groupe témoin, ^{☆, □, △, ○} P <0,01 avec la même concentration de groupe G. r , coefficient de corrélation

À 0, 8 et 24 h, lorsque les concentrations de G étaient de 100, 500 et 1000 g/ml, G a montré la capacité d'inhibition de la croissance du Xen-29 par rapport au groupe témoin. Cependant, l'intensité des photons dans les groupes 10 et 50 g/ml n'a montré aucune différence significative par rapport au groupe témoin.

Lorsque les concentrations de GO étaient de 50, 100, 500 et 1000 μg/ml, à 0, 8 et 24 h, GO a montré l'effet d'inhibition de la croissance vis-à-vis du Xen-29. De même, l'intensité des photons dans les groupes de 10 et 50 μg/ml n'a montré aucune différence statistiquement significative par rapport au groupe témoin.

Les résultats ont montré que le G présentait la capacité antibactérienne avec une concentration supérieure à 100 g/ml, et GO présentait la capacité antibactérienne avec une concentration supérieure à 50 g/ml. La capacité antibactérienne de G ou GO était dose-dépendante. GO avait une capacité antibactérienne plus forte que G à la même concentration.

Capacité antibactérienne in vivo

Dans l'expérience de bactériostase in vivo, le groupe GO a montré une valeur d'intensité photonique (IP) significativement plus faible à 0 et 24 h. La valeur PI était diminuée par rapport au groupe G et au groupe témoin. Cependant, la valeur IP du groupe G n'était pas statistiquement significativement différente par rapport au groupe témoin (Fig. 6). Les résultats ont montré que GO a montré une forte capacité antibactérienne mais G n'a montré aucune capacité antibactérienne évidente in vivo à la concentration de 100 μg/ml.

Surveillance de l'intensité de la bioluminescence de S . aureus in vivo. GO montre une manière dose-dépendante de la capacité antibactérienne in vivo. un Bioluminescence du Xen-29 imagée in vivo après 0 et 24 h d'incubation, avec des variations de couleur représentant l'intensité lumineuse (Bin M(8), FOV12, f1, 60 s). b PI =0 h, ^# P <0,01 avec groupe témoin. c PI =24 h, ^# P <0,01 avec groupe témoin

Discussion

Avec le développement de l'ingénierie tissulaire, de plus en plus d'applications de biomatériaux sont utilisées dans le domaine du traitement orthopédique [41]. Une bonne biosécurité est nécessaire pour les biomatériaux. G et GO ont été largement utilisés dans le domaine médical pour leur sécurité et leurs propriétés physiques et chimiques uniques. Du point de vue de la capacité antibactérienne, G et GO sont les bonnes substances antibactériennes. Les principaux mécanismes antibactériens sont le transfert de charge [28, 29] et la pénétration dans les cellules [30]. Ainsi, la capacité antibactérienne de G et GO pourrait répondre aux exigences des matériaux de réparation osseuse en deçà des plages de sécurité.

Dans cette étude, pour identifier les propriétés de biosécurité, nous avons observé l'effet cytotoxique de G et GO envers les BMSC par SEM et TEM, et cet effet s'est présenté de manière dose-dépendante. De plus, GO avait un effet cytotoxique plus élevé. En ce qui concerne les propriétés antibactériennes, nous avons en outre observé que G et GO avaient des propriétés antibactériennes de manière dose-dépendante et que l'effet GO était significativement meilleur que G in vivo. En conclusion, la concentration comprise entre 50 et 100 g/ml peut être préférable pour maintenir l'équilibre entre un effet cytotoxique mineur et une capacité antibactérienne majeure.

