Évaluation de la biosécurité et de l'efficacité antibactérienne du graphène et de l'oxyde de graphène pour applications d'implants orthopédiques

Résumé

Les nanoparticules de graphène (G) et d'oxyde de graphène (GO) sont émergentes comme modificateurs prometteurs pour les surfaces d'implants orthopédiques, pourtant leurs profils de sécurité et antimicrobiens restent incomplètement définis. Nous avons évalué la cytotoxicité in vitro sur des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse (CSMOs) et la biocompatibilité in vivo par implantation intramusculaire chez la souris. Les résultats ont identifié 10 µg/mL comme seuil en dessous duquel G et GO exhibent une cytotoxicité minimale. Les concentrations au-dessus de cette valeur ont induit une mort cellulaire dose-dépendante, le GO se montrant plus toxique que le G. Les essais antimicrobiens contre Staphylococcus aureus ont révélé que G n'inhibe la croissance bactérienne qu'à ≥100 µg/mL, tandis que GO montre une activité antibactérienne significative à ≥50 µg/mL. La gamme 50–100 µg/mL semble optimale, équilibrant faible cytotoxicité et efficacité antibactérienne robuste, soutenant la traduction clinique dans cette fenêtre de dosage.

Contexte

Les implants orthopédiques doivent combiner une excellente biosécurité avec un contrôle efficace des infections, particulièrement contre S. aureus, le pathogène le plus fréquent dans les infections liées aux implants. Les thérapies conventionnelles échouent souvent, conduisant à une guérison prolongée ou à l'amputation. La nanotechnologie offre de nouvelles voies ; le graphène et ses dérivés, avec leur réseau de carbone bidimensionnel, possèdent des propriétés mécaniques, électriques et chimiques uniques qui peuvent être exploitées pour la régénération osseuse et l'action antibactérienne.

Les bords tranchants du graphène peuvent physiquement perturber les membranes bactériennes, tandis que les mécanismes de transfert de charge inhibent davantage la prolifération bactérienne. Le GO, fonctionnalisé avec des groupes oxygène, améliore la dispersion et peut servir de vecteur de médicament, agent d'imagerie ou surface antimicrobienne. Cependant, la même nanostructure qui confère des avantages thérapeutiques peut aussi provoquer une toxicité cellulaire, surtout à doses plus élevées ou en raison de la formation de couronne protéique.

Des études antérieures ont rapporté des seuils cytotoxiques contradictoires pour G et GO. Alors que certaines données suggèrent que G est relativement bénin, GO affiche souvent une toxicité plus élevée envers les cellules mammifères, potentiellement due à sa chimie de surface. Clarifier ces relations dose-réponse est essentiel pour un déploiement clinique sûr.

Résultats

Cytotoxicité In Vitro de G et GO

La microscopie électronique à transmission a révélé des flocons irréguliers de G et GO moyennant 30 ± 5,6 nm, avec des agglomérats occasionnels (Figure 1a–b). Après 7 jours de co-culture, les CSMOs maintenaient une morphologie fusiforme ; la différenciation ostéogénique et adipogénique confirmait la multipotence (Figure 1c–e).

La viabilité cellulaire a décliné de manière dose-dépendante une fois que les concentrations ont dépassé 10 µg/mL. GO exhibait une cytotoxicité plus grande que G à doses égales, avec l'écart se creusant à concentrations plus élevées (Figure 1f). La microscopie électronique à balayage a corroboré ces résultats : à 10 µg/mL, les CSMOs adhérent et s'étendent normalement ; à 50 µg/mL G, les cellules rétrécissent et affichent une sécrétion de surface accrue ; à 50 µg/mL GO, les cellules sont marquant déformées et largement non viables (Figure 2).

La microscopie électronique à transmission a confirmé l'internalisation de tanto G que GO. À concentrations au-dessus de 50 µg/mL, GO a induit une perturbation intracellulaire prononcée, incluant organelles désordonnées et perte de microvillosités (Figure 3).

Collectivement, 10 µg/mL a été identifié comme le seuil de sécurité critique ; GO affichait une toxicité cellulaire plus élevée au-delà de ce niveau.