Cette recherche a démontré que G et GO présentent tous deux un effet cytotoxique vis-à-vis des BMSC et des cellules squelettiques et que la toxicité de GO est supérieure à G. Un grand nombre d'études ont démontré la toxicité des nano-cellules G et ses propriétés physiques et chimiques du matériau (telles que taille, forme et groupes fonctionnels de surface) vers les cellules [35, 42, 43]. En outre, les chercheurs ont découvert que le G vierge peut induire une cytotoxicité par l'épuisement du potentiel membranaire mitochondrial (MMP) et l'augmentation des espèces réactives de l'oxygène intracellulaires (ROS) [12], déclenchant ainsi l'apoptose par activation de la voie mitochondriale [34, 44] . Mais le phénomène selon lequel la cytotoxicité de GO est supérieure à G peut être associé aux groupes contenus à la surface de GO [45]. Les chercheurs ont découvert que la cytotoxicité de GO est directement liée à la teneur en sérum. Hu W et al. ont démontré que GO a une forte capacité d'adsorption qui pourrait adsorber les protéines sériques pour former des inclusions protéiques [46], démontrant la base cytotoxique plus élevée de GO par rapport à G. Nos expériences ont confirmé les conclusions mentionnées ci-dessus. En outre, la toxicité animale est un autre indicateur important de l'évaluation de la sécurité biologique de G et GO. Dans cette étude, une réponse pathologique grave dans les tissus musculaires a été trouvée dans le groupe GO, indiquant sa toxicité plus élevée par rapport au groupe G.

Deuxièmement, les propriétés antibactériennes sont conformes aux changements de dose de G et GO ; Une concentration de 50 à 100 g/ml de GO pourrait mieux équilibrer la toxicité biologique et la capacité antibactérienne. Nos études ont démontré que la toxicité biologique et la capacité antibactérienne se présentent de manière dose-dépendante. Par conséquent, une certaine plage de concentration peut maintenir l'équilibre entre une toxicité biologique mineure et une capacité antibactérienne majeure.

Les résultats ont montré que G et GO présentaient une certaine toxicité biologique envers les BMSC et les tissus musculaires, mais dans le groupe GO, la capacité antibactérienne était significative in vivo. Sur la base des résultats précédents de la toxicité G et GO, nous avons constaté que la concentration de 50 ~ 100 g/ml peut être la meilleure pour maintenir l'équilibre entre la toxicité biologique mineure et la capacité antibactérienne majeure, fournissant ainsi de nouvelles preuves en matière de biosécurité et d'antibactérien. capacité de G et GO in vivo et in vitro dans le travail clinique.

Bien que GO ait beaucoup d'effet toxique, la toxicité peut être évitée par des modifications de GO [47, 48]. Dans le même temps, les matériaux GO modifiés peuvent être dégradés et éliminés dans le corps [49] ; ainsi, une nouvelle direction de recherche de la modification pour GO est encouragée. De plus, les effets de G et GO sur d'autres organes ou tissus importants nécessitent encore des recherches supplémentaires pour atteindre la médecine holistique. Pendant ce temps, la question de savoir si GO cause des dommages causés par le stress oxydatif aux bactéries et la présence d'un mécanisme antibactérien supplémentaire nécessite une étude plus approfondie. Avant l'application à l'ingénierie tissulaire, les mécanismes de la toxicité G et GO et les moyens modifiés pour réduire la toxicité nécessitent encore plus de clarification.

Méthodes

Animaux

Des rats mâles Sprague-Dawley (SD) et des souris mâles Balb/C ont été achetés auprès de l'Institut Pasteur d'Iran et maintenus dans des conditions de lumière/obscurité de 12 h à 25 °C. Des rats SD âgés de 4 semaines ont été utilisés pour l'isolement des BMSC. Des souris Balb/C ont été utilisées pour des expérimentations animales in vivo. Tous les animaux ont été élevés dans le centre des animaux de laboratoire de la quatrième université de médecine militaire et les opérations étaient conformes aux normes de chirurgie expérimentale animale de l'hôpital de Xijing. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de la quatrième université de médecine militaire.

Graphène et oxyde de graphène

G ou GO (couches 1–2) (Hengqiu Graphene Technology, Chine) a été respectivement ajouté dans de l'éthanol absolu (utilisé pour le test au microscope électronique à transmission, TEM), du tampon PBS (utilisé pour les expériences cellulaires in vitro) et une solution saline (utilisée pour expérimentations animales in vivo) pour préparer la solution G ou GO (le résultat du test de spectroscopie Raman a été fourni par Hengqiu Graphene Technology). La concentration initiale de la solution G ou GO était de 1 mg/ml. La solution G ou GO a été dispersée à l'aide d'ultrasons 2 h avant les expériences.

Cytotoxicité

Culture cellulaire

Le milieu de culture cellulaire contenait 10 % de sérum bovin fœtal (Gibco, Carlsbad, Californie, États-Unis), DMEM/F12 (Corning, NY, États-Unis), 100 U/ml de pénicilline et 100 U/ml de streptomycine (Sigma, St. Louis, Missouri, États-Unis). Les BMSC ont été extraites des rats mâles de 4 semaines par la méthode de la culture de moelle osseuse [50]. Après l'exécution du rat, le fémur et le tibia ont été retirés dans des conditions aseptiques. La cavité médullaire a été lavée avec du milieu de culture cellulaire; ensuite, le mélange a été centrifugé à 1500 tr/min pendant 10 min pour recueillir la moelle osseuse. La moelle osseuse a été remise en suspension avec du milieu de culture cellulaire et inoculée dans des flacons de culture cellulaire recouverts de gélatine à 37 °C et dans un incubateur cellulaire à 5 % de dioxyde de carbone. Le milieu dans les flacons de culture cellulaire a été changé après 48 h et les cellules non adhérentes ont été retirées ; ensuite, le milieu de culture a été changé une fois toutes les 48 h. Des cellules du troisième au cinquième passage ont été utilisées pour les expériences suivantes.

La différenciation ostéogénique et la différenciation adipogène sur BMSC ont été réalisées avec du milieu de différenciation (Cyagen, CA, USA). Après 2 semaines d'induction de différenciation, les cellules ont été fixées avec une solution de formaldéhyde à 4 % pendant 30 min; puis, une coloration au rouge alizarine pour la différenciation ostéogénique et une coloration rouge à l'huile pour la différenciation adipeuse ont été réalisées.

Activité de la cellule

La concentration de la suspension BMSC a été ajustée à 5 × l0 ⁴ /l et les cellules ont été cultivées dans une plaque à 96 trous avec 100 l dans chaque trou. Après 24 h, le milieu a été remplacé par du milieu de culture cellulaire contenant G ou GO avec les concentrations de 0 (comme groupe témoin), 10, 50, 100, 500 et 1000 g/ml. Après 24 h de culture, 10 ul d'alamarBlue (Bio-rad, Hercules, CA, USA) ont été ajoutés dans chaque trou pour 4 h de culture supplémentaires. Une microplaque (Bio-rad, Hercules, CA, USA) a été utilisée pour détecter les valeurs de DO (densité optique) à 570 et 600 nm, puis le calculateur colorimétrique alamarBlue® (Bio-rad, Hercules, California, USA) a été utilisé pour évaluer le taux de prolifération cellulaire.

Caractérisation à l'aide de SEM

Les BMSC ont été ensemencées dans une plaque de verre mince à 24 trous avec une épaisseur de 0,17 mm et un diamètre de 14 mm. Après 24 h de culture, le milieu a été remplacé par du milieu de culture cellulaire contenant G ou GO avec les concentrations de 0 (comme groupe témoin), 10, 50, 100, 500 et 1000 g/ml. Les cellules ont été poursuivies en culture pendant 24 h et le surnageant a été retiré par la suite. Les cellules ont été fixées avec une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 24 h. Ensuite, les cellules ont été observées au microscope électronique à balayage (Hitachi S-4800 SEM, JPN) après déshydratation et dorure.

Caractérisation à l'aide de TEM

Les suspensions G et GO ont été ajustées à 50 µg/ml. Les cellules ont été co-cultivées avec G ou GO pendant 24 h puis digérées par 0,25% de trypsine. Le surnageant a été éliminé après centrifugation à 1000 tr/min pendant 10 min. Les cellules ont été fixées avec une solution de glutaraldéhyde à 2,5% pendant 24 h et des coupes ont été observées par microscopie électronique à transmission (FEI Tecnai G2 TEM, USA).