Cytotoxicité In Vivo

Le tissu musculaire implanté avec G a préservé une architecture normale, avec des myofibrilles parallèles et des noyaux intacts (Figure 4a–b). En contraste, le tissu traité avec GO exhibait des lignes transversales fracturées et des signes d'atrophie et de nécrose, indiquant une toxicité in vivo plus élevée (Figure 4c).

Propriétés Antibactériennes

In Vitro

L'imagerie bioluminescente de Staphylococcus aureus (Xen-29) a démontré une inhibition dose-dépendante par tanto G que GO. G nécessitait ≥100 µg/mL pour une réduction significative ; GO atteignait l'inhibition à ≥50 µg/mL. Les courbes d'intensité photonique (IP) confirmaient une action antibactérienne plus forte de GO (Figure 5).

In Vivo

Dans le muscle de souris, GO à 100 µg/mL a produit une IP marquant plus basse à la fois à 0 et 24 h, alors que G ne différait pas significativement du témoin (Figure 6). Ainsi, GO a conservé une efficacité antibactérienne robuste in vivo, tandis que l'effet de G était négligeable à cette dose.

Discussion

L'étude confirme que tanto G que GO exhibent une cytotoxicité dose-dépendante envers les CSMOs et le muscle squelettique, GO étant constamment plus toxique. L'activité antibactérienne suit également une réponse dose, GO surperformant G dans les deux configurations in vitro et in vivo. La fenêtre 50–100 µg/mL semble équilibrer une cytotoxicité minimale avec une action antibactérienne significative, en faisant une plage cible prometteuse pour la modification de surface d'implants.

Des aperçus mécanistiques suggèrent que les bords tranchants de G et ses propriétés de transfert de charge perturbent les membranes bactériennes, tandis que les groupes oxygène de surface de GO facilitent des interactions plus fortes avec les cellules microbiennes et induisent possiblement la production d'espèces réactives de l'oxygène. La toxicité mammifère plus élevée de GO peut provenir de la formation de couronne protéique et du stress oxydatif, soulignant le besoin de modifications de surface qui atténuent les effets indésirables sans compromettre la fonction antimicrobienne.

Les travaux futurs devraient explorer la fonctionnalisation de GO pour réduire la cytotoxicité, évaluer la biodégradation à long terme, et évaluer les effets sur d'autres tissus. Comprendre l'interaction entre attributs physicochimiques et réponses biologiques sera crucial pour faire avancer les nanomédecines basées sur G et GO.

Méthodes

Animaux

Des rats Sprague-Dawley mâles (4 semaines) fournissaient les CSMOs ; des souris Balb/C mâles étaient utilisées pour les études d'implantation. Toutes les procédures étaient conformes aux directives institutionnelles de soins aux animaux.

Préparation du Graphène et de l'Oxyde de Graphène

G et GO du commerce (1–2 couches) étaient dispersés dans l'éthanol, PBS ou salin, puis ultrasoniqués pendant 2 h pour atteindre une solution mère de 1 mg/mL.

Culture Cellulaire et Essais de Cytotoxicité

Les CSMOs étaient étendues aux passages 3–5, puis exposées à 0, 10, 50, 100, 500 ou 1000 µg/mL de G ou GO pendant 24 h. Des essais AlamarBlue® quantifiaient l'activité métabolique ; MEB et MET fournissaient des aperçus morphologiques.

Implantation In Vivo

G ou GO (10 µg/mL) était injecté dans le muscle fémoral médial de souris ; les tissus étaient récoltés après 7 jours pour coloration HE.

Tests Antibactériens

S. aureus bioluminescent (Xen-29) était cultivé à 10⁷ UFC/mL et co-traité avec G ou GO aux mêmes gammes de concentration. L'intensité photonique était enregistrée à 0, 8 et 24 h (in vitro) et à 0 et 24 h (in vivo) en utilisant le système IVIS Lumina II.

Analyse des Données

Les résultats sont exprimés comme moyenne ± ET. Test t de Student et ANOVA à un facteur évaluaient la significativité statistique ; p < 0,05 était considéré significatif.

Conclusions

Le graphène et l'oxyde de graphène démontrent tous deux une cytotoxicité et des effets antibactériens dose-dépendants. La puissance antibactérienne supérieure de GO à 50–100 µg/mL, couplée à une toxicité gérable, le positionne comme un candidat fort pour les revêtements d'implants orthopédiques, à condition que des modifications de surface puissent réduire davantage les réponses cellulaires indésirables.