Toxicité et identification du tissu musculaire

Pour analyser la cytotoxicité G et GO in vivo, nous sélectionnons le tissu squelettique pour représenter et simuler la circonstance de transplantation locale en orthopédie. G ou GO ont été respectivement injectés dans les tissus musculaires fémoraux médians de souris Balb/C. Les souris ont été tuées après 7 jours et les tissus musculaires injectés avec G ou GO ont été fixés avec une solution de formaldéhyde neutre à 10 % pendant 24 h. Après déshydratation à l'alcool, le tissu a été enveloppé dans de la paraffine et tranché pour effectuer une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE). Les tranches ont été observées au microscope inversé (microscope inversé Leica DMI6000B, RBT).

Capacité antibactérienne

Culture bactérienne

Nous avons sélectionné le Xen-29 à cultiver pour sa réaction luminescente. Xen-29 était une bactérie bioluminescente de Staphylococcus aureus (Caliper, LS, USA) dérivé de l'ATCC-12600. Les bactéries ont été cultivées dans du milieu Luria Bertani (LB, Sigma, St. Louis, MO, USA) contenant 200 g/ml de kanamycine (Sigma, St. Louis, MO, USA) à 37°C. Une seule colonie a été prélevée dans du bouillon LB à 37 °C sous agitation pendant 2 à 3 h à la vitesse de 200 tr/min. Lorsque l'absorbance à 600 nm a atteint 0,5 (environ équivalent à 1,44 × 108 cfu/ml) par rapport à l'absorbance dans le blanc de bouillon LB, les bactéries ont été utilisées pour l'expérience suivante.

Imagerie bioluminescente

Pour présenter l'imagerie bioluminescente, nous avons utilisé le système d'imagerie macroscopique optique CCD refroidi IVIS Lumina II (Caliper, LS, USA). Le signal bioluminescent bactérien a été converti en intensité photonique (IP). Le logiciel Living Image® 4.2 (Caliper, LS, USA) a été utilisé pour la quantification de l'IP dans les régions d'intérêt (ROI). Afin d'empêcher le mouvement des souris dans le processus d'imagerie, les souris ont été anesthésiées pour éviter l'instabilité du signal reçu.

Capacité antibactérienne in vitro

Xen-29 a été ajouté dans la plaque à 24 trous et la concentration dans chaque trou était de 10 ⁷ ufc. Ensuite, une suspension G ou GO a été ajoutée pour ajuster la concentration à 0 (témoin), 10, 50, 100, 500 et 1000 g/ml. Le volume constant dans chaque trou était de 500 ul. Pour analyser la capacité antibactérienne de G et GO, le PI bactérien dans le ROI a été mesuré séquentiellement à 0, 8 et 24 h après l'intervention.

Capacité antibactérienne in vivo

Sur la base des résultats de l'expérience ci-dessus, un groupe de 100 ug/ml a été choisi pour identifier la capacité antibactérienne. Une suspension de Xen-29 (200 l) a été injectée dans les tissus musculaires fémoraux médians de souris Balb/C. PI de ROI a été détecté sur 0 et 24 h après l'opération.

Analyse des données

Toutes les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD). t de l'étudiant test a été utilisé pour la comparaison entre G et GO avec la même concentration. Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été utilisée pour comparer les différences entre G et GO avec des concentrations différentes respectivement. P <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Conclusions

En conclusion, G et GO ont un certain effet cytotoxique biologique de manière dose-dépendante. G et GO ont des propriétés antibactériennes et fonctionnent également de manière dose-dépendante ; les propriétés antibactériennes de GO sont nettement meilleures que celles de G in vivo. La concentration de 50 ~ 100 g/ml peut être meilleure pour maintenir l'équilibre entre la toxicité biologique mineure et la capacité antibactérienne majeure. De plus, les modifications de GO pour réduire la toxicité doivent être clarifiées pour contribuer aux applications G et GO en nanomédecine.

Abréviations

BMSC :

Cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse

G :

Graphène

GO :

Oxyde de graphène

LUI :

Hématoxyline et éosine

LB :

Luria Bertani moyen

NP :

Nanoparticules

IP :

Intensité des photons

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SEM :

Microscope électronique à balayage

TEM :

Microscopie électronique à transmission